用于檢測kcnk3基因突變的引物組、該引物組的用途及包含該引物組的試劑盒的制作方法【專利摘要】本發明公開了用于檢測KCNK3基因突變的引物組，包括KCNK3基因第1至第2外顯子區、3’UTR和啟動子對應的PCR擴增引物組和PCR測序引物。本發明還公開了所述引物組的用途、以及包含所述引物組的試劑盒。所述的引物組可以專一性鑒別KCNK3基因是否突變，確保了測定結果的準確性和唯一性。【專利說明】用于檢測KCNK3基因突變的引物組、該引物組的用途及包含該引物組的試劑盒
技術領域：
[0001]本發明涉及引物組，具體涉及用于檢測KCNK3基因突變的引物組。本發明還涉及該引物組的用途，以及包含該引物組的試劑盒。【
背景技術：
】[0002]KCNK3(potassiumchannel，subfamilyK,member3)，21kDa至24kDa的跨膜蛋白，參與構成細胞膜結構caveolae,其82-101氨基酸殘基區域稱為0&￥6〇1;[11-scaffoldingDomain(S⑶），是與其他多種分子相互作用的結構基礎。KCNK3廣泛分布于機體終末分化細胞或靜止細胞中。不僅能參與對信號轉導的調節，抑制細胞生長和轉化，還參與小泡運輸(包括胞吞作用、胞飲作用和跨胞作用）和膽固醇穩態的維持。它突變能引起遺傳性肺動脈高壓（heritablepulmonaryarterialhypertension，PAH)0[0003]肺動脈高壓是各種原因引起的靜息狀態下右心導管測得的肺動脈平均壓(meanpulmonaryarterialpressure，mPAP)^25mmHg的一組臨床病理生理綜合征。肺動脈高壓可以作為一種疾病而獨立存在，更常見的是很多疾病進展到一定階段的病理生理表現。由于肺血管重塑引起肺循環血流動力學改變，最終可導致右心衰竭，甚至死亡。這是一種極度惡性的疾病，七成多患者是年輕人，幾乎每個人都知道癌癥預后差，但沒有人知道肺動脈高壓室一種極度惡性疾病，它的病因復雜、發病率高、誤診率高、危害性強，其愈后是災難性的，可以說，這種病就是心血管疾病中的癌癥。這種疾病平均發病年齡是36歲，75%患者集中于20~40歲年齡段，還有15%患者年齡在20歲以下，幾歲的孩子也會發病。世界上該病的發病率在1X10-5~1X10-6之間，其中約6%為可遺傳性的。2013年2月，在法國尼斯召開的第五界世界肺高血壓論壇中，在肺高壓診斷和指南中導致遺傳性肺動脈高壓相關基因增加了基因的突變。基因突變的肺動脈高壓患者大于占遺傳型肺動脈高壓的0.25%左右。遺傳性肺動脈高壓具有遺傳早現現象，即在世代傳遞過程中有發病年齡逐漸超前和病情逐代加劇的現象，且一旦發病，病情進展迅速，很難控制。[0004]采用DNA檢測尋找KCNK3基因是否突變有助于查清病因，識別家系中高風險的成員，以及未出生孩子的患病風險，這對提高人口素質，優生優育有重要的意義。對臨床上指導用藥，尋找病因，基因評估等具有重要的意義。目前，傳統上采用熒光定量PCR的方式檢測突變，這個方法局限性很大，它只能檢測已經知道的突變位點，并且一次熒光定量PCR只能檢測一個點的突變，且準確率不高。KCNK3基因突變對不同的人突變的位置和方式是不一樣的，用熒光定量PCR方法不能達到檢測的目的。【
發明內容】[0005]本發明的目的之一是提供一種用于檢測KCNK3基因突變的引物組。[0006]KCNK3基因的第1到第2外顯子區，3'UTR和啟動子中的任意一個區域在結構上發生堿基對組成或排列順序的改變，都視為KCNK3基因發生了突變。因而，根據KCNK3基因第1到第2外顯子區，3'UTR和啟動子序列分別設計出能專一性鑒別KCNK3基因是否突變的特異性弓丨物組。可通過PCR擴增和測序測定KCNK3基因上述區域是否發生改變，以鑒定KCNK3基因是否發生突變。因此，本發明的用于檢測KCNK3基因突變的引物組可以是KCNK3基因第1到第2外顯子區、3'UTR和啟動子分別對應的引物組中的一組或兩組以上的組合。[0007]本發明第一個目的提供的用于檢測KCNK3基因突變的引物組，包括KCNK3基因第1到第2外顯子區，3'UTR和啟動子中任一區域對應的PCR擴增引物組，即選自KCNK3基因第1到第2外顯子區、3'UTR和啟動子分別對應的PCR擴增引物組，具體地，所述引物組選自KCNK3基因的第1外顯子區(Exonl)的PCR擴增引物組、第2外顯子區(Exon2)的PCR擴增引物組、3'UTR的PCR擴增引物組和啟動子的PCR擴增引物組中的一組或兩組以上的組合，所述的上述各PCR擴增引物組為表1所示。[0008]本發明所述的引物組還包括KCNK3基因第1到第2外顯子區、3'UTR和啟動子分別對應的PCR測序引物組中的一組或兩組以上的組合。[0009]本發明所述的PCR測序引物組如表2所示。[0010]本發明的目的之二是提供使用上述PCR擴增引物組和PCR測序引物組在制備通過PCR擴增自生物樣品獲得核酸樣品檢測KCNK3基因是否突變的試劑中的用途。[0011]本發明的目的之三是提供一種用于檢測KCNK3基因突變的試劑盒，以方便采用DNA測序技術檢測導致PAH疾病的KCNK3基因是否突變。具體地，該用于檢測SMDA9基因突變的試劑盒，包括KCNK3基因的第1到第2外顯子區，3'UTR和啟動子分別對應的PCR擴增引物組中的一組或兩組以上的PCR擴增引物組，所述的各PCR擴增引物組為表1所示。[0012]本發明所述的試劑盒還包括如表2所示的KCNK3基因的第1到第2外顯子區，3'UTR和啟動子分別對應的PCR測序引物組中的一組或兩組以上的PCR測序引物組。[0013]本發明所述的試劑盒還包括常規PCR擴增試劑、PCR產物純化試劑和DNA測序試劑。[0014]所述的PCR擴增試劑包括dNTP、TaqDNA聚合酶等。[0015]所述的PCR產物純化試劑包括SAP酶、Exo頂每等。[0016]所述的DNA測序試劑包括BigDyemix、EDTA溶液和HIDI溶液等。[0017]本發明的有益效果：(1)本發明根據KCNK3基因的第1到第2外顯子區、3'UTR和啟動子，共4個區域序列設計特異性引物組，可以專一性鑒別KCNK3基因是否突變，確保了測定結果的準確性和唯一性。[0018](2)本發明提供的引物組及試劑盒用檢測PAH致病基因KCNK3基因的突變體，可以快速的檢測患者的基因是否突變，可以用于疾病診斷。同時還可以用于KCNK3SNP位點與基因功能之間關系的科學研究，以及兩種疾病關聯方面的研究。[0019](3)本發明擴增的方法簡單，不到兩個小時可以完成PCR擴增，每個引物擴增的條件類似，可以分別對4個區域進行擴增測序，可以同時進行擴增測序。因此，本發明的測序的方法檢測突變比通常熒光定量PCR的方法要更準確，同時檢測范圍更廣泛，測序范圍內的任何一個位置突變或插入堿基都能從測序圖譜中發現，而熒光定量PCR只能檢測目的位點的突變，局限性很大，且準確性不高。【附圖說明】[0020]圖1是血液基因組DNA的1%的Agarose電泳圖；M:DNADL15000maker，1、2:外周血基因組DNA。[0021]圖2是本發明實施例五中的血液樣本中的KCNK3基因的測序峰圖。【具體實施方式】[0022]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。[0023]實施例一依據NCBIGeneBank(NC-000012)公開的KCNK3的1~2個外顯子區、3'UTR和啟動子序列，設計出用于檢測KCNK3基因是否發生突變的引物組，該引物組包括以上各區域的PCR擴增引物組和PCR測序引物組，結果見表1和表2。[0024]實施例二一種用于檢測KCNK3基因突變的試劑盒，包括以下成分：KCNK3基因的第1到第2外顯子區、3'UTR和啟動子序列分別對應的PCR擴增引物組與PCR測序引物組，共13對，每條引物10D，各對引物序列參見表1和表2。[0025]本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復凍融。[0026]實施例三一種用于檢測KCNK3基因突變的試劑盒，包括以下成分：(1)KCNK3基因第1到第2外顯子區、3'UTR和啟動子序列分別對應的PCR擴增引物組與PCR測序引物組，共13對，每條引物10D，各對引物序列參見表1和表2。[0027](2)PCR擴增試劑：2.5mMdNTP混合液40μ1、5X擴增緩沖液（含Mg2+)100yl、5Units/ulTaqDNA聚合酶5μ1。[0028](3)PCR產物純化試劑：1U/ulSAP酶20yl、10U/ulΕχο頂每10μ1。[0029](4)PCR測序試劑：BigDye3.1mix50yl、EDTA溶液（0·125Μ)50μ1、無水乙醇lml、乙醇溶液（75%)1·5mL、HIDI溶液500μ1。[0030]本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復凍融。[0031]實施例四一人份檢測KCNK3基因突變的試劑盒的使用步驟：(1)取一份病人的血液lmL，提取血液基因組DNA，使用QIAampDNABloodMiniKit(250)Cat.no.51104提取基因組DNA，該基因組DNA為模板DNAd%Agarose凝膠電泳，結果見圖1。[0032](2)PCR擴增：13對引物共進行13個PCR反應，每個反應體系總體積為20ul，其中，模板DNA150ng2.5mMdNTP1μL上游引物（10μΜ)0.5μL下游引物（10μΜ)0.5μL5Χ擴增緩沖液（含Mg2+)4μLTaqDNA聚合酶（5U/μΙ)0.2μLddΗ2Οupto20μ1PCR循環的反應條件為：(3)PCR產物純化:共進行13個PCR純化反應，每個反應體系總體積20μL，包括PCR產物8μ1SAP酶（1U/μΙ)ΙμLExonucleses(10μΜ)ΙμLddΗ2Οupto10μ1〇[0033](4)DNA測序反應：共進行13個測序反應。每個反應的體系包括PCR純化產物1~2μ1BigDye3.1mix2μ1DNA測序引物(0·4μΜ)2μ1反應條件為：(5)反應結束后純化測序產物，即分別在每個反應體系加入ΙμL0.125Μ的EDTA和15μ1的乙醇，常溫放置15min，4°C1000g/min離心30min，小心倒去上清，加入75%乙醇溶液，4°C1000g/min離心15min，小心倒去上清;室溫放置20min。瞭干后在管中加入Hi-Di去離子甲酰胺1〇μ1，放入測序儀中。測序產物上ABI3130XL測序儀，測序文件用Polyphred軟件分析，并結合人工校對記錄后整理出結果。如果所得測序結果中，KCNK3基因第1到第2外顯子區、3'UTR和啟動子序列中任意一個區域的結構上發生堿基對組成或排列順序的改變，認為KCNK3基因發生了突變，反之則沒有發生突變。[0034]實驗結果：此樣本的KCNK3基因并未發生突變。[0035]實施例五與實施例四不同的是：(2)PCR擴增：13對引物共進行13個PCR反應，每個反應體系總體積為20ul，包含基因組DNA(10ngAU)lyl、dNTP混合液（2.5mMeach)lyl、5X擴增緩沖液（含Mg2+)4yl、上下游引物（ΙΟμΜ)各0.5μ1，TaqDNA聚合酶(5υ/μ1)0.2μ1，去離子水12.8μ1。反應條件為反應條件為:98°C反應5min;98°C反應15s，57°C反應40s，72°C反應lmins，共35個循環反應；最后72〇C延伸反應2min。[0036]測序結果如圖2所示，箭頭指出的位置有明顯雙峰，說明是此樣本在外顯子2的這個位點有突變，即突變堿基為c.482A>G氨基酸突變為p.Lysl07Glu。[0037]本發明的上述實施例都只能認為是對本發明的說明而不是限制，本發明的試劑盒還可以是KCNK3基因第1到第2外顯子區、3'UTR和啟動子分別對應的PCR擴增引物組中一組，每條引物10D;或者是上述引物組中的兩組以上的組合。[0038]本發明可用其他的不違背本發明的精神或主要特征的具體形式來概述。凡是依據本發明的實質技術對以上實施例所作的任何細微修改、等同變化與修飾，均屬于本發明技術方案的范圍內。【主權項】1.用于檢測KCNK3基因突變的引物組，其特征在于，包括KCNK3基因第1至第2外顯子區、3'UTR和啟動子對應的PCR擴增引物組，所述的PCR擴增引物組包括：(1)所述啟動子的PCR擴增引物組:包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物PFl和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列所示的引物PRl的引物組、SEQIDNO.3所示的核苷酸序列所示的引物PF2的引物組和SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的引物PR2的引物組、SEQIDNO.5所示的核苷酸序列的引物PF3的引物組和SEQIDNO.6所示的核苷酸序列的引物PR3的引物組、SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的引物PF4和SEQIDNO.8所示的核苷酸序列的引物PR4的引物組；(2)所述Exonl的PCR擴增引物組:包括SEQIDNO.9所示的核苷酸序列的引物PF5和SEQIDNO.IO所示的核苷酸序列的引物PR5的引物組；(3)所述Exon2的PCR擴增引物組：SEQIDNO.11所示的核苷酸序列的引物PF6和SEQIDNO.12所示的核苷酸序列的引物PR6的引物組、SEQIDNO.13所示的核苷酸序列的引物PF7和SEQIDNO.14所示的核苷酸序列的引物PR7的引物組、SEQIDNO.15所示的核苷酸序列的引物PF8和SEQIDNO.16所示的核苷酸序列的引物PR8的引物組；(4)所述3'UTR的PCR擴增引物組:包括SEQIDNO.17所示的核苷酸序列的引物PF9和SEQIDNO.18所示的核苷酸序列的引物PR9的引物組、SEQIDNO.19所示的核苷酸序列的引物PFlO和SEQIDNO.20所示的核苷酸序列的引物PRlO的引物組、SEQIDNO.21所示的核苷酸序列的引物PFll和SEQIDNO.22所示的核苷酸序列的引物PRll的引物組、SEQIDNO.23所示的核苷酸序列的引物PFl2和SEQIDNO.24所示的核苷酸序列的引物PRl2的引物組、SEQIDNO.25所示的核苷酸序列的引物PF13和SEQIDNO.26所示的核苷酸序列的引物PRl3的引物組。2.用于檢測KCNK3基因突變的引物組，其特征在于，還包括KCNK3基因第1至第2外顯子區、3'UTR和啟動子對應的PCR測序引物，所述的PCR測序引物包括：(5)所述啟動子的PCR測序引物包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物PFl、SEQIDNO.3所示的核苷酸序列所示的引物PF2、SEQIDNO.5所示的核苷酸序列的引物PF3和SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的引物PF4;(6)所述Exonl的PCR測序引物組包括SEQIDNO.9所示的核苷酸序列的引物PF5;(7)所述Exon2的PCR測序引物組包括SEQIDNO.11所示的核苷酸序列的引物PF6、SEQIDNO.13所示的核苷酸序列的引物PF7、SEQIDNO.15所示的核苷酸序列的引物PF8;(10)所述3'UTR的PCR測序引物組包括SEQIDNO.17所示的核苷酸序列的引物PF9、SEQIDNO.19所示的核苷酸序列的引物PF10、SEQIDNO.21所示的核苷酸序列的引物PF11、SEQIDNO.23所示的核苷酸序列的引物PF12和SEQIDNO.25所示的核苷酸序列的引物PFl3。3.權利要求1所述的KCNK3基因第1至第2外顯子區、3'UTR和啟動子對應的PCR擴增引物組在制備通過PCR擴增自生物樣品獲得核酸樣品檢測KCNK3基因是否突變的試劑中的用途。4.包含權利要求1的引物組的用于檢測KCNK3基因突變的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述的KCNK3基因第1至第2外顯子區、3'UTR和啟動子對應的PCR擴增引物組。5.根據權利要求4所述的用于檢測KCNK3基因突變的試劑盒，其特征在于，還包含權利要求2所述的KCNK3基因第1至第2外顯子區、3'UTR和啟動子對應的PCR測序引物。6.根據權利要求4或5所述的用于檢測KCNK3基因突變的試劑盒，其特征在于，還包括常規PCR擴增試劑、PCR產物純化試劑和DNA測序試劑。【文檔編號】C12N15/11GK105886636SQ201610306420【公開日】2016年8月24日【申請日】2016年5月11日【發明人】盧文菊,張晨婷,王健【申請人】廣州醫科大學附屬第醫院,廣州醫科大學附屬第一醫院