用于檢測bmpr1b基因突變的引物組、該引物組的用途及包含該引物組的試劑盒的制作方法

用于檢測bmpr1b基因突變的引物組、該引物組的用途及包含該引物組的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了用于檢測BMPR1B基因突變的引物組，包括BMPR1B基因第1至第10外顯子區、3’UTR、5’UTR和啟動子對應的PCR擴增引物組和PCR測序引物。本發明還公開了所述引物組的用途、以及包含所述引物組的試劑盒。所述的引物組可以專一性鑒別BMPR1B基因是否突變，確保了測定結果的準確性和唯一性。
【專利說明】
用于檢測BMPR1B基因突變的引物組、該引物組的用途及包含 該引物組的試劑盒
技術領域
[0001]本發明涉及引物，具體涉及用于檢測BMPR1B基因突變的引物組，本發明還涉及該 引物組的用途，以及包含該引物組的試劑盒。
【背景技術】
[0002] BMPRlB(bone morphogenetic protein receptor, type IB)屬于轉化生長因子β (TGF-β)受體超家族中的一員，為跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。TGF-β超家族的信號傳 導系統具有多種生物學的功能，包括細胞功能能調節和組織細胞分化等。
[0003] 肺動脈高壓是各種原因引起的靜息狀態下右心導管測得的肺動脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)^25mmHg的一組臨床病理生理綜合征。肺動脈高壓 可以作為一種疾病而獨立存在，更常見的是很多疾病進展到一定階段的病理生理表現。由 于肺血管重塑引起肺循環血流動力學改變，最終可導致右心衰竭，甚至死亡。這是一種極度 惡性的疾病，七成多患者是年輕人，幾乎每個人都知道癌癥愈后差，但沒有人知道肺動脈高 壓是一種極度惡性疾病，它的病因復雜、發病率高、誤診率高、危害性強，其愈后是災難性 的，可以說，這種病就是心血管疾病中的癌癥。這種疾病平均發病年齡是36歲，75%患者集中 于20-40歲年齡段，還有15%患者年齡在20歲以下，幾歲的孩子也會發病。世界上該病的發病 率在1 X 10_5~1 X 10_6之間，其中約32%為遺傳性的。BMPR1B作為細胞表面的受體之一如果 發生異常突變，可以導致其參與的下游的信號通路阻斷，導致肺血管壁的相關細胞增殖失 控，進而引起肺動脈高壓。因此，采用基因擴增、測序，檢測BMPR1B基因是否突變以及尋找突 變位點，有助于識別家系中高風險的成員，以及評估未出生孩子的患病風險，這對提高人口 素質，優生優育有重要的意義。并且對醫生指導用藥，基因評估具有重要的意義。目前，傳統 上采用熒光定量PCR的方式檢測突變，這個方法局限性很大，它只能檢測已經知道的突變位 點，并且一次熒光定量PCR只能檢測一個點的突變，且準確率不高。BMPR1B基因突變對不同 的人突變的位置和方式是不一樣的，用熒光定量PCR方法不能達到檢測的目的。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的之一是提供一種用于檢測BMPR1B基因突變的引物組。
[0005] BMPR1B基因第1到第10外顯子區、3'17^、5'17^和啟動子中的任意一個區域在結構 上發生堿基對組成或排列順序的改變，都視為BMPR1B基因發生了突變。因而，根據BMPR1B基 因第1至第10外顯子區、3'17^、5'17^和啟動子分別設計出能專一性鑒別810^18基因是否突 變的特異性引物組，可通過PCR擴增和測序測定BMPR1B基因上述區域是否發生改變，以鑒定 BMPR1B基因是否發生突變，因此，本發明的用于檢測BMPR1B基因突變的引物組可以是 BMPR1B基因第1至第10外顯子區、3'UTR、5'UTR和啟動子分別對應的引物組中的一組或兩組 以上的組合。
[0006] 本發明第一個目的提供的用于檢測BMPR1B基因突變的引物組，包括BMPR1B基因第 1到第10外顯子區，3 ' UTR、5 ' UTR和啟動子分別對應的PCR擴增引物組，即選自BMPR1B基因第 1到第10外顯子區、3 ' UTR、5 ' UTR和啟動子分別對應的PCR擴增引物組，具體地，所述引物組 選自BMPR1B基因的第1外顯子區(Exonl)的PCR擴增引物組、第2外顯子區(Exon2)的PCR擴增 引物組、第3外顯子區(Exon3)的PCR擴增引物組、第4外顯子區(Exon4)的PCR擴增引物組、第 5外顯子區(Exon5)的PCR擴增引物組、第6外顯子區（Exon6)的PCR擴增引物組、第7外顯子區 (Exon7)的PCR擴增引物組、第8外顯子區(Exon8)的PCR擴增引物組、第9外顯子區(Exon9)的 PCR擴增引物組、第10外顯子區（ExonlO)的PCR擴增引物組、3 ' UTR的PCR擴增引物組、5 ' UTR 的PCR擴增引物組和啟動子的PCR擴增引物組中的一組或兩組以上的組合，所述的上述各 PCR擴增引物組為表1所示。

[0007] 本發明所述的引物組還包括BMPR1B基因第1到第10顯子區、3 ' UTR、5 ' UTR和啟動子 分別對應的PCR測序引物組中的一組或兩組以上的組合。
[0008] 本發明所述的PCR測序引物組如表2所示。
[0009] 本發明的目的之二是提供使用上述PCR擴增引物組和PCR測序引物在制備通過PCR 擴增自生物樣品獲得核酸樣品檢測BMPR1B基因是否突變的試劑中的用途。
[0010]本發明的目的之三是提供一種用于檢測BMPR1B基因突變的試劑盒，以方便采用 DNA測序技術檢測導致肺動脈高壓發病的BMPR1B基因是否突變。具體地，該用于檢測BMPR1B 基因突變的試劑盒，包括BMPR1B基因的第1至第10顯子區、3'UTR、5'UTR和啟動子分別對應 的PCR擴增引物組中的一組或兩組以上的組合，PCR擴增引物組為表1所示。
[0011] 本發明所述的試劑盒還包括如表2所示的BMPR1B基因的第1至第10顯子區、3'UTR、 5 ' UTR和啟動子分別對應的PCR測序引物組中的一組或兩組以上的PCR測序引物組。
[0012] 本發明還包括常規PCR擴增試劑、PCR產物純化試劑和DNA測序試劑。
[0013] 所述的PCR擴增試劑包括dNTP、Taq DNA聚合酶等。
[0014] 所述的PCR產物純化試劑包括SAP酶、Exo頂每等。
[0015] 所述的DNA測序試劑包括BigDye mix、EDTA溶液、HIDI溶液等。
[0016] 本發明的有益效果： (1)本發明根據BMPR1B基因第1至第10顯子區、3'UTR、5'UTR和啟動子，共13區域序列 設計特異性引物組，可以專一性鑒別BMPR1B基因是否突變，確保了測定結果的準確性和唯 一性。與傳統的熒光定量PCR檢測單點突變的方法相比，其可以檢測13個區域范圍的所有的 BMPR1B基因是否發生突變，適用的范圍廣泛，并且它使用的是測序比對的方法進行突變檢 測，出錯率會低于熒光定量PCR的檢測方法，且造價也低于熒光定量PCR檢測法。
[0017] (2)本發明提供的引物組及試劑盒用于檢測肺動脈高壓的致病基因 BMPR1B基因 的突變體，可以快速的檢測患者的基因是否突變，以便肺動脈高壓的疾病病因診斷。同時還 可以用于BMPR1B SNP位點與基因功能之間關系的科學研究上。
[0018] (3)本發明每個引物擴增的條件類似，可以13個區域分別進行擴增測序，也可以 同時進行擴增測序。這樣的測序的方法檢測突變比通常熒光定量PCR的方法要更準確，同時 檢測范圍更廣泛，測序范圍內的任何一個位置突變或插入堿基都能從測序圖譜中發現，而 熒光定量PCR只能檢測目的位點的突變，局限性很大，且準確性不高。
[0019] (4)本發明的引物組可以檢測BMPR1B基因是否突變以及尋找突變位點，有助于 識別家系中高風險的成員，以及評估未出生孩子的患病風險，這對提高人口素質，優生優育 有重要的意義，并且對醫生指導用藥，基因評估具有重要的意義。
【附圖說明】
[0020] 圖1是血液基因組DNA的1%的Agarose電泳圖； M:DNA DL15000 maker，1、2:外周血基因組DNA。
[0021] 圖2是本發明實施例五中的血液樣本中的BMPR1B基因的測序峰圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0023] 實施例一 依據NCBI Gene Bank(NG_009245)公開的BMPR1B基因的第1到第10外顯子區、3'UTR、5' UTR和啟動子序列，設計出用于檢測BMPR1B基因是否發生突變的引物組，該引物組包括對應 于以上區域的PCR擴增引物組和PCR測序引物組，結果見表1和表2。
[0024] 實施例二 用于檢測BMPR1B基因突變的試劑盒，包括BMPR1B基因第1到第10顯子區、3'UTR、5'UTR 和啟動子序列分別對應的PCR擴增引物組與PCR測序引物組，共24每條引物10D，各對引物序 列參見表1和表2。
[0025]本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復凍融。
[0026] 實施例三 用于檢測BMPR1B基因突變的試劑盒，包括： (l)BMPRlB基因第1到第10顯子區、3'UTR、5'UTR和啟動子序列的PCR擴增引物組與PCR 測序引物組，共24對，每條引物10D，各對引物序列參見表1和表2。
[0027] (2)PCR擴增試劑：2.5mM dNTP混合液 40μ1、5X擴增緩沖液（含Mg2+)100yl、 5Units/ul Taq DNA聚合酶 5μ1。
[0028] (3) PCR產物純化試劑：1 U/ul SAP酶 20yl、10U/ul Exo頂每 10μ1。
[0029] (4)PCR測序試劑：BigDye 3.1 π?χ50μ1、0·125Μ EDTA 溶液 50μ1、無水乙醇lml、 75% 乙醇溶液 1 · 5mL、HIDI 溶液500μ1。
[0030] 本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復凍融。
[0031] 實施例四 一人份檢測BMPR1B基因突變的試劑盒的使用步驟： (1)一份病人的血液lmL，提取血液基因組DNA，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(250) Cat.no.51104提取基因組DNA。1% Agarose凝膠電泳，結果見圖1。
[0032] (2)PCR擴增:24對引物共進行24個PCR反應，每個反應體系總體積為20ul， 150ng/yl 基因組 DNA 1 μL 2.5 mM dNTP 1 μL 上游引物（10 μΜ) 0.5 μL 下游引物（10 μΜ) 0.5 μL 5Χ擴增緩沖液（含Mg2+) 4 μL Taq DNA 聚合酶（5 U/μΙ) 0.2 μL dd Η2Ο up to 20μ1〇 PCR擴增反應條件：
(3)PCR產物純化:共進行24個PCR純化反應，每個反應體系總體積20μ1，其中， PCR產物 8 μL SAP酶（1 U/μΙ) 1 μL Exonucleses(lOU/μΙ) 1 μL dd Η2Ο up to 10μ1 PCR反應條件為:37 °C孵育60min，70 °C 10 min。
[0033] (4) DNA測序反應:共進行24個測序反應。每個反應的體系為2μ1 BigDye3.1 mix， 2μ1測序引物（0·4μΜ)，加入2μ1純化的PCR產物。反應條件:96 〇C lmin;96 〇C 10s，50 0C 5S，60 〇C 4min，28個循環反應。
[0034] (5)反應結束后純化測序產物，即每管加入ΙμL 0.125M的EDTA和15μ1的乙醇，常溫 放置15min，4°C lOOOg/min離心30min，小心倒去上清，加入75%乙醇溶液，4 °C lOOOg/min 離心15min，小心倒去上清;室溫放置20min。瞭干后在管中加入Hi-Di去離子甲酰胺10μ1，放 入測序儀中。測序產物上ABI3130XL測序儀，測序文件用Polyphred軟件分析，并結合人工校 對記錄后整理出結果。如果所得測序結果中，BMPR1B基因第1到第10外顯子區、3'UTR和啟動 子序列中任意一個區域的結構上發生堿基對組成或排列順序的改變，認為BMPR1B基因發生 了突變，反之則沒有發生突變。
[0035] 實驗結果： 此樣本的BMPR1B基因并未發生突變。
[0036] 實施例五 與實施例四不同的是： (2)PCR擴增:24對引物共進行24個PCR反應，每個反應體系總體積為20ul，包含基因組 DNA(10ngAU)lyl、dNTP混合液（2.5mM each)lyl、5X擴增緩沖液（含Mg2+)4yl、上下游引 物（10μΜ)各0.5μ1，Taq DNA聚合酶(5υ/μ1)0.2μ1，去離子水12.8μ1。反應條件為反應條件 為:98°C反應5min;98°C反應15 s，60°C反應40 s，72 °C反應lmins，共35個循環反應；最 后72〇C延伸反應2 min。
[0037] 測序結果如圖2所示，箭頭指出的位置有明顯雙峰，說明是此樣本在外顯子5的這 個位點有突變，即突變堿基為c. 479G>A氨基酸突變為p. Serl60Asn。
[0038] 本發明可用其他的不違背本發明的精神或主要特征的具體形式來概述。凡是依據 本發明的實質技術對以上實施例所作的任何細微修改、等同變化與修飾，均屬于本發明技 術方案的范圍內。
【主權項】
1.用于檢測BMPRlB基因突變的引物組，其特征在于，包括BMPRlB基因第1至第10外顯子 區、3 ' UTR、5 ' UTR和啟動子對應的PCR擴增引物組，所述的PCR擴增引物組包括： (1) 所述啟動子的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的引物PFl和 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列所示的引物PRl的引物組、SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列 所示的引物PF2的引物組和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的引物PR2的引物組、SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物PF3的引物組和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的引物PR3的 引物組； (2) 所述5'UTR的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的引物 SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的引物PR4的引物組、SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的引 物PF5和SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列的引物PR5的引物組、SEQ ID NO. 11所示的核苷 酸序列的引物PF6和SEQ ID NO. 12所示的核苷酸序列的引物PR6的引物組； (3) 所述Exonl的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO. 13所示的核苷酸序列的引物PF7和 SEQ ID NO. 14所示的核苷酸序列的引物PR7的引物組； (4) 所述Exon2的PCR擴增引物組：SEQ ID NO. 15所示的核苷酸序列的引物PF8和SEQ ID NO. 16所示的核苷酸序列的引物PR8的引物組； (5) 所述Exon3的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO. 17所示的核苷酸序列的引物 SEQ ID NO. 18所示的核苷酸序列的引物PR9的引物組； (6) 所述Exon4的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO. 19所示的核苷酸序列的引物PFlO和 SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列的引物PRlO的引物組； (7) 所述Exon 5的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列的引物PFll 和SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列的引物PRll的引物組； (8) 所述Exon6的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列的引物PF12和 SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列的引物PRl2的引物組； (9) 所述Exon7的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列的引物PF13和 SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列的引物PRl3的引物組； (10) 所述Exon8的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO. 27所示的核苷酸序列的引物PF14 和SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列的引物PR14的引物組； (11) 所述Exon9的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列的引物PF15 和SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列的引物PRl5的引物組； (12) 所述ExonlO的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列的引物PF16 和SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列的引物PR16的引物組； (13) 所述3'UTR的PCR擴增引物組:包括SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列的引物PF17 和SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列的引物PR17的引物組、SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列 的引物PF18和SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列的引物PR18的引物組、SEQ ID NO.37所示的 核苷酸序列的引物PF19和SEQ ID NO. 38所示的核苷酸序列的引物PR19的引物組、SEQ ID NO. 39所示的核苷酸序列的引物PF20和SEQ ID NO. 40所示的核苷酸序列的引物PR20的引物 組、SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列的引物PF21和SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列的引物 PR21的引物組、SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列的引物PF22和SEQ ID NO.44所示的核苷酸 序列的引物PR22的引物組、SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列的引物PF23和SEQ ID NO.46所 示的核苷酸序列的引物PR23的引物組、SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列的引物PF24和SEQ ID NO. 48所示的核苷酸序列的引物PR24的引物組。2. 用于檢測BMPRlB基因突變的引物組，其特征在于，還包括BMPRlB基因第1至第10外顯 子區、3 ' UTR、5 ' UTR和啟動子對應的PCR測序引物，所述的PCR測序引物包括： (14) 所述啟動子的PCR測序引物包括SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的引物PFl、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列所示的引物PF2和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物PF3; (15) 所述5'UTR的PCR測序引物包括SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列的引物PF4、SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的引物PF5、SEQ ID NO. 11所示的核苷酸序列的引物PF6; (16) 所述Exonl的PCR測序引物組包括SEQ ID NO. 13所示的核苷酸序列的引物PF7; (17) 所述Exon2的PCR測序引物組包括SEQ ID NO. 15所示的核苷酸序列的引物PF8; (18) 所述Exon3的PCR測序引物組包括SEQ ID NO. 17所示的核苷酸序列的引物PF9; (19) 所述Exon4的PCR測序引物組包括SEQ ID NO. 19所示的核苷酸序列的引物PF10; (20) 所述Exon5的PCR測序引物組包括SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列的引物PFll; (21) 所述Exon6的PCR測序引物組包括SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列的引物PF12; (22) 所述Exon7的PCR測序引物組包括SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列的引物PF13; (23) 所述Exon8的PCR測序引物組包括SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列的引物PF14; (24) 所述Exon9的PCR測序引物組包括SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列的引物PF15; (25) 所述ExonlO的PCR測序引物組包括SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列的引物PF16; (26) 所述3'UTR的PCR測序引物組包括SEQ ID N0.33所示的核苷酸序列的引物PF17、 SEQ ID NO. 35所示的核苷酸序列的引物PF18、SEQ ID NO. 37所示的核苷酸序列的引物 PF19、SEQIDN0.39所示的核苷酸序列的引物PF20、SEQIDN0.41所示的核苷酸序列的引 物PF21、SEQIDN0.43所示的核苷酸序列的引物PF22、SEQIDN0.45所示的核苷酸序列的 引物PF23、SEQ ID從).47所示的核苷酸序列的引物??24。3. 權利要求1所述的BMPRlB基因第1至第10外顯子區、3'17^、5'17^和啟動子對應的卩0? 擴增引物組在制備通過PCR擴增自生物樣品獲得核酸樣品檢測BMPRlB基因是否突變的試劑 中的用途。4. 包含權利要求1的引物組的用于檢測BMPRlB基因突變的試劑盒，其特征在于，包含權 利要求1所述的BMPRlB基因第1至第10外顯子區、3'17^、5'17^和啟動子對應的？0財廣增引物 組。5. 根據權利要求4所述的用于檢測BMPRlB基因突變的試劑盒，其特征在于，還包含權利 要求2所述的BMPRlB基因第1至第10外顯子區、3'17^、5'17^和啟動子對應的?0?測序引物。6. 根據權利要求4或5所述的用于檢測BMPRlB基因突變的試劑盒，其特征在于，還包括 常規PCR擴增試劑、PCR產物純化試劑和DNA測序試劑。
【文檔編號】C12N15/11GK105886635SQ201610306419
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月11日
【發明人】盧文菊, 張晨婷, 王健
【申請人】廣州醫科大學附屬第醫院, 廣州醫科大學附屬第一醫院