一種適于雞miRNA高通量測序的血清制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種適于雞miRNA高通量測序的血清制備方法。按照以下方法制得：1）集新鮮血液后，迅速置于4℃冷凍離心機中，轉速為800~900rpm/min，離心時間為4~6min，去除血細胞及其它內容物，用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中，嚴格避免血細胞進入吸取的上清液中；2）取1）獲取的上清液，迅速置于4℃冷凍離心機中，轉速為1800~2000rpm/min，離心時間為8~12min，去除殘留的血細胞。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中；3）取2）獲取的上清液，迅速置于液氮保存。本發明通過優化雞血清制備過程中的離心轉速、溫度和時間，獲得了高質量的雞血清，滿足高通量測序要求，為雞血清miRNA高通量測序等研究提供了前提。
【專利說明】
一種適于雞m i RNA高通量測序的血清制備方法
技術領域
[0001]
本發明涉及一種適于雞miRNA高通量測序的血清制備方法，屬于分子生物學技術領域。
【背景技術】
[0002]
微小RNA(microRNA)是一類長度約為18nt?25nt的內源性非編碼單鏈小分子RNAt3HiiRNA在轉錄后水平調控基因表達，廣泛參與一系列生命發育事件的調節。隨著研究的不斷深入，還發現血清中也存在miRNA(稱之為循環miRNA，Circulating miRNA)，是機體生物學和生理學狀態的精細監測者。特異性的血清miRNA表達譜在人類及動物疾病早期監測、診斷和預后觀察中具有較好的應用前景，展現出其作為一種新型生物標志物的巨大潛能。
[0003]研究發現血清miRNA可以作為雞性成熟啟動度量、禽病診斷等領域的潛在生物學標志物。新一代高通量測序是鑒定血清miRNA表達譜的重要手段，制備高質量的血清miRNA是其關鍵前提。然而，在研究過程中發現若采用常規方法制備雞血清，血清中的循環miRNA易降解，不能用于后續的高通量測序及相關實驗，已成為雞血清miRNA研究的瓶頸。
【發明內容】
[0004]本發明針對上述缺陷，通過優化血清制備流程，獲得了高質量的雞血清，并通過熒光光度計檢測和gga-let_7a RT-qPCR質檢發現血清循環miRNA保存完好，滿足高通量測序要求。
[0005]為此本發明采用的技術方案是:按照以下方法制得:
1)集新鮮血液后，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為800?900rpm/min，離心時間為4?6min，去除血細胞及其它內容物，用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中，嚴格避免血細胞進入吸取的上清液中；
2)取I)獲取的上清液，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為1800?2000rpm/min，離心時間為8?12min，去除殘留的血細胞。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中；
3)取2)獲取的上清液，迅速置于液氮保存。
[0006]要求Ih內完成整個血清制備過程。
[0007]所述I)步驟中，轉速為820rpm/min。
[0008]所述2)步驟中，轉速為1860rpm/min。
[0009]所述I)步驟中，離心時間為5min。
[0010]所述2)步驟中，離心時間為lOmin。
[0011 ]本發明的優點是:本發明通過優化雞血清制備過程中的離心轉速、溫度和時間，獲得了高質量的雞血清，并通過熒光光度計檢測和gga-let-7a RT-qPCR質檢發現血清中的循環miRNA保存完好，滿足高通量測序要求，為雞血清miRNA高通量測序等研究提供了前提。
【附圖說明】
[0012]圖1為實施例1的質檢圖。
[0013]圖2為實施例2、3、4、5的質檢圖。
【具體實施方式】
[0014]本發明的目的制定一種適于雞miRNA高通量測序的血清制備方法。本發明的技術方案是:通過優化雞血清制備過程中的離心轉速、溫度和時間，獲得了高質量的雞血清，并通過熒光光度計檢測和gga-let_7a RT-qPCR質檢發現血清中的循環miRNA保存完好，滿足高通量測序要求。所采用的技術方法以及所獲得的結果如下所示:
1.1血液采集
無酶管收集雞翅靜脈血樣2?2.5ml。
[0015]1.2血清制備實施實例1:
(I)采集新鮮血液后，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為800?900rpm/min，離心時間為5min，去除血細胞及其它內容物。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中，嚴格避免血細胞進入吸取的上清液中。
[0016](2)取(I)獲取的上清液，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為1800?2000rpm/min，離心時間為1min，去除殘留的血細胞。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中。
[0017](3)取(2)獲取的上清液，迅速置于液氮保存。要求Ih內完成整個血清制備過程。
[0018]實施實例2:
(I)采集新鮮血液后，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為700?800rpm/min，離心時間為5min，去除血細胞及其它內容物。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中，嚴格避免血細胞進入吸取的上清液中。
[0019](2)取(I)獲取的上清液，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為1800?2000rpm/min，離心時間為1min，去除殘留的血細胞。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中。
[0020](3)取(2)獲取的上清液，迅速置于液氮保存。要求Ih內完成整個血清制備過程。
[0021]實施實例3:
(I)采集新鮮血液后，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為900?1000rpm/min，離心時間為5min，去除血細胞及其它內容物。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中，嚴格避免血細胞進入吸取的上清液中。
[0022](2)取(I)獲取的上清液，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為1800?2000rpm/min，離心時間為1min，去除殘留的血細胞。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中。
[0023](3)取(2)獲取的上清液，迅速置于液氮保存。要求Ih內完成整個血清制備過程。
[0024]實施例4:
(I)采集新鮮血液后，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為800?900rpm/min，離心時間為5min，去除血細胞及其它內容物。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中，嚴格避免血細胞進入吸取的上清液中。
[0025](2)取(I)獲取的上清液，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為1600?1800rpm/min，離心時間為1min，去除殘留的血細胞。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中。
[0026](3)取(2)獲取的上清液，迅速置于液氮保存。要求Ih內完成整個血清制備過程。
[0027]實施例5:
(I)采集新鮮血液后，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為800?900rpm/min，離心時間為5min，去除血細胞及其它內容物。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中，嚴格避免血細胞進入吸取的上清液中。
[0028](2)取(I)獲取的上清液，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為2000?2200rpm/min，離心時間為1min，去除殘留的血細胞。用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中。
[0029](3)取(2)獲取的上清液，迅速置于液氮保存。要求Ih內完成整個血清制備過程。
[0030]1.3質量檢測
(I)取出液氮保存的血清，按照常規SmalI RNA提取試劑盒操作說明，提取血清小RNA。
[0031](2)分光光度計檢測。采用B1analyzer 2100系統檢測樣品的RIN值和A260/A280值。
[0032](3)gga-let-7a RT-PCI^i"增檢測。選用gga_let_7a作為質檢引物，每個逆轉錄反應取樣品量為5μ1，總反應體系為10μ1。以1.Ομ?/孔的cDNA為模板，進行Real-time PCR，反應體系為20μ1，復孔為兩個，同時做引物NTC對照(模板以常規方法制備血清提取的小RNA逆轉錄產物代替)，進行RT-PCR檢測。
[0033]結果:通過優化雞血清制備過程中的離心轉速、溫度和時間，獲得了高質量的雞血清，分光光度計檢測結果表明:
實施實例I樣品的RIN > 8.0，A260/A280>2.1，gga-let_7a RT-qPCR質檢顯示結果良好(見附圖1)。
[0034]實施實例2、3、4、5樣品的RIN 值為 4.0?5.0，Α260/Α280 值為1.5~1.6，gga-let-7aRT-qPCR質檢顯示miRNA已降解(見附圖2)。
[0035]基于上述結果，表明應用實施實例I方法制備的雞血清，血清中循環miRNA保存完好，質量滿足高通量測序要求，為從雞血清中提取miRNA開展相關研究提供了必要的前提。
【主權項】
1.一種適于雞miRNA高通量測序的血清制備方法，其特征在于，按照以下方法制得: 1)集新鮮血液后，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為800?900rpm/min，離心時間為4?6min，去除血細胞及其它內容物，用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中，嚴格避免血細胞進入吸取的上清液中； 2)取I)獲取的上清液，迅速置于4°C冷凍離心機中，轉速為1800?2000rpm/min，離心時間為8?12min，去除殘留的血細胞。2.用無酶吸頭緩慢吸取上清液，置于另一新無酶管中； 3 )取2 )獲取的上清液，迅速置于液氮保存。3.根據權利要求1所述的一種適于雞miRNA高通量測序的血清制備方法，其特征在于，要求Ih內完成整個血清制備過程。4.根據權利要求1所述的一種適于雞miRNA高通量測序的血清制備方法，其特征在于，所述I)步驟中，轉速為820 rpm/min。5.根據權利要求1所述的而一種適于雞miRNA高通量測序的血清制備方法，其特征在于，所述2)步驟中，轉速為1860 rpm/min。6.根據權利要求1所述的一種適于雞miRNA高通量測序的血清制備方法，其特征在于，所述I)步驟中，離心時間為5min。7.根據權利要求2所述的一種適于雞miRNA高通量測序的血清制備方法，其特征在于，所述2)步驟中，離心時間為lOmin。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886630SQ201610295800
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月6日
【發明人】朱云芬, 韓威, 李國輝, 王洪志, 張會永, 殷建玫, 盛中偉, 鄒劍敏, 王克華, 蘇軍, 蘇一軍, 王國俊
【申請人】江蘇省家禽科學研究所