一種用于檢測麥角菌的試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于檢測麥角菌的試劑盒，其包括引物、Bst DNA聚合酶、反應緩沖液和核酸染料。本發明還提供了一種檢測麥角菌的LAMP方法。使用本發明的LAMP試劑盒或方法能夠快速、準確地對麥角菌進行鑒定和檢測，具有高特異性、耗時短、靈敏度高、鑒定簡便等優點，適于實驗室或田間檢驗使用。
【專利說明】
一種用于檢測麥角菌的試劑盒及檢測方法
技術領域
[0001]本發明涉及微生物檢測領域，具體地說，本發明涉及一種用于檢測麥角菌的試劑 盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]麥角菌(Claviceps purpurea)屬麥角菌科、麥角菌屬，是一類主要以禾本科雜草 和糧谷類植物為寄生宿主的真菌。其寄生于宿主的子房內，受侵染的子房不形成種子而是 形成堅硬的菌核。菌核結構比較致密，并且外面包有一層角狀外殼，由此得名"麥角" (Ergots)(Alderman, 1999)。麥角菌在高濕度、高水分條件下生長旺盛，容易感染植株。大部 分麥角病菌的麥角是其宿主植物種子的1-4倍。由麥角病菌及其菌核所導致宿主植物所發 生的病一般稱為"麥角病"（Ergot diseases)。麥角病是麥類和禾本科植物牧草的重要病 害，不但使麥類大幅度減產，而且麥角中的生物堿對人、畜有毒，歷史上因誤食含麥角的谷 物而引起中毒事件時有發生，如牲畜誤食帶麥角的飼草中毒死亡，人攝入過多含麥角的谷 物食品也會發生流產甚至死亡現象。因此，需要開發適于田間或實驗室對麥角菌進行快速 檢測的試劑盒或方法。
[0003] 目前分子生物學檢測以其快速、靈敏的特點，在微生物檢測領域逐漸取代傳統的 形態學鑒定，成為熱門研究方向。環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)是日本學者Notomi于2000年建立的一種新型的核酸擴增技 術。該技術針對靶基因 6個區域設計4條引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶在恒溫條件 下快速、高特異性地擴增靶基因，產物是兩端帶有莖環結構的啞鈴狀DNA分子。與實驗室常 規檢測的PCR方法相比，LAMP技術具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等優勢，在食品、動植 物檢驗檢疫中被廣泛應用于各種病原檢測。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種用于檢測麥角菌的LAMP試劑盒及LAMP方法。
[0005] 為了實現本發明的目的，在一個方面中，本發明提供一種用于檢測麥角菌的LAMP 試劑盒，其包括引物、反應緩沖液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物如下所示：
[0006] 外引物F3:CGGACACTCAAGATCGACC(SEQ ID N0:1)
[0007] 外引物B3:CGATATCGGGCCTTGTGAAT(SEQ ID NO:2)
[0008] 內引物FIP:TGGGGTTCGTTTCGGCTTGAA-GACAAGCGTGCTTGACCAAT(SEQ ID N0:3)
[0009] 內引物BIP:GAGAATCTGAGGCCGGCTACTG-TCCTTCCTATGCCCTGCT(SEQ ID N0:4)。
[0010] 優選地，所述反應緩沖液由2mM dNTP、10XThermoPol反應緩沖液、0.6mM甜菜堿和 6mM Mg2+組成。
[0011] 優選地，所述核酸染料為1000XSYBR Green I。
[0012] 優選地，本發明的試劑盒進一步包括DNA提取試劑以及陽性對照和陰性對照。
[0013] 優選地，所述DNA提取試劑例如CTAB抽提緩沖液。
[0014] 在另一個方面中，本發明提供了引物在制備用于檢測麥角菌的LAMP試劑盒中的應 用。所述引物如序列SEQ ID N0s:l-4所示。
[0015] 在又一個方面中，本發明還提供了一種檢測麥角菌的LAMP方法，其中使用本發明 的試劑盒，所述方法包括以下步驟：
[0016] (1)向待測樣品中加入CTAB抽提緩沖液，按照常規CTAB法提取DNA;
[0017] (2)在PCR管中制備LAMP反應體系，包括0.2μπιο1/μ1的外引物F3 1μ1、0.2μπιο1/μ1 的外引物Β3 1μ1、1.2μL?〇1/μ1的內引物FIP 1μ1、1.2μL?〇1/μ1的內引物ΒΙΡ ΙμL、反應緩沖液 2.5μ1、8υ/μ1的Bst DNA聚合酶ΙμL、模板DNA 2μ1，加水補充至25μ1，并以麥角菌基因組DNA 作為陽性對照，以lOOmM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作為陰性對照；
[0018] (3)將步驟(2)中的PCR管于63°C恒溫反應60min;
[0019] (4)分析判斷反應產物結果：在（3)中所得反應產物中加入ΙμL核酸染料SYBR Green I，如反應液顏色為橙色，表示結果為陰性，食品中不含麥角菌，如反應液顏色為綠 色，表示結果為陽性。
[0020] 本發明的發明人針對麥角菌序列的6個區域設計出4條引物，靈敏度高、特異性好。 本發明用于檢測麥角菌的LAMP試劑盒及方法能夠準確鑒定食品、谷物、田間的麥角菌，假陽 性率低、快速、高效，且通過肉眼觀察顏色變化即可判定結果，無需電泳和紫外觀察等步驟， 成本低、操作簡單、鑒定簡便，適于基礎實驗室和現場檢測，值得推廣應用。
【具體實施方式】
[0021] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。本領域技術人員應當 領會的是，可以在不偏離本發明精神的情況下進行多種修改，這些修改將包含在本發明的 范圍內。
[0022] 實施例1本發明的試劑盒的制備
[0023] 1.1試劑
[0024]引物由天根生化科技(北京)有限公司合成;Bst DNA聚合酶和lOXThermoPol反應 緩沖液購自Takara; SYBR Green I購自Invitrogen;其余PCR試劑和配制CTAB抽提緩沖液所 需的試劑購自Sigma。
[0025] 1.2試劑盒的制備：
[0026] 獲得以下試劑，以制備本發明的試劑盒：
[0027] CTAB抽提緩沖液：按照以下配方配制：100mM Tris-HCl pH 8.0、50mM EDTA、1M NaCl、1 % (v/v) β-巰基乙醇、2 % CTAB，調整pH值至7 · 2;
[0028] 反應緩沖液:按照以下配方配制：2mM dNTP、10 X ThermoPol反應緩沖液、0.6mM甜 菜喊、6mM MgSCU;
[0029] 引物：外引物F3,其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；外引物B3,其核苷酸序列如 SEQIDN0:2所示；內引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDN0:3所示，內引物BIP，其核苷酸序 列如SEQ ID N0:4所示。其中外引物F3和B3的濃度為0.2μπιο1/μ1，內引物FIP和BIP的濃度為 1 ·2μηιο1/μ1〇
[0030] 濃度為8υ/μ1的Bst DNA聚合酶；
[0031] 核酸染料：1000 X SYBR Green I;
[0032] 陽性對照:麥角菌基因組DNA;
[0033] 陰性對照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。
[0034] 實施例2麥角菌特異性檢測
[0035] 2 · 1LAMP特異性檢測
[0036] 2.1.1待測植株
[0037] 待測植株包括來自河北省農林科學院的麥角病植株8株(包括黑麥3株、大麥5株）、 炭疽病黃瓜2株、白粉病豌豆2株以及健康的大麥2株。麥角病植株穗上均可見麥角形成。 [0038] 2.1.2樣品預處理：
[0039]將麥角病植株從莖基部剪斷，將上部用無菌水沖洗后，用消毒剪刀將其剪成小段， 置于PDA培養基上，25度恒溫培養，直至形成菌落。
[0040]用接種環刮取白粉病豌豆植株葉片上的白色霉層，接種于PDA平板上，劃線培養。 用消毒剪刀剪下炭疽病黃瓜葉片適量，在PDA培養基上分離培養炭疽病菌。
[0041 ]挑取上述病菌菌落的菌絲少量，在光學顯微鏡下觀察其形態學特征。觀察顯示，培 養所得菌落均符合相應病菌的菌落特征。
[0042] 2.1.3LAMP 檢測
[0043] 使用實施例1制備的試劑盒按照以下步驟進行檢測：
[0044] (1)收集PDA平板上的菌落并離心，加入CTAB抽提緩沖液，按照常規CTAB法提取 DNA；
[0045] (2)在PCR管中制備LAMP反應體系，其中四種引物各ΙμL、反應緩沖液2.5μ1、8υ/μ1 的Bst DNA聚合酶ΙμL、步驟（1)所得模板DNA 2μ1，加水補充至25μ1，并以麥角菌基因組DNA 作為陽性對照，以lOOmM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作為陰性對照；
[0046] (3)將步驟(2)中PCR管置于63°C恒溫反應60min;
[0047] (4)分析判斷反應產物結果:在(3)中所得反應產物中加入ΙμL 1000 XSYBR Green I，如反應液顏色為橙色，表示結果為陰性，如反應液顏色為綠色，表示結果為陽性。
[0048] 2.2檢測結果
[0049] 8株麥角病植株以及陽性對照的PCR管中均呈現綠色，而豌豆、黃瓜、健康大麥以及 陰性對照的顯色結果均為橙色，表明引物能夠準確地鑒定出攜帶麥角菌的病害植株，具有 很強的特異性。
[0050] 實施例3麥角菌靈敏度檢測
[0051 ] 3 · 1LAMP靈敏度檢測
[0052]按照實施例2的步驟(1)提取麥角菌DNA，紫外分光光度計測量其0D值，并以10倍濃 度系列稀釋法稀釋成l〇ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg共6個梯度。
[0053] LAMP反應體系和反應條件以及結果分析同實施例2第2.1.3節的步驟(2)-(4)。
[0054] 3.2檢測結果
[0055] 麥角菌DNA濃度為10ng、lng、100pg、10pg、lpg的PCR管中均呈現綠色，表明本發明 的檢測方法的最低檢測極限達到lpg DNA，靈敏度很高。
【主權項】
1. 一種用于檢測麥角菌的LAMP試劑盒，其特征在于，可以包括特異性引物組、反應緩沖 液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物如下所示： 外引物F3:CGGACACTCAAGATCGACC(SEQ ID N0:1) 外引物B3:CGATATCGGGCCTTGTGAAT(SEQ ID NO:2) 內引物FIP: TGGGGTTCGITTCGGCTTGAA-GACAAGCGTGCTTGACCAAT(SEQ ID NO: 3) 內引物BIP: GAGAATCTGAGGCCGGCTACTG-TCCTTCCTATGCCCTGCT(SEQ ID NO: 4)。2. 根據權利要求1所述的用于檢測麥角菌的LAMP試劑盒，其中所述反應緩沖液由2mM dNTP、10 X ThermoPo 1反應緩沖液、0 · 6mM甜菜堿和6mM Mg2+組成。3. 根據權利要求1或2所述的用于檢測麥角菌的LAMP試劑盒，其進一步包括DNA提取試 劑以及陽性對照和陰性對照。4. 根據權利要求3所述的用于檢測麥角菌的LAMP試劑盒，其中所述DNA提取試劑是CTAB 抽提緩沖液。5. -種檢測麥角菌的LAMP方法，所述方法用于對食品中的麥角菌進行鑒定，其包括以 下步驟： (1) 向待測樣品中加入CTAB抽提緩沖液，按照常規CTAB法提取DNA; (2) 在PCR管中制備LAMP反應體系，其包括O . 2μπιο 1 /μ 1的外引物F3 1μ I、0.2μπιο 1 /μ 1的 外引物Β3 1μ1、1.2μL?〇1/μ1的內引物FIP 1μ1、1.2μL?〇1/μ1的內引物BIP ΙμL、反應緩沖液 2.5μ1、8υ/μ1的Bst DNA聚合酶ΙμL、模板DNA 2μ1，加水補充至25μ1，并以麥角菌基因組DNA 作為陽性對照，以IOOmM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作為陰性對照， 其中所述引物如下所示： 外引物F3:CGGACACTCAAGATCGACC(SEQ ID N0:1) 外引物B3:CGATATCGGGCCTTGTGAAT(SEQ ID NO:2) 內引物FIP: TGGGGTTCGITTCGGCTTGAA-GACAAGCGTGCTTGACCAAT(SEQ ID NO: 3) 內引物BIP:GAGAATCTGAGGCCGGCTACTG-TCCTTCCTATGCCCTGCT(SEQ ID NO: 4); (3) 將步驟(2)中的PCR管于63 °C恒溫反應60min; (4) 分析判斷反應產物結果:在(3)中所得反應產物中加入ΙμL核酸染料SYBR Green I， 如反應液顏色為橙色，表示結果為陰性，食品中不含麥角菌，如反應液顏色為綠色，表示結 果為陽性。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886619SQ201610268387
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】張梅
【申請人】張梅