一種用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種用于ABCB1基因分型的ARMS?qPCR檢測試劑盒，本發明還涉及一種基于本試劑盒的ABCB1基因分型ARMS?qPCR檢測方法。其中，本試劑盒包括qPCR反應體系，所述qPCR反應體系包括qPCR混合反應液、參照引物、ARMS引物和陽極對照樣品；所述qPCR混合反應液包括PCR緩沖液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR上下游引物和TaqMan探針；所述qPCR反應體系中，各組分的終濃度分別為：PCR緩沖液為1X；dNTP為0.1～1.5mM；MgCl2為0.5～5mM；Tag酶為0.05～0.1U/μl；PCR下游引物為0.1～1μM；TaqMan探針為0.1～1μM；參照引物為0.5μM；ARMS引物為0.5μM；陽性對照樣品為1～10ng/μl。本試劑盒能快速、靈敏、準確的檢測ABCB1不同基因型，可以檢測不同來源的基因組DNA，如血液、口腔黏膜細胞、頭發等。
【專利說明】
-種用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒及檢測 方法
技術領域
[0001] 本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR檢 測試劑盒，本發明還涉及一種ABCB1基因分型ARMS-qPCR檢測方法。
【背景技術】
[0002] ABCB1基因位于人類基因組第7號染色體（7q21)，編碼一個長1280個氨基酸的蛋 白。它具有12個跨膜的結構域，在其細胞內有ATP的結合位點。這個基因是一個轉運蛋白， 可以運轉一些藥物到細胞內，起著非常重要的生理功能。ABCB1蛋白在血腦屏障中高表達， 將許多藥物以及神經毒素排出以保護大腦。現有研究表明，ABCB1不同的基因型與抑郁癥 的潛在發病緊密相關（Fuji et al. 2012)。
[0003] 抑郁癥又稱憂郁癥，是以情緒低落為主要特征的一類心理疾病，其臨床表現輕型 病人外表如常，內心有痛苦體驗。稍重的人可表現為情緒低落、愁眉苦臉、唉聲嘆氣、自卑 等，有些患者常常伴有神經官能癥癥狀，如：注意力不集中、記憶力減退、反應遲緩和失眠多 夢等癥狀。重型抑郁癥患者會出現悲觀厭世、絕望、自責自罪、幻覺妄想、食欲不振、體重銳 減、功能減退、并伴有嚴重的自殺企圖，甚至有自殺行為，因此對人類健康構成嚴重威脅。
[0004] 隨著現代生活節奏的加快和壓力的增大，越來越多的人罹患憂郁癥，北京市15歲 以上的人群中，抑郁障礙的終生罹患率為6. 87 %，全國的罹患率在5-10 %之間，其中女性 的罹患率是男性的兩倍。據世界衛生組織預計，到2020年，抑郁癥將成為繼冠心病后的第 二大疾病負擔源。
[0005] 科學研究發現ABCB1基因的不同基因型與抑郁癥的罹患風險密切相關，T3435純 合基因型與C3435以及C/T3435雜合基因型的人罹患抑郁癥的風險有顯著地差異（Fuji et al. 2012)。因此，ABCB1基因3435位置的不同基因型是預測抑郁癥潛在風險的極好生物標 志物，檢測ABCB1基因3435位置的不同基因型對于提前預防抑郁癥，節約醫療資源具有重 要的意義。
[0006] 可用于ABCB1基因分型的技術很多，包括如DNA直接測序法、雜交芯片法、焦磷酸 測序法以及變性高效液相色譜法等。其中，DNA測序法為基因分型的金標準，該方法存在如 下缺點：檢測的靈敏度不高，只有大于15%的突變才能檢測到；費時，操作復雜，對操作人 員要求高；非閉管操作，涉及PCR擴增后的操作，因此易被污染，造成結果的不理想；通量太 小，一次最多只能做24個，很難大規模開展。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的第一個技術問題是針對技術現狀提供一種靈敏度高、特異性強 的用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒。
[0008] 本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種ABCB1基因分型的ARMS-qPCR檢測 方法，該檢測方法靈敏度高、特異性強，而且操作簡單。
[0009] 本發明解決上述第一個技術問題所采用的技術方案為：一種用于ABCB1基因分型 的ARMS-qPCR檢測試劑盒，包括qPCR反應體系，所述qPCR反應體系包括qPCR混合反應液、 參照引物、ARMS引物和陽極對照樣品；所述qPCR混合反應液包括PCR緩沖液、dNTP、MgCl2、 Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探針；
[0010] 所述qPCR反應體系中，各組分的終濃度分別為：PCR緩沖液為IX ;dNTP為0. 1~ 1.5禮；1%(：12為0.5~51111汀&8酶為0.05~0.11]/^1屮0?下游引物為0.1~14]\1汀39]\&111 探針為0. 1~1 μ Μ ;參照引物為0. 5 μ M ;ARMS引物為0. 5 μ Μ ;陽性對照樣品為1~10ng/ μ 1〇
[0011] 其中，所述PCR下游引物的序列如ABCB1-R所示；
[0012] 所述TaqMan探針的序列如ABCBl-TaqMan所示；
[0013] 所述參照引物的序列如ABCB1-C所示，能夠擴增所有不同ABCB1基因型；
[0014] 所述ARMS引物為兩種上游引物中的任意一種，分別對應ABCB1 CC3435、TT3435型 基因型，這兩種上游引物的序列如ABCB1-F1、ABCB1-F2所示；這兩種ARMS引物分別在3 '末 端與不同的基因型堿基匹配，同時在其3'末端倒數第2、3位增加一個或者兩個堿基錯配， 以增加其特異性；用于特異性擴增的ABCB1 3435位基因型為TT/CC/TC ;
[0015] 所述陽極對照樣品分別為ABCB1不同基因型堿基置換的質粒基因組DNA。
[0016] 各引物序列列舉如下：
[0017] ABCB1-R :5, -AAACAGGAAGTGTGGCCAGA-3'
[0018] ABCBl-TaqMan :5, -FAM-CTCTCTTCAAATAAACAGCC-3'
[0019] ABCB1-C :5, -CCTATGGAGACAACAGCCGG-3'
[0020] ABCB1-F1 :5, -GTGGTGTCACAGGAAGAGGCT-3'
[0021] ABCB1-F2 :5, -GTGGTGTCACAGGAAGAGGCC-3'
[0022] 其中，所述 Tag 酶為 Takara Tag 酶或 Goldstar Best Tag 酶。
[0023] 本發明解決上述第二個技術問題所采用的技術方案為：基于上述試劑盒的ABCB1 基因分型ARMS-qPCR檢測方法，該方法先是針對ABCB1基因設計一對參照引物、TaqMan探 針，針對3435位點的不同基因型設計ARMS引物，反應體系中加入qPCR混合反應液，參照引 物或者ARMS引物、TaqMan引物和待測模板DNA進行熒光定量PCR的檢測，具體包括如下步 驟：
[0024] (1)設計并篩選含有ABCB1基因3435位不同基因型通用的參照引物、TaqMan探針 及兩種ARMS引物；
[0025] (2)從細胞體系或血液中提取到基因組DNA作為模板DNA ;
[0026] (3)進行實時熒光定量PCR擴增，每個樣本的檢測分3管進行，每個管加入相同的 qPCR混合反應液，TaqMan探針和模板DNA，每管分別加入參照引物和兩種ARMS引物中的一 種，進行ABCB1基因3435位基因分型的qPCR檢測；
[0027] (4)結果判讀：
[0028] 參照引物管擴增曲線陽性，ABCB1-F1管擴增曲線陽性，ABCB1-F2管擴增曲線陰性 或者其與參照引物管的擴增曲線ACT > 10,該樣本結果判定為3435TT基因型；
[0029] 參照引物管擴增曲線陽性，ABCB1-F1管擴增曲線陽性，ABCB1-F2管擴增曲線陽 性，該樣本結果判定為3435C/T基因型；
[0030] 參照引物管擴增曲線陽性，ABCB1-F1管擴增曲線陰性或者其與參照引物管的擴增 曲線ACT > 10, ABCB1-F2管擴增曲線陽性，該樣本結果判定為3435CC基因型；
[0031] 參照引物管擴增曲線陰性，提示該樣本提取失敗，需要重新進行提取。
[0032] 所述步驟（2)中，模板DNA選自人體血液基因組DNA或者口腔黏膜脫落細胞或頭 發。
[0033] 所述步驟（3)中，進行PCR擴增反應的條件為，95°C預變性2min，95°C變性15s， 60°C延伸lmin，46個循環。
[0034] 上述技術方案中所提及的qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統，也叫實時定量基因擴增熒光檢測 系統，簡稱qPCR。
[0035] 與現有技術相比，本發明的優點在于：
[0036] 本發明提供了一種ABCB1基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒，以解決現有基因分 型檢測技術中費時、程序繁瑣以及易污染等問題。本試劑盒可以快速、準確、便宜、高通量給 ABCB1基因進行分型，其靈敏度高、特異性強，適用于常見樣本比如血液、口腔黏膜以及頭發 等。
[0037] 本試劑盒能快速、靈敏、準確的檢測ABCB1不同基因型，可以檢測不同來源的基因 組DNA，如血液、口腔黏膜細胞、頭發等。與直接測序等基因分型的技術相比，本發明用于 ABCB1基因分型有特異性強、靈敏度高，操作簡單快速、高通量、判讀結果可靠，簡便等優勢。
[0038] 本發明的試劑盒能夠快速、低廉、準確，高通量地檢測人體血液或者其他組織細胞 中ABCB1基因不同的類型，對于分型技術而言，是目前性價比最好的方法，便于臨床或者健 康檢測大規模的推行。
[0039] 本發明所用的 ARMS (amplification refractory mutation system)即擴增阻礙突 變系統，用于對已知突變基因進行檢測。該法通過設計兩個5'端引物，一個與正常DNA互 補，一個與突變DNA互補，對于純合性突變，分別加入這兩種引物及3'端引物進行兩個平行 PCR，只有與突變DNA完全互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產物。如果錯配位于引物的 3'端則導致PCR不能延伸，則稱為ARMS。
[0040] ARMS檢測的靈敏度依賴于ARMS引物的特異性以及反應條件如反應液中MgC12的 濃度，加不加 DMS0等的優化。為了增加引物的特異性，減少引物與靶向DNA有錯配時的錯 配延伸，可通過在引物3'端的第2、3個堿基引入另外一個或者兩個錯配堿基，使之與模板 之間形成多重錯配以阻值錯誤延伸。
[0041] 本發明所用的探針為5'端FAM標記的TaqMan探針，探針兩端分別標記熒光報告 基團（R)和熒光淬滅基團（Q)。在探針完整時，即在隨機狀態和無 PCR產物雜交狀態時，報 告基團發出的熒光被淬滅基團吸收，檢測不到熒光的存在。在ARMS-qPCR擴增過程中，當特 異的PCR產物與TaqMan探針發生雜交反應時，Goldstar Best Tag酶的5'端外切酶活性 也把TaqMan探針的堿基逐個剪切，報告基團所釋放出的熒光就可以被內置到PCR儀中的熒 光計檢測到。PCR經過一個循環，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數擴增的過程， 熒光信號的強弱就代表模板DNA拷貝數的多少。因此本發明是個很好的基因分型的工具。
[0042] 綜合了 ARMS引物以及實時熒光定量PCR的優點，與直接測序等基因分型的技術相 比較，本發明用于ABCB1基因分型基因檢測具有如下優勢：
[0043] 1、特異性強：設計的ARMS引物分別針對ABCB1 TT 3435，CC3435的特異變異序列， 能特異地擴增相應的基因型DNA ;在ARMS引物3'端的倒數第2、3個堿基引入另外一個或 者兩個錯配堿基，增加 ARMS引物的特異性。
[0044] 2、本發明技術的靈敏度可達1%，遠高于DNA直接測序15%的靈敏度；
[0045] 3、檢測過程為閉管反應，大大降低了污染及結果偏差的可能性；
[0046] 4、操作快速簡單，從樣本送檢到得到結果可在3個小時內完成。而直接測序法檢 測步驟繁瑣：送檢標本一提取DNA - PCR擴增一驗證PCR產物（電泳）一純化PCR產物一 直接測序一結果分析，其經過兩個PCR產物的電泳過程，污染幾率很大，不適合在醫院大規 模開展；
[0047] 5、判讀結果明確客觀，若需要時可對結果進行定量分析；
[0048] 6、高通量，一次可以檢測96個樣本；
[0049] 7、安全，整個體系中不包含有毒有害物質，無需PCR產物的后處理，對操作人員和 環境都無害。
[0050] 總之，與直接測序等基因分型的技術相比，本發明用于ABCB1基因分型有特異性 強、靈敏度高，操作簡單快速、高通量、判讀結果可靠，簡便等優勢。
【附圖說明】
[0051] 圖1為用ABCB1 ARMS-qPCR基因分型試劑盒檢測一抑郁癥患者ABCB1 3435位置 基因型的擴增曲線，經檢測，此樣本在3435位置的基因型為ABCB1 TT3435 ;
[0052] 圖2為用ABCB1 ARMS-qPCR基因分型試劑盒檢測正常人ABCB1 3435位置基因型 的擴增曲線，經檢測，此樣本在3435位置的基因型為ABCB1 CC3435 ;
[0053] 圖3為用ABCB1 ARMS-qPCR基因分型試劑盒檢測正常人ABCB1 3435位置基因型 的擴增曲線，經檢測，此樣本在3435位置的基因型為ABCB1 C/T3435。
【具體實施方式】
[0054] 以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0055] 收集100例抑郁癥患者和50例正常人的血樣，用ARMS-qPCR的方法對其ABCB1基 因3435位置進行分型。
[0056] 設計并篩選能特異檢測上述3種基因型的ARMS引物各一條及參照引物一條，設計 通用下游引物一條，設計并篩選TaqMan通用探針一條，各引物、探針的序列如下：
[0057] ABCB1-R :5, -AAACAGGAAGTGTGGCCAGA-3'
[0058] ABCB1-TaqMan :5, -FAM-CTCTCTTCAAATAAACAGCC-3'
[0059] ABCB1-C :5' -CCTATGGAGACAACAGCCGG-3'
[0060] ABCB1-F1 :5, -GTGGTGTCACAGGAAGAGGCT-3'
[0061] ABCB 1-F2 :5，-GTGGTGTCACAGGAAGAGGCC-3 '
[0062] 反應體系的優化：
[0063] (1)引物濃度的優化，在反應體系中其他條件相同的情況下，將引物濃度從 0. 1 μ M/L~1. 5 μ M/L作倍比連續稀釋，通過實驗結果的分析確定最佳濃度為0. 5 μ M/L。
[0064] (2)探針濃度的優化，在反應體系中其他條件相同的情況下，將引物濃度從 0. 05 μ M/L~0. 5 μ M/L作倍比連續稀釋，通過實驗結果的分析確定最佳濃度為0. 1 μ M/L。
[0065] (3)退火溫度的優化，在反應體系中其他條件相同的情況下，進行梯度 PCR(55°C~65°C )，通過實驗結果的分析確定最佳溫度為60°C。
[0066] (4)擴增反應Tag酶的優化，通過比較市場上的各種PCR擴增Tag酶，選取 Goldstar Best Tag 酶。
[0067] (5)優化后最終的反應體系為25 μ 1，包括qPCR混合反應液23 μ 1，參照引物和 ARMS 引物各 0· 5 μ 1 (終濃度 0· 5 μ M/L)，模板 DNA 1 μ 1 (終濃度 l-10ng/ μ 1)，qPCR mix 組 分及其終濃度為：
[0068]
[0069] ARMS-qPCR在ABI 7900檢測儀上檢測每個樣本進行3管反應，每管反應加入相同 的qPCR mix (即qPCR混合反應液），通用下游引物，TaqMan探針，各管所不同的是參照引物 或者ARMS引物。qPCR反應條件為：95°C預變性10min，95°C 15s，60°C lmin，擴增反應為46 個循環。
[0070] 結果為：100例抑郁癥患者中有79人為ABCB1基因 TT3435基因型，11人為T/ C3435,10人為CC3435基因型；50人正常人中有37人為CC3435型，9人為T/C3435基因型， 4人為TT3435基因型，經DNA直接測序驗證，完全與ARMS-qPCR結果一致。
[0071] 上述結果表明，本發明的ABCB1基因 ARMS-qPCR分型方法方法可靠，靈敏度高，操 作簡單，判讀結果客觀，利于大規模臨床開展。
[0072] 以上內容僅為本發明的較佳實施例，對于本領域的普通技術人員，依據本發明的 思想，在【具體實施方式】及應用范圍上均會有改變之處，本說明書內容不應理解為對本發明 的限制。
【主權項】
1. 一種用于ABCBl基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒，其特征在于：包括qPCR反應體 系，所述qPCR反應體系包括qPCR混合反應液、參照引物、ARMS引物和陽極對照樣品；所述 qPCR混合反應液包括PCR緩沖液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探針； 所述qPCR反應體系中，各組分的終濃度分別為：PCR緩沖液為IX ; dNTP為0. 1~ 1.5禮；1%(：12為0.5~51111汀&8酶為0.05~0.11]/^1屮0?下游引物為0.1~14]\1汀39]\&111 探針為0. 1~1 μ M ;參照引物為0. 5 μ M ;ARMS引物為0. 5 μ M ;陽性對照樣品為1~IOng/ μ 1 ; 所述PCR下游引物的序列如ABCBl-R所示； 所述TaqMan探針的序列如ABCBl-TaqMan所示； 所述參照引物的序列如ABCBl-C所示，能夠擴增所有不同ABCBl基因型； 所述ARMS引物為兩種上游引物中的任意一種，分別對應ABCB1CC3435、ΤΤ3435型基因 型，這兩種上游引物的序列如ABCB1-FUABCB1-F2所示；這兩種ARMS引物分別在3'末端與 不同的基因型堿基匹配，同時在其3'末端倒數第2、3位增加一個或者兩個堿基錯配，用于 特異性擴增的ABCB13435位基因型為TT/CC/TC ; 所述陽極對照樣品分別為ABCBl不同基因型堿基置換的質粒基因組DNA。2. 根據權利要求1所述的用于ABCBl基因分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒，其特征在于： 所述 Tag 酶為 Takara Tag 酶或 Goldstar Best Tag 酶。3. 基于權利要求1或2所述試劑盒的ABCBl基因分型ARMS-qPCR檢測方法，其特征在 于，包括如下步驟： (1) 設計并篩選含有ABCBl基因3435位不同基因型通用的參照引物、TaqMan探針及兩 種ARMS引物； (2) 從細胞體系或血液中提取到基因組DNA作為模板DNA ; (3) 進行實時熒光定量PCR擴增，每個樣本的檢測分3管進行，每個管加入相同的qPCR 混合反應液，TaqMan探針和模板DNA，每管分別加入參照引物和兩種ARMS引物中的一種，進 行ABCBl基因3435位基因分型的qPCR檢測； (4) 結果判讀： 參照引物管擴增曲線陽性，ABCBl-Fl管擴增曲線陽性，ABCB1-F2管擴增曲線陰性或者 其與參照引物管的擴增曲線ACT > 10,該樣本結果判定為3435TT基因型； 參照引物管擴增曲線陽性，ABCBl-Fl管擴增曲線陽性，ABCB1-F2管擴增曲線陽性，該 樣本結果判定為3435C/T基因型； 參照引物管擴增曲線陽性，ABCBl-Fl管擴增曲線陰性或者其與參照引物管的擴增曲線 ACT > 10, ABCB1-F2管擴增曲線陽性，該樣本結果判定為3435CC基因型； 參照引物管擴增曲線陰性，提示該樣本提取失敗，需要重新進行提取。4. 根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟（2)中，模板DNA選自人體 血液基因組DNA或者口腔黏膜脫落細胞或頭發。5. 根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述步驟（3)中，進行PCR擴增反應 的條件為，95°C預變性2min，95°C變性15s，60°C延伸lmin，46個循環。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886599SQ201410587532
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年10月20日
【發明人】張道允, 鞏子英, 張恒, 羅堅誠, 賈寧
【申請人】江蘇所羅門兄弟醫學科技有限公司