一種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法

一種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法，屬于生物檢測技術領域。該方法完全采用免培養(yǎng)的分子微生物生態(tài)學的方法，不需要分離菌株，并可對在原位的狀態(tài)下的人體腸道中蛋白質降解菌進行標定和追蹤。本發(fā)明以腸道蛋白質降解菌為標靶，作為人體長期的健康干預的定向指標，為定義和診斷人類腸道微生物功能菌群的穩(wěn)定性提供數據支持。同時，探測和標定腸道蛋白質降解菌，可發(fā)現人個體之間的生理性差異對宿主能量代謝響應的關系。本發(fā)明方法和以前的純培養(yǎng)方法比較，特點是快速，成本較低，操作簡便，操作人員不需要特殊的培訓，對檢測的地點無特殊的要求，實驗結果準確，能迅速提供給診斷人員相關的數據。
【專利說明】
一種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法。
【背景技術】
[0002]最新的研究表明，人類腸道中寄生著種類眾多的大量細菌，腸道是人類的另一個“器官”，腸道中微生物的組成和代謝與人類健康，如肥胖和糖尿病(II型)密切相關。研究復雜的人類腸道微生物群落的組成與功能及它們如何影響宿主的能量代謝、宿主對微生物群落變化的響應機制是一個新興前沿的研究領域。腸道菌群是人體的一個基本組成部分，對宿主的營養(yǎng)、健康和疾病存在多方面的影響。所有研究表明，腸道微生物的組成、豐度和功能，對宿主包括免疫系統(tǒng)的調控、營養(yǎng)供給及對抗病原菌的侵入具有重要的調節(jié)功能。例如人體的腸道菌群的組成和代謝能力，對于短鏈脂肪酸(SCFAs)對腸上皮細胞提供能量的提取量的營養(yǎng)價值有顯著的影響。但是，這種互惠互利的微生物關系由于遺傳或環(huán)境因素的干擾會導致穩(wěn)態(tài)擊穿和疾病。
[0003]作為獨立的個體，基于飲食習慣、身體狀況和基因等方面的原因，每個人的腸道微生物群落的組成各不相同。最近Nature上發(fā)表的一篇熱門文章根據人體腸道微生物的群落結構將人群分為了三大類型，每一種類型各以一種占優(yōu)勢地位的腸道微生物類群(屬水平)為特征:擬桿菌屬(Ba c i e r ο i c/ e s)，普雷沃菌屬(Pr和瘤胃球菌屬
。這種像血型一樣的簡潔分類將在個體醫(yī)療和疾病診斷方面具有重大意義。雖然這種分型還有很多不確定性，但是越來越多的研究表明，腸道中微生物的組成和代謝與人類健康密切相關，人體腸道微生物通過影響它們寄主的信號通路可能引發(fā)癌癥、代謝綜合征、甲狀腺病變等疾病，特別是對炎癥、肥胖、糖尿病(II型)起了關鍵作用。腸道微生物群落降解食物中人體不能消化的有機物(蛋白質、淀粉和脂肪)，以給人體提供附加的能量，從而影響了人體的能量平衡。糖尿病患者和非糖尿病對照人群腸道微生物群落的組成和功能不同，可能是導致糖尿病的病因之一。
[0004]對于為了長期的健康干預而用這些多樣的微生物作為標靶而言，定義和診斷人類腸道微生物功能菌群的穩(wěn)定性是至關重要的?，F有大部分用來分析在我們腸道微生物中的功能菌群都是采用基于純培養(yǎng)的方法，這使得他們能夠對這些細菌群落隨著時間的推移而呈現的穩(wěn)定性有所了解。例如Jeremiah J.Faith及其同事研發(fā)出了一種測序方法來準確追蹤這些菌株。他們用這種被稱作LEA-seq的方法對37人的糞便中的微生物群落進行了采樣，他們發(fā)現那些吃特別飲食而減肥的人的微生物株發(fā)生了改變，表明腸道微生物群的改變可作為宿主健康及功能的標志物。然而，目前所有的研究手段和方法都是在純培養(yǎng)的基礎上分離菌株，再進一步對具有特殊功能的菌株采用分子微生物生態(tài)學的方法進行研究。
[0005]但是對在原位(insitu)狀態(tài)下(不需要通過純培養(yǎng)分離菌株)，腸道蛋白質降解菌群在腸道營養(yǎng)物轉化過程中的作用及其機理卻了解很少，特別是標定特殊的腸道蛋白質降解菌群的方法還未開發(fā)出來。腸道微生物群落的基本功能是參與人體的營養(yǎng)物轉化，腸道中以短鏈脂肪酸產生為中心的碳水化合物代謝是腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)能量代謝的主要途徑，其中蛋白質的代謝在人體營養(yǎng)物轉化和能量代謝過程中起著重要作用，腸道微生物中的蛋白質降解菌群是最重要功能菌群之一，這是因為蛋白質降解是蛋白質代謝過程中的限制步驟。最近的自然雜志上發(fā)表了耶魯大學科學家的研究成果表明，一類研究中蛋白質(稱為inflammasomes，負責開啟免疫系統(tǒng)的炎癥反應，并且起到腸道細菌的傳感器和調控者的作用)導致的腸道微生物群落失調，可增加腸道疾病如結腸炎，而腸道環(huán)境的改變最終會導致肥胖和肝臟疾病。由于缺少系統(tǒng)的有關參與腸道蛋白質代謝的微生物菌群的原位信息，對腸道微生物在人體蛋白質代謝過程中的作用的了解主要通過純培養(yǎng)研究，但是，人類腸道微生物群落中只有少數(〈20%)被純培養(yǎng)，而且通過純培養(yǎng)研究得到的微生物生理生化信息不一定能反映微生物在復雜的生態(tài)系統(tǒng)原位的作用和功能，所以人體腸道大部分功能菌群處于未知的狀態(tài)。
[0006]采用免培養(yǎng)的分子微生物生態(tài)學方法和手段(BODIPYBSA染色)來標定和追蹤原位狀態(tài)下人體腸道蛋白質降解菌群，不僅對于定義和診斷人類腸道微生物功能菌群的穩(wěn)定性具有重要的意義，而且為進一步了解腸道蛋白質降解菌群在人體營養(yǎng)物代謝中的利用及轉化中的作用和功能，獲取原位腸道蛋白質降解菌群的組成和結構的原位信息，了解蛋白質降解菌群與人體之間在腸道營養(yǎng)物的利用和轉化中的生態(tài)學關系，為進一步探索腸道蛋白質降解菌群在人體代謝疾病發(fā)生中的作用機理奠定基礎。
[0007]研究復雜生態(tài)系統(tǒng)中微生物菌群的功能一直是微生物生態(tài)學者面臨的挑戰(zhàn)，而其中的難點在于開發(fā)和使用能客觀反應微生物菌群在生態(tài)系統(tǒng)中原位功能的分子微生物生態(tài)學方法(Head etal.，1998)。迄今為止我們還未見用原位分子微生物生態(tài)學方法研究人體腸道微生物群落(例如:蛋白質降解菌群在營養(yǎng)物的利用和轉化中的作用的報道，本發(fā)明將提供代謝疾病(糖尿病患者)腸胃微生物群落中的蛋白質降解菌群的結構及其營養(yǎng)功能的原位信息。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法，該方法完全采用免培養(yǎng)的分子微生物生態(tài)學的方法，不需要分離菌株，并可對在原位狀態(tài)下的人體腸道中蛋白質降解菌進行標定和追蹤。本發(fā)明以腸道蛋白質降解菌為標靶，可以作為人體長期的健康干預的定向指標，為定義和診斷人類腸道微生物功能菌群的穩(wěn)定性提供數據支持。同時，探測和標定腸道蛋白質降解菌，可發(fā)現人個體之間的生理性差異對宿主能量代謝響應的關系。
[0009]為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:
一種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法，包括如下步驟:
步驟(I)，在無菌條件下收集糞便中的總細菌:
(1.1)樣品采集:用無菌藥勺隨機采集人體新鮮糞便在無菌袋中后，立即保存于37°C的保溫箱中，并于20分鐘內送到實驗室處理；
(I.2)稀釋樣品:取新鮮糞便，加入到pH 7.0-8.0為I X PBS緩沖液，混勻;所述的新鮮糞便與1\?83緩沖液的質量體積比胃/^=(0.95-1.05):3.5;
(1.3)勻漿過濾:將步驟(1.2)混勻的液體轉入到B1-Rad勻漿袋中，然后置于B1-Rad勻漿器中勻漿，勻漿后，將勻漿袋中的液體通過勻漿袋側邊的過濾格過濾，取濾液；
(1.4)濾液離心:將步驟(1.3)的濾液置于離心管中，離心，去除上清液；
(1.5)收集細菌細胞:將步驟(1.4)得到的去除上清液的物質重新懸浮于pH為7.0-8.0的I XPBS緩沖液中，得到細胞懸浮液，然后儲存于4°C下，待用;本步驟重懸所用的I XI3BS緩沖液是步驟(1.2)所用的I XPBS緩沖液體積的13-15%;步驟(2)，蛋白質降解細菌的標定和示蹤:
(2.1)細胞懸浮液離心:取400yL-1000yL的步驟(1.5)制得的細胞懸浮液，離心，去除上清液；
(2.2)染色:向加入步驟(1.4)得到的去除上清液的物質中依次加入濃度為10-1OOmM、pH為7.8-8.0的I X Tris-HCl緩沖液和BODIPY標記的綠色熒光小牛血清白蛋白染液，得到混合液體，之后立即將混合液體轉入到寬底血清瓶中，以保證混合液體與綠色熒光小牛血清白蛋白染液充分混合，隨后向混合液體中加入疊氮化鈉至最終濃度為3 mM，接著加入氟乙酸鈉至最終濃度為2mM，再加入碘代乙酰胺鈉至最終濃度為4mM，蓋子蓋好，并迅速用鋁箔包嚴避光；
其中，所述的I XTris-HCl緩沖液的體積與步驟(2.1)所取的細胞懸浮液體積相同；所用的BODIPY標記的綠色熒光小牛血清白蛋白染液的體積是I XTris-HCl緩沖液體積的一半；
(2.3)培養(yǎng):將步驟(2.2)得到的鋁箔包嚴避光的血清瓶固定在旋轉搖床上，于25-35°C下，搖動30-60分鐘，速度保持在220-280 R.P.M；
(2.4)觀察樣品的預處理:于暗室中，吸取10-20yL步驟(2.3)培養(yǎng)得到的液體，均勻涂布于帶有明膠涂層的載玻片上，并在黑暗的環(huán)境中風干10-20分鐘；
(2.5)觀察:將步驟(2.4)干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡物鏡臺上100X的物鏡下，通過綠色熒光激發(fā)塊觀察，顯示綠色熒光的即為蛋白質降解細菌。
[0010]進一步，優(yōu)選的是，所述的步驟(1.3)中勻漿，采用B1-Rad勻漿器，以5000-10000R.P.M勻漿8-15 min。
[ΟΟ?? ] 進一步，優(yōu)選的是，所述的步驟(1.4)中所述的離心具體是4500g-5000g離心5-20
mino
[0012]進一步，優(yōu)選的是，所述的步驟(2.1)中所述的離心具體是4000-5000g離心10-20分鐘。
[0013]本發(fā)明方法的部分原理如下:
1.BODIPY BSA染色法原理:
Thermo Fisher Scientific公司的BODIPY FL BSA綠色焚光染液主要用于測量液體中絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶和巰基蛋白酶的活力，本專利申請的創(chuàng)新之處在于把它用于標記混合微生物樣品，如人體糞便中的細胞壁質間具有絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶和巰基蛋白酶的單個蛋白質降解細菌。其原理為:帶有熒光的有機大分子BODIPY (boron-dipyrromethene)與小牛血清白蛋白相結合，使BODIPY中的綠色焚光被包裹在結合物的內部，使其在熒光顯微鏡觀察不到，而一旦它被細胞質壁間的絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶和巰基蛋白酶水解，就釋放出帶有熒光的短片段水解產物，這些水解產物沉積在有相關酶活力的細菌細胞壁周圍，于是在熒光顯微鏡下可觀察到被熒光標記的單個具有特定蛋白酶活性的細胞，即被熒光標記的細胞能分泌絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶和巰基蛋白酶，所以呈現熒光的細胞被稱為蛋白質降解細菌。
[0014]排除染色過程中的假陽性:
為了區(qū)分具有水解酶活性與沒有水解酶活性但能吸收水解產物的細胞(錯誤標記)，在培養(yǎng)中我們加入了各種電子傳遞鏈抑制劑以保證結果的可靠性，具體實驗步驟和使用的化學藥品請參閱在蛋白酶染色培養(yǎng)過程中。其原理是微生物菌群會水解或發(fā)酵加入的標記化學物(B0DIPY標記的小牛血清白蛋白)，因此能吸收帶有標記的代謝產物的所有細胞也都會被標記，那么我們在熒光顯微鏡下看到的呈現熒光的細胞，可能是兩類細菌:蛋白質降解細菌和吸收帶有熒光標記的小牛血清白蛋白的水解產物的細菌，而加入電子傳遞鏈抑制劑的目的是為了抑制細菌吸收帶有熒光標記的小牛血清白蛋白的水解產物，防止由于主動吸收帶有熒光標記物的水解產物而導致的假陽性，保證了所觀察到的帶有熒光標記的細菌全部都是蛋白質降解細菌。
[0015]此外，為了得到最優(yōu)化的培養(yǎng)時間，以保證最大限度的觀察蛋白酶的活性和標定蛋白質降解細菌，
【申請人】用不同的樣品(搜集10個普通人的糞便)，分別測試了不同的培養(yǎng)時間，從10分鐘開始，以后每隔10分鐘觀察一次，直到2個小時。所觀察到的細菌保持同樣的現狀，只是熒光強度有所區(qū)別。經過用軟件Image J分析和對比圖片，發(fā)現從培養(yǎng)30分鐘所取的樣品，能觀察到最強的熒光信號。
[0016]本發(fā)明與現有技術相比，其有益效果為:
本發(fā)明申請開發(fā)了一種從復雜微生物生態(tài)系統(tǒng)混合微生物群落中示蹤和標定蛋白質水解菌群的手段，由于以前研究人體腸道功能菌群的方法都是通過純培養(yǎng)首先分離菌株，然后在此基礎上，對每一株細菌進行生理，生化研究。這些研究耗時，成本較高，操作過程復雜，特別是操作人員需要接受特殊的培訓，才能完成對細菌鑒定的任務。此發(fā)明申請手段和以前的純培養(yǎng)方法比較，特點是較大地縮短了降低勞動強度(勞動強度降低了 50%)，成本較低(成本減少了60%)，操作過程簡便，操作人員不需要特殊的培訓，對檢測的地點無特殊的要求，實驗結果準確，能迅速提供給診斷人員相關的數據。
[0017]本發(fā)明申請?zhí)峁┑囊环N快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法可用于探索人類疾病產生的原理，為科學的認識人體代謝疾病提供科學的指導，特別是為提供新的治療手段，提供科學依據。檢測糞便中微生物功能菌群的組成將是人類疾病診斷和健康評估的重要內容之一。本發(fā)明申請描述了一種示蹤人類糞便中蛋白質水解細菌的方法。
[0018]本發(fā)明申請開發(fā)了從復雜微生物生態(tài)系統(tǒng)混合微生物群落中示蹤和標定蛋白質水解菌群的手段，此手段和以前的純培養(yǎng)方法比較，特點是快速，成本較低，操作簡便，操作人員不需要特殊的培訓，對檢測的地點無特殊的要求，實驗結果準確，能迅速提供給診斷人員相關的數據。
【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法的流程示意圖；
圖2是新鮮人體糞便微生物群落中綠色熒光小牛血清白蛋白染色陽性蛋白質降解微生物顯微照片圖；
圖3是預處理后的人體糞便樣品微生物群落中綠色熒光小牛血清白蛋白染色陽性蛋白質降解微生物顯微照片圖。
[0020]其中，圖2和圖3中箭頭所指的細菌即為蛋白質水解細菌。
【具體實施方式】
[0021 ]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0022]本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產品。
[0023]本發(fā)明所采用的帶有明膠涂層的載玻片為帆船牌，型號為CAT.N0.7101，購自濟南萬德廣聯(lián)醫(yī)療器械有限責任公司。
[0024]實施例1
一種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法，其流程如圖1所示，包括如下步驟: 步驟(I)，在無菌條件下收集糞便中的總細菌:
(1.1)樣品采集:用無菌藥勺隨機采集人體新鮮糞便在無菌袋中后，立即保存于37°C的保溫箱中，并于20分鐘內送到實驗室處理；
(1.2)稀釋樣品:取新鮮糞便1g，加入到pH7.0為I X PBS緩沖液，混勻;所述的新鮮糞便與I XPBS緩沖液的質量體積比W/V=0.95:3.5；
(1.3)勻漿過濾:將步驟(1.2)混勻的液體轉入到B1-Rad勻漿袋中，然后置于B1-Rad勻漿器中以5000R.P.M勻漿8min，勻漿后，將勻漿袋中的液體通過勻漿袋側邊的過濾格過濾，取濾液；
(1.4)濾液離心:將步驟(1.3)的濾液置于離心管中，4500g離心5min，去除上清液；
(1.5)收集細菌細胞:將步驟(1.4)得到的去除上清液的物質重新懸浮于pH為7.0的IXPBS緩沖液中，得到細胞懸浮液，然后儲存于4°C下，待用；本步驟重懸所用的I XPBS緩沖液是步驟(1.2)所用的I XPBS緩沖液體積的13%;
步驟(2)，蛋白質降解細菌的標定和示蹤:
(2.1)細胞懸浮液離心:取400yL的步驟(1.5)制得的細胞懸浮液，4000離心10分鐘，去除上清液；
(2.2)染色:向加入步驟(1.4)得到的去除上清液的物質中依次加入濃度為10mM、pH為7.8的I X Tris-HCl緩沖液和BODIPY標記的綠色熒光小牛血清白蛋白染液，得到混合液體，之后立即將混合液體轉入到寬底血清瓶中，以保證混合液體與綠色熒光小牛血清白蛋白染液充分混合，隨后向混合液體中加入疊氮化鈉至最終濃度為3 mM，接著加入氟乙酸鈉至最終濃度為2mM，再加入碘代乙酰胺鈉至最終濃度為4mM，蓋子蓋好，并迅速用鋁箔包嚴避光；
其中，所述的I XTris-HCl緩沖液的體積與步驟(2.1)所取的細胞懸浮液體積相同；所用的BODIPY標記的綠色熒光小牛血清白蛋白染液的體積是I XTris-HCl緩沖液體積的一半；
(2.3)培養(yǎng):將步驟(2.2)得到的鋁箔包嚴避光的血清瓶固定在旋轉搖床上，于25°C下，搖動30分鐘，速度保持在220R.P.M;
(2.4)觀察樣品的預處理:于暗室中，吸取1yL步驟(2.3)培養(yǎng)得到的液體，均勻涂布于帶有明膠涂層的載玻片上，并在黑暗的環(huán)境中風干10分鐘；
(2.5)觀察:將步驟(2.4)干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡物鏡臺上100 X的物鏡下，通過綠色熒光激發(fā)塊觀察，顯示綠色熒光的即為蛋白質降解細菌。
[0025]實施例2
一種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法，包括如下步驟:
步驟(I)，在無菌條件下收集糞便中的總細菌:
(1.1)樣品采集:用無菌藥勺隨機采集人體新鮮糞便在無菌袋中后，立即保存于37°C的保溫箱中，并于20分鐘內送到實驗室處理；
(I.2)稀釋樣品:取新鮮糞便20 g，加入到pH 8.0為I X PBS緩沖液，混勻;所述的新鮮糞便與I XPBS緩沖液的質量體積比W/V=l.05:3.5；
(1.3)勻漿過濾:將步驟(1.2)混勻的液體轉入到B1-Rad勻漿袋中，然后置于B1-Rad勻漿器中以10000R.P.M勻漿15 min，勻漿后，將勻漿袋中的液體通過勻漿袋側邊的過濾格過濾，取濾液；
(1.4)濾液離心:將步驟(1.3)的濾液置于離心管中，5000g離心20min，去除上清液；
(1.5)收集細菌細胞:將步驟(1.4)得到的去除上清液的物質重新懸浮于pH為8.0的IXPBS緩沖液中，得到細胞懸浮液，然后儲存于4°C下，待用；本步驟重懸所用的I XPBS緩沖液是步驟(1.2)所用的I XPBS緩沖液體積的15%;
步驟(2)，蛋白質降解細菌的標定和示蹤:
(2.1)細胞懸浮液離心:取100yL的步驟(1.5)制得的細胞懸浮液，5000g離心20分鐘，去除上清液；
(2.2)染色:向加入步驟(1.4)得到的去除上清液的物質中依次加入濃度為100mM、pH為8.0的I X Tris-HCl緩沖液和BODIPY標記的綠色熒光小牛血清白蛋白染液，得到混合液體，之后立即將混合液體轉入到寬底血清瓶中，以保證混合液體與綠色熒光小牛血清白蛋白染液充分混合，隨后向混合液體中加入疊氮化鈉至最終濃度為3 mM，接著加入氟乙酸鈉至最終濃度為2mM，再加入碘代乙酰胺鈉至最終濃度為4mM，蓋子蓋好，并迅速用鋁箔包嚴避光；
其中，所述的I XTris-HCl緩沖液的體積與步驟(2.1)所取的細胞懸浮液體積相同；所用的BODIPY標記的綠色熒光小牛血清白蛋白染液的體積是I XTris-HCl緩沖液體積的一半；
(2.3)培養(yǎng):將步驟(2.2)得到的鋁箔包嚴避光的血清瓶固定在旋轉搖床上，于35°C下，搖動60分鐘，速度保持在280R.P.M;
(2.4)觀察樣品的預處理:于暗室中，吸取20yL步驟(2.3)培養(yǎng)得到的液體，均勻涂布于帶有明膠涂層的載玻片上，并在黑暗的環(huán)境中風干20分鐘；
(2.5)觀察:將步驟(2.4)干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡物鏡臺上100X的物鏡下，通過綠色熒光激發(fā)塊觀察，顯示綠色熒光的即為蛋白質降解細菌。
[0026]
實施例3
一種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法，包括如下步驟:
步驟(I)，在無菌條件下收集糞便中的總細菌:
(1.1)樣品采集:用無菌藥勺隨機采集人體新鮮糞便在無菌袋中后，立即保存于37°C的保溫箱中，并于20分鐘內送到實驗室處理；
(1.2)稀釋樣品:取新鮮糞便15g，加入到pH7.5為I XPBS緩沖液，混勻;所述的新鮮糞便與I XPBS緩沖液的質量體積比W/V=l:3.5；
(1.3)勻漿過濾:將步驟(1.2)混勻的液體轉入到B1-Rad勻漿袋中，然后置于B1-Rad勻漿器中以8000R.P.M勻漿1min，勻漿后，將勻漿袋中的液體通過勻漿袋側邊的過濾格過濾，取濾液；
(1.4)濾液離心:將步驟(1.3)的濾液置于離心管中，4700g離心10min，去除上清液；
(1.5)收集細菌細胞:將步驟(1.4)得到的去除上清液的物質重新懸浮于pH為7.5的IXPBS緩沖液中，得到細胞懸浮液，然后儲存于4°C下，待用；本步驟重懸所用的I XPBS緩沖液是步驟(1.2)所用的I XPBS緩沖液體積的14%;
步驟(2)，蛋白質降解細菌的標定和示蹤:
(2.1)細胞懸浮液離心:取700yL的步驟(1.5)制得的細胞懸浮液，4500g離心15分鐘，去除上清液；
(2.2)染色:向加入步驟(1.4)得到的去除上清液的物質中依次加入濃度為50mM、pH為7.9的I X Tris-HCl緩沖液和BODIPY標記的綠色熒光小牛血清白蛋白染液，得到混合液體，之后立即將混合液體轉入到寬底血清瓶中，以保證混合液體與綠色熒光小牛血清白蛋白染液充分混合，隨后向混合液體中加入疊氮化鈉至最終濃度為3 mM，接著加入氟乙酸鈉至最終濃度為2mM，再加入碘代乙酰胺鈉至最終濃度為4mM，蓋子蓋好，并迅速用鋁箔包嚴避光；
其中，所述的I XTris-HCl緩沖液的體積與步驟(2.1)所取的細胞懸浮液體積相同；所用的BODIPY標記的綠色熒光小牛血清白蛋白染液的體積是I XTris-HCl緩沖液體積的一半；
(2.3)培養(yǎng):將步驟(2.2)得到的鋁箔包嚴避光的血清瓶固定在旋轉搖床上，于30°C下，搖動45分鐘，速度保持在260R.P.M;
(2.4)觀察樣品的預處理:于暗室中，吸取16yL步驟(2.3)培養(yǎng)得到的液體，均勻涂布于帶有明膠涂層的載玻片上，并在黑暗的環(huán)境中風干14分鐘；
(2.5)觀察:將步驟(2.4)干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡物鏡臺上100X的物鏡下，通過綠色熒光激發(fā)塊觀察，顯示綠色熒光的即為蛋白質降解細菌。
[0027]實施例4
本實施例中將采用新鮮人體糞便細胞樣品標定腸道蛋白質降解菌。本發(fā)明方法流程圖如圖1所示。
[0028]—種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法，包括如下步驟:
步驟(I)，在無菌條件下收集糞便中的總細菌:
(1.1)樣品采集:用無菌藥勺隨機采集人體新鮮糞便(或者根據診斷的具體要求和目的，采集特殊的病人新鮮糞便)裝在無菌袋中，糞便在采樣現場后，立即保存于37°C的保溫瓶中(相似于人體的正常體溫)，并于20分鐘內送到實驗室處理；
(1.2)稀釋樣品:用無菌的50ml燒杯稱取10g新鮮糞便，加入35毫升I XPBS緩沖液(pH7.0)，混勻；
(1.3)洗脫細胞:將混勻的液體轉入到B1-Rad勻漿袋中，在B1-Rad勻漿器高速檔(5000 R.P.M)勻漿8分鐘，通過勻漿袋側邊的過濾格過濾； (1.4)收集濾液:將濾液收集在無菌的50ml離心管中，離心(5000g) 15分鐘；
(1.5)收集沉淀物(細菌細胞):去除上清液，并將沉淀物重新懸浮于5ml的I XPBS緩沖液(pH7.0)中，待用。在等待下一步的實驗過程中，可將細胞懸浮液儲存于4°C的冰箱中。
[0029]步驟(2)，蛋白質降解細菌的標定和示蹤:
(2.1)取40(^1^細胞懸浮液(從上一步中獲得)轉入2mL eppendof離心管中，離心(4500g)10 分鐘；
(2.2)去除上清液，加入40(^1^I 父1^8-!1(:1緩沖液(10111]\1，？!17.8)，再加入20(^1^BODIPY (boron-dipyrromethene)標記的綠色焚光小牛血清白蛋白BSA染液[購自ThermoFisher Scientif ic]，立即將混合液體轉入到1ml的寬底血清瓶中，隨后加入3種電子傳遞鏈抑制劑[最終濃度分別為疊氮化鈉3mM，氟乙酸鈉2mM，碘代乙酰胺鈉4mM，按照總反應體積600yL計算]，蓋子蓋好，并迅速用鋁箔包嚴避光；
(2.3)將包裹好的血清瓶固定在旋轉搖床上室溫搖動30分鐘，速度保持在220r.P.m;
(2.4)將血清瓶轉移到暗室，打開血清瓶，吸取1yL均勻涂布于用明膠涂層的載玻片上，并在黑暗的環(huán)境中風干20分鐘；
(2.5)將干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡物鏡臺上100X的物鏡下，通過綠色熒光激發(fā)塊觀察，蛋白質降解細菌呈現綠色熒光(如圖2中箭頭所指示的細菌)。本方法可用于示蹤人體糞便中細胞壁質間的具有蛋白酶活性的蛋白質水解細菌。
[0030]對比實驗
同時，
【申請人】為了證明所觀察到的是原位狀態(tài)下蛋白酶的活性，而不是經過誘導產生的蛋白酶，做了預培養(yǎng)實驗，具體如下:
預處理:用10人(搜集10個普通人的糞便)10g新鮮的人體糞便樣品，分別加入35毫升IXI3BS緩沖液(pH 7.0)，混勻;加入沒有標記的小牛血清白蛋白(BSA 5g)，在有氧條件下，置于旋轉搖床上室溫搖動，速度保持在220 r.p.m，進行誘導和加強蛋白酶活性的培養(yǎng)，當樣品培養(yǎng)到I小時、4小時和12小時，分別取樣并保存于4°C的冰箱中，得到3個預處理樣品。
[0031]在無菌條件下收集糞便中的總細菌以及蛋白質降解細菌的標定和示蹤:將3個預處理樣品重復新鮮樣品的收集總細胞的過程，染色的實驗過程(即預處理后，采用與本發(fā)明實施例4完全相同的方法)。
[0032]經檢測，觀察到的蛋白質水解細菌的形狀(如圖3中箭頭所指示的細菌)相同于未經過預處理的新鮮樣品的蛋白質水解細菌(如圖2中箭頭所指示的細菌)，從而證明了用BODIPY FL BSA(小牛血清白蛋白)標定的蛋白質降解細菌表現出來的蛋白活性并不需要誘導，探測到的是在原位狀態(tài)下的人體腸道蛋白質降解細菌本身攜帶的蛋白酶。
[0033]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
【主權項】
1.一種快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟(I)，在無菌條件下收集糞便中的總細菌: (1.1)樣品采集:用無菌藥勺隨機采集人體新鮮糞便在無菌袋中后，立即保存于37°C的保溫箱中，并于20分鐘內送到實驗室處理； (1.2)稀釋樣品:取新鮮糞便，加入到pH7.0-8.0為I XPBS緩沖液，混勻;所述的新鮮糞便與1\?83緩沖液的質量體積比胃/^=(0.95-1.05):3.5; (1.3)勻漿過濾:將步驟(1.2)混勻的液體轉入到B1-Rad勻漿袋中，然后置于B1-Rad勻漿器中勻漿，勻漿后，將勻漿袋中的液體通過勻漿袋側邊的過濾格過濾，取濾液； (1.4)濾液離心:將步驟(1.3)的濾液置于離心管中，離心，去除上清液； (I.5)收集細菌細胞:將步驟(1.4)得到的去除上清液的物質重新懸浮于pH為7.0-8.0的I XPBS緩沖液中，得到細胞懸浮液，然后儲存于4°C下，待用;本步驟重懸所用的I XI3BS緩沖液是步驟(1.2)所用的I XPBS緩沖液體積的13-15%; 步驟(2)，蛋白質降解細菌的標定和示蹤: (2.1)細胞懸浮液離心:取400yL-1000yL的步驟(1.5)制得的細胞懸浮液，離心，去除上清液； (2.2)染色:向加入步驟(1.4)得到的去除上清液的物質中依次加入濃度為10-100mM、pH為7.8-8.0的I X Tris-HCl緩沖液和BODIPY標記的綠色熒光小牛血清白蛋白染液，得到混合液體，之后立即將混合液體轉入到寬底血清瓶中，以保證混合液體與綠色熒光小牛血清白蛋白染液充分混合，隨后向混合液體中加入疊氮化鈉至最終濃度為3 mM，接著加入氟乙酸鈉至最終濃度為2mM，再加入碘代乙酰胺鈉至最終濃度為4mM，蓋子蓋好，并迅速用鋁箔包嚴避光； 其中，所述的I XTris-HCl緩沖液的體積與步驟(2.1)所取的細胞懸浮液體積相同；所用的BODIPY標記的綠色熒光小牛血清白蛋白染液的體積是I XTris-HCl緩沖液體積的一半； (2.3)培養(yǎng):將步驟(2.2)得到的鋁箔包嚴避光的血清瓶固定在旋轉搖床上，于25-35°C下，搖動30-60分鐘，速度保持在220-280 R.P.M； (2.4)觀察樣品的預處理:于暗室中，吸取10-20yL步驟(2.3)培養(yǎng)得到的液體，均勻涂布于帶有明膠涂層的載玻片上，并在黑暗的環(huán)境中風干10-20分鐘； (2.5)觀察:將步驟(2.4)干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡物鏡臺上100X的物鏡下，通過綠色熒光激發(fā)塊觀察，顯示綠色熒光的即為蛋白質降解細菌。2.根據權利要求1所述的快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法，其特征在于，所述的步驟(1.3)中勻漿，采用B1-Rad勻漿器，以5000-10000 R.P.M勻漿8-15 min。3.根據權利要求1所述的快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法，其特征在于，步驟(1.4)中所述的離心具體是4500g_5000g離心5-20 min。4.根據權利要求1所述的快速檢測人體糞便中蛋白質水解細菌的方法，其特征在于，步驟(2.1)中所述的離心具體是4000-5000g離心10-20分鐘。
【文檔編號】C12Q1/04GK105886595SQ201610278619
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】夏云, 孔云虹, 黃鶴平, 王定康, 董寶財
【申請人】夏云