制備作為用于制備天然調味劑的原材料的imp 發酵液或谷氨酸發酵液的方法
【專利摘要】本發明涉及制備天然中性調味劑的方法，更具體地，涉及使用通過兩步發酵法制備的肌苷?5’?單磷酸鹽(IMP)發酵液或谷氨酸發酵液來制備天然中性調味劑的方法，所述兩步發酵法包括用于真菌發酵的第一發酵步驟和用于細菌發酵的第二發酵步驟，本發明涉及通過該方法制備的天然中性調味劑以及包含該天然中性調味劑的食品組合物。根據本發明的方法制備的天然中性調味劑使用天然原材料制備，因此對于用于人體而言是無害且安全的，并且可以添加到食品以產生純正且溫和的味道并改善食品滋味。
【專利說明】
制備作為用于制備天然調味劑的原材料的IMP發酵液或谷氨 酸發酵液的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及制備天然中性調味劑的方法，更具體地，涉及使用通過兩步發酵法制 備的肌苷-5'-單磷酸鹽（IMP)發酵液或谷氨酸發酵液來制備天然中性調味劑的方法，所述 兩步發酵法包括用于真菌發酵的第一發酵步驟和用于細菌發酵的第二發酵步驟，本發明涉 及通過該方法制備的天然中性調味劑以及包含該天然中性調味劑的食品組合物。
【背景技術】
[0002] 氨基酸和肽用作調味劑組分。近年來，以多種方式開發出通過用微生物（例如真 菌、桿菌、乳酸菌或酵母)發酵植物蛋白質源(例如大豆、小麥或玉米)并水解發酵產物而提 取的包含氨基酸和肽的天然調味材料。
[0003] 通常，已開發出下述技術，其通過增加植物蛋白質源的水解度來改善提取的味道 組分(氨基酸和肽)或者通過增加質量方面的產率來增加價格競爭力。然而，當僅使用植物 蛋白質源時，不利之處在于在所得的調味材料中不存在核酸組分，因此調味材料的鮮味強 度弱。此外，為了增加調味材料的經濟價值，需要調味材料包含谷氨酸和諸如肌苷單磷酸鹽 (HIP)或鳥苷單磷酸鹽(GMP)的核酸。
[0004] 近年來，為了克服植物蛋白水解產物的上述缺陷，已經廣泛使用諸如酵母提取物 的天然的含核酸的材料。然而，酵母提取物可能由于其特殊發酵氣味造成的異味（off-flavor) 和臭味 (off-odor) 而對加工的食品的固有滋味產生不利影響 ，并且其核酸含量有 限（最大核酸含量:20%)。此外，與諸如谷氨酸單鈉(MSG)、核酸IG或水解植物蛋白質(HVP) 的常用調味材料相比，在天然加工的食品中使用的植物蛋白物質與酵母提取物的混合物具 有低的價格競爭力。
[0005] 同時，MP連同GMP是廣泛用作食品調味添加劑的物質。當IMP明確與谷氨酸單鈉 (MSG)-起使用時，其具有改善味道的顯著能力。因此，IMP是作為調味物質而受到關注的基 于核酸的調味物質。
[0006] 發酵MP和GMP以用作調味物質的方法包括降解酵母RNA的方法，以及在制備肌苷 和鳥苷之后通過兩個步驟(發酵和化學磷酸化)來制備IMP和GMP的方法。然而，近年來，在包 括歐洲在內的多個國家中，已經加強了對天然調味劑的標準，并且規程變得更嚴格，因此， 并非僅由天然組分制成而是通過進行化學過程或添加額外的組分而制備的調味劑不被認 為是天然調味劑。對此，應使用由細菌直接發酵糖的方法來制備天然核酸組分。
[0007] 在這樣的情形下，本發明人已進行了廣泛的嘗試以在不進行任何化學過程的情況 下制備不含額外的組分的天然調味劑，因此已發現，當使用通過包括用于酵母發酵的第一 發酵步驟和用于細菌發酵的第二發酵步驟的兩步發酵法產生的IMP或谷氨酸發酵液時，甚 至當僅將該發酵液用于后續反應時，可以產生多種有效的滋味，由此完成了本發明。
【發明內容】
[0008] 技術問題
[0009] 本發明的目的是提供制備不含額外的組分的天然中性調味劑的方法，其不進行任 何化學方法并使用通過用于真菌發酵的第一發酵步驟和用于細菌發酵的第二發酵步驟制 備的肌苷-5'-單磷酸鹽αΜΡ)發酵液或谷氨酸發酵液。
[0010] 本發明的另一目的是提供通過上述方法制備的天然中性調味劑。
[0011] 本發明的又一目的是提供包含上述天然中性調味劑的食品組合物。
[0012]技術方案
[0013] 為了實現上述目的，在一個方面，本發明提供了制備天然中性調味劑的方法，所述 方法包括步驟：（a)用真菌發酵植物蛋白質源以獲得谷物發酵液；（b)用細菌發酵所述谷物 發酵液以制備肌苷-5 單磷酸鹽αΜΡ)發酵液和谷氨酸發酵液；（c)電滲析所述頂P發酵液； 以及(d)將步驟(b)的所述谷氨酸發酵液與步驟(c)的所述頂Ρ發酵液混合。
[0014] 圖1示意地示出本發明的制備天然調味劑的方法。
[0015] 具體地，谷氨酸發酵液、頂P發酵液和谷物發酵液通過用于真菌發酵的第一發酵步 驟和用于細菌發酵的第二發酵步驟制備，并且經歷其中反應或處理適于每一調味劑的第三 步驟，由此制備每一天然調味劑。
[0016] 因此，本發明的特征在于用作制備天然調味劑的原材料的天然IMP發酵液和谷氨 酸發酵液通過兩步發酵法制備，所述兩步發酵法包括用于真菌發酵的第一發酵步驟和用于 細菌發酵的第二發酵步驟。
[0017] 用于真菌發酵的第一發酵步驟是使用蛋白質源產生肽和氨基酸的步驟。當僅進行 用于真菌發酵的第一發酵步驟時，可以產生大量的肽和氨基酸，因此可以產生可用作調味 劑的谷氨酸。然而，不利之處在于不能產生可給予鮮味的諸如IMP或鳥苷單磷酸鹽(GMP)的 核酸物質。此外，問題在于，當使用植物蛋白質源時，其僅經歷蛋白水解過程，因此可以產生 的肽和氨基酸取決于蛋白質源中的蛋白質的濃度或含量。例如，當使用豆類時，產生的發酵 液中的谷氨酸的含量會小于10%，而當使用小麥面筋時，產生的發酵液中的谷氨酸的含量 會小于15%。
[0018] 同時，用于細菌發酵的第二發酵步驟是制備核酸和谷氨酸發酵液的步驟。當僅進 行用于細菌發酵的第二發酵步驟時，可以有效地產生核酸和谷氨酸，但不足之處在于以小 于1%的濃度產生其他氨基酸和肽的含量，因此使用細菌的發酵液不能用作調味劑，盡管其 具有良好的鮮味。換言之，不足之處在于，為了將僅通過細菌發酵獲得的發酵液用作調味 劑，需要向發酵液添加額外的組分，以使發酵液可以應用于食品。
[0019] 因此，本發明人已經開發出在不添加任何額外的組分并且不進行任何化學過程的 情況下，通過僅使用制備的發酵液來制備天然調味劑并同時克服真菌發酵法和細菌發酵法 的缺點的方法。
[0020] 為了使用兩步發酵法制備核酸和谷氨酸發酵液，需要多種礦物鹽、氨基酸和維生 素以及碳源和氮源。特別地，在現有技術中，將酵母提取物或水解植物蛋白質(HVP)用作氮 源，但在該情況下，不足之處在于所得的發酵液具有異味和臭味，并且產率略低。此外，所得 的培養液中調味組分的含量以及整體滋味根據用于細菌發酵的各種材料而顯著不同。因 此，在本發明中，通過真菌發酵(第一發酵步驟)獲得并可包含多種氨基酸和肽的谷物發酵 液(谷物蛋白水解產物)在用作氮源的同時用作用于細菌發酵的第二發酵步驟所用的底物。
[0021] 在使用細菌制備核酸或MSG的常規方法中，僅高度重視提高培養液中核酸和MSG的 濃度及其產率。這種提高有效地增加了鮮味，但在一些情況下，其對所得的調味物質的滋味 有不利影響。然而，通過使用本發明的3個步驟制備的多種天然調味劑的有利之處在于可以 通過控制作為鮮味組分的MP和谷氨酸以及各種氨基酸、糖、有機酸和無機離子等的濃度來 改善滋味。
[0022] 本文中，將描述本發明的用于制備天然調味劑的方法的每一步驟。
[0023] 本發明的方法的步驟(a)是用真菌發酵植物蛋白質源以獲得谷物發酵液的步驟。
[0024] 在步驟(a)中，使用植物蛋白質源進行真菌發酵，由此獲得包含多種氨基酸和肽并 包含諸如谷氨酰胺的組分的谷物發酵液，所述諸如谷氨酰胺的組分可以在用于細菌發酵的 第二發酵步驟中用作氮源。具體地，使用谷物材料作為底物來培養真菌以制備含蛋白酶的 細胞培養液，其隨后被添加到植物蛋白質源，然后進行水解，由此制備谷物蛋白水解產物。 然后，過濾該谷物蛋白水解產物，并從其中去除細胞，由此制備谷物發酵液。谷物蛋白水解 產物可以具有2% (w/v)以上的總氮含量，從而提供用于細菌發酵的第二發酵步驟所用的氮 源。
[0025] 作為植物蛋白質源，可以在本發明中使用本領域已知的任何材料，只要其可以用 真菌發酵即可。植物蛋白質源的實例包括但不限于大豆、玉米、稻米、小麥面筋等。同時，當 使用小麥面筋時，其可以有利地增加細菌發酵的產率，因為其包含大量的谷氨酰胺。因此， 小麥面筋可以優選地用作植物蛋白質源。
[0026] 作為真菌，在本發明中可以使用任何真菌，只要它們能夠發酵植物蛋白質源以制 備本發明的谷物發酵液即可。用于本發明的真菌可以優選為曲霉屬(Aspergillus sp.)微 生物，并且更優選為米曲霉(Aspergillus orizae)或醬油曲霉(Aspergillus sojae)微生 物，但不限于此。
[0027] 在本發明的實例中，使用在登記號10-1191010的韓國專利（對應于第W02011-046249號PCT國際公開）中描述的醬油曲霉CJCC_080124P(KCCM11026P)來進行用于真菌發 酵的第一發酵步驟。
[0028] 如本文所用，術語"谷物發酵液"是指通過用真菌發酵植物蛋白質源(谷物)而獲得 的產物。谷物發酵液可以用作用于細菌發酵的第二發酵步驟所用的底物，并且還可以用于 通過使谷物發酵液經歷過濾和在發酵后的細胞去除過程來制備調味劑的最終步驟。因此， 谷物發酵液可以用于上文所述的兩個用途。
[0029] 步驟(b)是用細菌發酵在步驟(a)中獲得的谷物發酵液以制備IMP發酵液和谷氨酸 發酵液的步驟。具體地，在用于真菌發酵的第一發酵步驟中獲得的谷物發酵液用作用于細 菌發酵的底物，并且可以通過使谷物發酵液在補充有碳源的培養基中經歷細菌發酵來制備 IMP發酵液和谷氨酸發酵液。
[0030] 可以通過本領域已知的一般細菌培養方法來進行細菌發酵，并且優選地，其可以 由三個步驟組成:燒瓶培養、放大培養和主要培養(main culture)。具體地，使用初代培養 基和繼代培養基來進行燒瓶培養和擴增培養，從而實現擴大，其后使用步驟(a)的谷物發酵 液作為主要培養基中的底物并同時連續供給額外的糖來進行細菌發酵，由此獲得頂P發酵 液和谷氨酸發酵液。
[0031] 用于細菌發酵的培養基可以包括諸如葡萄糖、果糖等的碳源。特別地，用于制備谷 氨酸發酵液的培養基可以包含作為碳源的粗糖。培養基可以包括多種礦物鹽、維生素和氨 基酸等，并且培養基的組成可以根據作為MP發酵液或谷氨酸發酵液的所需發酵產物而變 化。
[0032]例如，當要制備頂P發酵液時，主要培養基可以包含葡萄糖、果糖、硫酸鎂、磷酸、氫 氧化鉀和谷物發酵液。優選地，基于培養基的總體積，主要培養基可以包含4.4重量％至5.2 重量％的葡萄糖、3.7重量％至4.3重量％的果糖、1.3重量％至1.7重量％的硫酸鎂、2.0重 量％至2.4重量％的磷酸、1.4重量％至1.8重量％的氫氧化鉀和0.5重量％至0.9重量％的 谷物發酵液。此外，當要制備谷氨酸發酵液時，主要培養基可以包含葡萄糖、果糖、粗糖、甜 菜堿、硫酸鎂、磷酸鉀和磷酸，并且優選地，基于培養基的總重量，主要培養基可以包含0.5 重量％至〇. 7重量％的葡萄糖、0.9重量％至1.1重量％的果糖、4.5重量％至5.5重量％的粗 糖、0.005重量％至0.015重量％的甜菜堿、0.3重量％至0.5重量％的硫酸鎂、0.8重量％至 1. 〇重量％的磷酸鉀和〇. 2重量％至0.4重量％的磷酸。
[0033] 此外，若需要，培養基可以包含少量的其他組分，例如硫酸鐵、硫酸錳、硫酸銅、硫 酸鋅、CAPA、NCA(煙酰胺）、生物素、氯化鈣、硫胺素、維生素 C等。包含這些組分的每一種培養 基的典型實例示于表5至8及9至12中。
[0034] 由于步驟(a)的真菌發酵，植物蛋白質源因此分解成氨基酸和肽，并且從蛋白質源 中洗脫出諸如鈣離子、鎂離子和磷酸根離子的無機離子以及維生素。通過真菌發酵制備的 氨基酸包括谷氨酰胺、半胱氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等，并且可以用作步驟 (b)的細菌發酵中的氮源。特別地，高濃度的谷氨酰胺是嘌呤生物合成的必要組分，并且可 以作為用于產生高含量的MP和谷氨酸的主要促進劑。此外，洗脫的無機離子和維生素可以 有助于細菌發酵中細菌細胞的生長。在本發明的實例中，示出當通過真菌發酵而獲得的產 物用作營養源時，細菌細胞的增殖和生長變得更迅速（圖4)。這進一步證明了本發明的兩步 法的優勢。
[0035] 如本文所用，術語"細菌"是指可以發酵在步驟(a)中獲得的谷物發酵液以產生頂P 發酵液和谷氨酸發酵液的任何細菌。為了制備本發明的天然調味劑，可以使用非基因改造 (non-GMO)菌株。用于本發明的細菌可以是本領域已知具有通過發酵產生MP和谷氨酸的能 力的任何細菌。例如，當要制備IMP發酵液時，可以使用芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、棒狀桿 菌屬(Corynebacterium sp.)或埃希桿菌屬(Escherichia sp.)微生物，并且當要制備谷氨 酸發酵液時，可以使用棒狀桿菌屬、細桿菌屬(Microbacterium sp.)、芽孢桿菌屬、鏈霉菌 屬（Streptomyces sp·)、青霉菌屬（Penicillium sp·)、假單胞菌屬（Pseudomonas sp·)、節 桿菌屬(Arthrobacter sp.)、沙雷菌屬(Serratia sp.)、念珠菌屬(Candida sp.)、克雷伯 桿菌屬(Klebsiella sp·)、歐文氏菌屬(Erwinia sp·)、泛生菌屬(Pantoea sp.)或腸桿菌 屬(Enterobacter sp.)微生物。更優選地，用于本發明的細菌可以是棒狀桿菌屬微生物。最 優選地，可以使用產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)來制備IMP發酵液，并且 可以使用谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)來制備谷氨酸發酵液。此外，作 為細菌，可以使用先前專利文獻中公開并已知具有產生MP和谷氨酸的能力的各種細菌。例 如，可以使用第10-2007-000507號韓國專利公開(對應于第W02005-095627號PCT國際專利 公開)所披露的芽孢桿菌屬或埃希桿菌屬細菌來制備頂P發酵液，并且可以使用第10-2000-0029174號專利公開(對應于第7247459號美國專利）中披露的腸桿菌屬或克雷伯桿菌屬來 制備谷氨酸發酵液。
[0036] 在本發明的實例中，為了制備IMP發酵液，使用登記號10-0397321的韓國專利(對 應于第W02002-051984號W0國際專利公開）中描述的產氨棒狀桿菌CJIP009(KCCM-10226)， 并且為了制備谷氨酸發酵液，使用登記號10-0264740的韓國專利中描述的谷氨酸棒狀桿菌 (乳酸發酵短桿菌（Brevibacterium lactofermentum) )CJ971010(KFCC 11039) 〇
[0037] 通過步驟(b)的細菌發酵而獲得的發酵液具有約150g/L的固體含量。本發明的特 征在于通過細菌發酵而獲得的IMP和/或谷氨酸發酵液用于天然調味劑制備方法而不向其 添加任何額外的組分，發酵液應包含大量的作為所需組分的MP和谷氨酸。
[0038] 因此，通過用于真菌發酵的第一發酵步驟和用于細菌發酵的第二發酵步驟而制備 的MP發酵液中的固體可以優選具有30%以上的頂P含量，更優選50%以上，但不限于此。因 此，MP發酵液中MP的濃度可以優選為50g/L至150g/L，更優選為70g/L至130g/L。
[0039] 此外，因為通過用于真菌發酵的第一發酵步驟產生的產物包含氨基酸，所以與頂P 相比，可以以高濃度和高產率獲得谷氨酸。制備的谷氨酸發酵液中的固體可以優選具有 50%以上的谷氨酸含量，優選60%以上，但不限于此。因此，谷氨酸發酵液中谷氨酸的濃度 可以優選為75g/L至150g/L，更優選為90g/L至130g/L。
[0040] 由于上述發酵液中MP和谷氨酸的高含量，因此當通過諸如干燥的方法來粉化發 酵液時，可以將其適當地添加到食品。
[0041] 如本文所用，術語"調味劑"是指為了改善食品滋味而添加的物質。調味劑可以根 據其組分而分類成各種調味劑。調味劑的具體實例包括中性調味劑、牛肉調味劑、雞肉調味 劑、豬肉調味劑和厚味(kokumi)調味劑。可以使用通過本發明的兩步發酵法制備的頂P發酵 液和谷氨酸發酵液來制備每一種調味劑。其中，術語"中性調味劑"是指通過使鮮味最大化 并使其他滋味最小化而給出溫和且純正的味道的調味劑。例如，已經報道諸如卡諾拉 (cano la)油或葡萄籽油的油類具有中性滋味。
[0042] 因為本發明的發酵液的特征在于其用于天然調味劑制備方法而不添加任何額外 的組分并且不經歷額外的諸如純化的化學過程，因此為了將發酵液直接包含在食品如加工 過的食品中，所有的培養基組分應是食品級材料。因此，在發酵期間添加的所有培養基組分 優選為食品級材料。在本發明的實例中，為了將食品級材料用作培養基組分，用泛酸鈣 (calcium panthothenate，CAPA)來替代β-丙氨酸，然而，已表明可以制備IMP濃度為70g/L 以上的MP發酵液。因此，用于本發明的細菌發酵的培養基可以優選包含CAPA。
[0043] 可以通過包括步驟(a)和(b)的兩步發酵法來制備頂P發酵液和谷氨酸發酵液中的 每一種，并且所制備的發酵液可以最終進行用于反應的第三步驟，并且可以用于制備各種 調味劑的方法。基于IMP發酵液和谷氨酸發酵液，可以通過使用不同的原材料、或稍微改變 培養基組成、或控制在混合發酵液過程中或在下文公開的反應或電滲析過程中的過程條件 (包括溫度、壓力和時間），從而制備各種天然調味劑，例如中性調味劑以及用于牛肉、雞肉、 豬肉、厚味等的調味劑。在制備的天然調味劑中，可以向食品添加適于每一食品用途的調味 劑以給予最佳味道。
[0044]步驟(c)是電滲析頂P發酵液以具有適于中性調味劑的物理性質的步驟。因為頂P 發酵液由于其發酵過程而包括硫酸、氨以及諸如Mg和Μη的各種金屬離子，所述頂P發酵液具 有不適于意欲具有純正味道的中性調味劑的異味和臭味。因此，電滲析步驟去除異味和臭 味以從中性調味劑消除令人不愉快的味道或苦味，并且能使中性調味劑具有更純正且更溫 和的味道，并且可以導致具有適于中性調味劑的物理性質。另外且非必要的，電滲析步驟還 可以使得與IMP發酵液相比具有相對更低的異味和臭味的谷氨酸發酵液具有更純正的味 道。
[0045] 在本發明的實例中，使用電滲析過程來制備中性調味劑，并且將所制備的調味劑 的感官屬性與無電滲析過程而制備的樣品的感官屬性進行比較。因此，表明所制備的調味 劑的金屬味強度、苦味、令人不愉快的強度及暗黑色均降低，因此所制備的調味劑具有純正 且溫和的滋味，并且調味劑的總體偏好增加（圖5)。
[0046] 如本文所用，術語"電滲析(ED)"是指將離子組分與溶液分離的過程。其在理論上 基于物質傳遞原理，其中通過向電場施加的電壓而使溶液中的離子組分選擇性穿過陽離子 交換樹脂膜和陰離子交換樹脂膜。其是最常與逆滲透和超濾過程一起使用的膜過程。因為 電滲析過程不能視為化學過程，因此其可以出于本發明的目的而用于天然調味劑制備方 法。出于本發明的目的，可以通過電滲析過程來去除發酵液中的離子，例如金屬離子、特別 是單價和二價的陽離子和陰離子，由此去除臭味。
[0047]使用活性炭處理是通過脫色和除臭而去除異味和臭味的公知方法。然而，使用活 性炭的處理的缺點在于活性炭可以通過物理吸收而導致脫色和除臭，但不能濾除所有離子 組分。因此，在本發明中，可以通過電滲析過程來制備具有更純正且更溫和的味道的天然中 性調味劑，由此去除異味和臭味。
[0048]同時，步驟(c)可以還包括在電滲析過程之前用活性炭處理發酵液的步驟。此外， 電滲析過程可以在離心或過濾經活性炭處理的發酵液之后進行。在用活性炭處理發酵液之 后，其可以進一步被作為過濾助劑的硅藻土處理。此外，在用活性炭處理發酵液之前，其可 以經歷加熱發酵液以誘導細胞溶解的預處理過程，從而增加隨后進行的過濾過程的產率。 加熱過程可以優選在70°C至90°C下進行，并且加熱時間可以優選為15分鐘或更久，更優選 為15分鐘至60分鐘。
[0049] 步驟(d)是混合從先前步驟獲得的谷氨酸發酵液和IMP發酵液以制備天然中性調 味劑的步驟。此外，步驟(d)可以還包括與谷物發酵液混合的步驟。
[0050] 在步驟(d)，可以通過將經由本發明的制備方法的頂P發酵液和谷氨酸發酵液混合 來最終制備天然中性調味劑。在本文中，IMP發酵液和谷氨酸發酵液的混合比可以優選為 0.2:1至5:1，更優選為0.5:1至2:1，最優選為1:1，但不限于此。此外，混合的發酵液可以進 一步與谷物發酵液混合。
[0051] 本發明的混合步驟可以還包括濃縮發酵液并干燥濃縮物以制備粉末的步驟。將發 酵液制備成粉末的步驟可以在混合發酵液之前或之后進行，并且可以優選在混合發酵液之 前進行。干燥可以優選通過噴射干燥或真空干燥來實現。發酵液可以被最終制備成適于向 食品添加的粉末或糊。
[0052]在另一方面，本發明提供了通過本發明的制備方法制備的天然中性調味劑。在又 一方面，本發明還提供了包含天然中性調味劑的食品組合物。
[0053] 通過本發明的制備方法制備的天然中性調味劑具有純正且溫和的味道，因此可以 添加到合適的食品以使食品味道最大化，并還可以施用到動物食品。例如，天然中性調味劑 可以添加到零食調料(snack seasonings)、高湯、市售調味劑、調味品等，以產生純正的滋 味。
[0054] 有益效果
[0055] 根據本發明的方法制備的天然中性調味劑使用天然原材料制備，因此對于用于人 體而言是無害且安全的，并且可以添加到食品以產生純正且溫和的味道并改善食品的滋 味。
【附圖說明】
[0056] 圖1是示出制備天然調味劑的總體方法的示意圖。
[0057] 圖2示出酸-水解AMP的過程，其為了用本發明的天然食品級材料替代腺嘌呤。
[0058] 圖3示出用于得到CAPA以用天然食品級材料替代β-丙氨酸的代謝途徑。
[0059] 圖4示出在添加通過本發明的真菌發酵而降解的植物蛋白質作為營養源的情況中 以及在不添加植物蛋白質的情況中的細菌細胞的增殖程度。
[0060] 圖5示出在電滲析過程之前和之后評價感官屬性的結果。
[0061] 圖6示出比較本發明的中性調味劑與酵母提取物之間的感官屬性的結果。
【具體實施方式】
[0062] 在下文中，參考實施例進一步詳細地描述本發明。然而，對于本領域技術人員顯而 易見的是，這些實施例僅用于例示目的，并且不旨在限制本發明的范圍。
[0063] 實施例1:植物蛋白質源的真菌發酵
[0064]對于初始真菌培養，在20°C至35°C的溫度下，使用曲霉屬微生物作為真菌菌株來 培養包含諸如大豆、玉米、稻米或小麥的谷物材料的底物24小時至72小時，由此制備包含高 濃度的蛋白酶的真菌培養液。然后，將諸如大豆、玉米、稻米或小麥的植物蛋白質源與水混 合至25%至35%的高濃度，并滅菌，并且向無鹽狀態的滅菌的植物蛋白質源添加上文制備 的含高濃度蛋白酶的真菌培養液，以水解該植物蛋白質源。此處，基于滅菌的底物溶液，以 10 %至100 %的量添加真菌培養液，并且在40 °C至50 °C下降解底物48小時至96小時以制備 谷物蛋白水解產物。
[0065] 具體地，使用登記號10-1191010的韓國專利(對應于第W0 2011-046249號PCT國際 公開）中描述的醬油曲霉CJCC_080124P(KCCM11026P)進行燒瓶培養和擴增培養，然后使用 脫脂大豆來制備真菌培養液，并且水解作為底物的小麥面筋，由此制備谷物蛋白水解產 物。更具體地，將200ml初代培養物分散在1L燒瓶中并滅菌，并且在燒瓶中以1.7 X 101()個真 菌細胞/400ml的密度接種200ml的真菌細胞，并在30 °C和lOOrpm下培養7小時。然后，向250L 發酵罐添加繼代培養物，并滅菌，在其中接種600ml的初代培養液，并在30 °C和70rpm下培養 24小時。接下來，向5噸制備罐添加主要培養基，并在90 °C加熱30分鐘，在將其轉移到8噸發 酵罐中之后，向其添加 100L水和2L消泡劑。然后，在主要培養基中接種144L繼代培養液，然 后在30°C和700rpm下培養48小時，由此制備真菌培養液。最終，向5噸制備罐添加用于底物 水解的原材料，并在55°C加熱1小時，之后將其轉移到20噸發酵罐中，并向其添加 100L水和 2L消泡劑，然后滅菌。然后，在底物中接種5760L的真菌培養液，并在45°C和30rpm下培養96 小時，由此制備谷物蛋白水解產物。用于制備谷物蛋白水解產物的培養基的組成示于下文 表1至4中。
[0066] [表1]
[0067] 用于真菌發酵的初代培養物
[0069][表 2]
[0070]用于真菌發酵的繼代培養物
[0072][表 3]
[0073]用于真菌發酵的主要培養基
[0075][表 4]
[0076]用于底物水解的原材料
[0078]通過壓濾機過濾上述制備的谷物蛋白水解產物以去除真菌細胞，由此制備總氮含 量為2% (w/v)以上且水解度為50%以上的谷物發酵液。同時，將谷物發酵液制備成用于二 次細菌發酵的培養基。
[0079] 實施例2:細菌發酵
[0080]為了使用谷物發酵液制備IMP發酵液和谷氨酸發酵液，向實施例1中制備的谷物發 酵液添加諸如葡萄糖或果糖的碳源，諸如Fe、Mg、Mn和Zn的礦物鹽以及維生素，然后滅菌，由 此制備用于細菌發酵的培養基。制備用于制備IMP發酵液和谷氨酸發酵液的培養基，并且對 于每一發酵液，制備用于燒瓶培養(初代培養）、擴增培養(繼代培養)和主要培養的培養基。 [0081 ] 2-1: IMP發酵液的制備
[0082] 使用登記號10-0397321的韓國專利（對應于第W02002-051984號W0國際專利公開） 中描述的產氨棒狀桿菌CJIP009(KCCM-10226)，制備頂P濃度為70g/L以上的頂P發酵液。 [0083]具體地，將使用NaOH調節至pH 7.2的50ml初代培養物分散在500-ml燒瓶中，并在 121°C滅菌15分鐘，在將細菌菌株接種到培養基中之后，在32 °C和200rpm下培養22小時至28 小時。然后，將2.1L繼代培養物分散在5-L罐中，滅菌并冷卻，之后在其中接種300ml初代培 養液，并在將pH調節至7.2的同時在32°C和900rpm下于2L空氣中培養27小時至30小時。接下 來，將8.5L主要培養基分散在30-L罐中，滅菌并冷卻，之后在其中接種1500ml繼代培養液， 并在任何時間將pH調節至7.2并供給額外的糖(包括葡萄糖和果糖的混合物)的同時在32 °C 和400rpm下于5L空氣中培養5天至6天。在供給最后的額外的糖之后，進行培養7小時或更 久，從而會完全消耗糖。用于制備MP發酵液的培養基的組成示于下文表5至8中。
[0084][表5]
[0085]用于制備頂P發酵液的初代培養物
[0087][表6]
[0088]用于制備頂P發酵液的繼代培養物
[0091] [表 7]
[0092] 用于制備頂P發酵液的主要培養基
[0094][表8]
[0095]用于制備頂P發酵液的額外的糖
_7] 2-2:谷氨酸發酵液的制備
[0098]使用登記號10-0264740的韓國專利所述的谷氨酸棒狀桿菌（乳酸發酵短桿菌） CJ971010(KFCC 11039)，制備谷氨酸濃度為90g/L以上的谷氨酸發酵液。
[0099]具體地，將30ml的初代培養物分散在250-ml燒瓶中并滅菌，并且在培養基中接種 細菌菌株并培養5小時至8小時。然后，將1.4L的繼代培養物分散在5-L罐中，滅菌并冷卻，然 后在其中接種20ml初代培養液，并培養20小時至28小時。然后，將9.2L主要培養基分散在 30-L罐中，滅菌并冷卻，其后在其中接種800ml的繼代培養液，并在任何時間供給額外的糖 的同時培養36至45小時，。
[0100] 在供給最后的額外的糖之后，進行培養7小時或更久，從而會完全消耗糖。用于制 備谷氨酸發酵液的培養基的組成示于下文表9至12中。
[0101] [表 9]
[0102] 用于制備谷氨酸發酵液的初代培養物
[0105] [表 10]
[0106] 用于制備谷氨酸發酵液的繼代培養物
[0109] [表 11]
[0110] 用于制備谷氨酸發酵液的主要培養基
[0112] [表 12]
[0113] 用于制備谷氨酸發酵液的額外的糖
[0116] 為了使用用于制備頂P發酵液的培養基制備頂P發酵液并將頂P發酵液用作向食品 添加的調味劑，應用食品級材料替代多個培養基組分，從而滿足食品添加劑的需求。因此， 用食品級材料替代細胞生長所必須的腺嘌呤和β-丙氨酸。
[0117] 首先，通過酸-水解AMP以分裂與核糖的β-Ν-糖苷鍵，由此釋放腺嘌呤，從而制備腺 嘌呤。已表明，當使用上述制備的腺嘌呤進行培養時，可以制備頂Ρ濃度為70 g//L以上的ΜΡ 發酵液(圖2)。
[0118] 然后，由于檢查了產氨棒狀桿菌的代謝途徑，因此預期會用泛酸鈣(CAPA)替代β-丙氨酸。因此，使用CAPA替代β-丙氨酸來進行培養，由此，已表明可以制備頂Ρ濃度為70g/L 以上的MP發酵液(圖3)。
[0119] 實施例3:在真菌發酵產物用于細菌發酵的情況中的細胞生長速率的檢查
[0120] 為了確認連續進行用于真菌發酵的第一發酵步驟和用于細菌發酵的第二發酵步 驟的情況的優勢，檢查在添加通過第一真菌發酵步驟降解的植物蛋白質作為營養源的情況 中以及在不添加植物蛋白質的情況中的細菌細胞的生長速率和增殖程度。
[0121] 因此，如可從圖4所見的，與不添加植物蛋白質的情況相比，在添加通過第一真菌 發酵步驟降解的植物蛋白質作為營養源的情況中，細菌細胞高速率地并大量地增殖。
[0122] 實施例4:谷氨酸發酵液的調味特性根據碳源種類而變化的檢查
[0123] 可以用于谷氨酸發酵的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖蜜、粗糖等。盡管一些其他培 養基組分根據碳源種類而變化，但所得的發酵液的谷氨酸濃度不會顯著依賴于碳源種類。 然而，發酵液的滋味根據碳源的種類而顯著改變，并且為了開發中性調味劑，所得的發酵液 優選具有更純正的滋味。蔗糖蜜由于其中包含多種無機離子而成為在微生物發酵方面的優 異培養基組分，但不足之處在于其用作中性調味劑的價值是低的，因為培養基自身的顏色 過深并且由焦糖化產生的滋味保留在所得的培養液中。
[0124] 因此，粗糖用于替代蔗糖蜜來制備用于制備中性調味劑的谷氨酸發酵液，并且檢 查培養液的滋味特性的由此引起的變化。此處，當用粗糖替代蔗糖蜜時，向培養基額外地添 加在蔗糖蜜中包含的主要無機離子和維生素。因此，可以看出，當用粗糖替代蔗糖蜜時，去 除異味，因此呈現適于制備中性調味劑的滋味特性(表13)。此外，使用粗糖制備的谷氨酸發 酵液還包含高濃度(96g/L以上)的谷氨酸，其是適于制備中性調味劑的谷氨酸濃度。
[0125] [表 13]
[0126] 培養液的滋味特性隨蔗糖蜜與粗糖之比的變化
[0128] 實施例5:中性調味劑的制備
[0129] 使用在實施例2中制備的谷氨酸發酵液和IMP發酵液，制備中性調味劑。
[0130] 具體地，為了增加要隨后進行的過濾過程的產率，將每一發酵液在70°C至90°C加 熱15分鐘以上，從而誘導細胞溶解。這種預處理過程可以將過濾產率增加至85%以上。然 后，為了從谷氨酸發酵液和MP發酵液去除異味和臭味，基于發酵液的體積，以l%(w/v)至 3%(w/v)的量添加活性炭，隨后在50°C至70°C下用活性炭處理發酵液2小時至24小時。在 用活性炭處理之后，向發酵液添加作為過濾助劑的1 % (w/v)至3% (w/v)的硅藻土，隨后通 過壓濾機來過濾發酵液。
[0131] 用活性炭處理的濾液經歷電滲析以去除包括0&、？6、1(、1%和順4離子的單價和二價 離子，從而去除由氨和金屬離子導致的異味，由此制備中性調味劑。
[0132] 當發酵液以5L/hr. m2至20L/hr. m2的流量經歷電滲析時，諸如Ca、Fe、K、Mg和Μη離子 的單價和二價離子降低了 30%至60%。在進行電滲析過程之前和之后的發酵液的組分的含 量在以下表14中示出。如其中可見的，發酵液中無機離子的含量在電滲析過程之后降低，而 發酵味道具有更純正且更溫和的滋味。
[0133] 最終，將精鹽和麥芽糖糊精添加到通過上述培養和過濾過程獲得的濾液中，并且 通過噴射干燥來粉化混合物，由此制備本發明的天然調味劑。
[0134] [表 14]
[0135]
[0136] 實施例6:由電滲析過程導致的感官屬性的評價
[0137] 為了驗證上文所制備的本發明的中性調味劑的味道，進行感官屬性的評價。
[0138] 通過電滲析去除無機離子的樣品以及未經歷電滲析的樣品各自被粉化，然后由小 組來評價樣品的感官屬性。小組是專業訓練的，從而他們會對感官屬性是敏感的，并且向小 組提供相同濃度的樣品以評價每一樣品的感官屬性和強度。
[0139] 因此，如圖5所示，鮮味的強度在電滲析過程之前與之后基本不變，但對于電滲析 過程之前的發酵液，在感官屬性中作為不利因素的金屬味、苦味、令人不愉快感和暗黑色均 是高的，因此發酵液的純正度和總體偏好是低的。然而，對于經歷電滲析過程的發酵液，金 屬味的強度、苦味、令人不愉快的強度以及暗黑色均是低的，因此滋味和顏色的偏好均是高 的，并且純正度和總體偏好是高的。因此，可以看出，當進行電滲析過程時，與電滲析過程之 前相比，可以制備具有更純正的滋味且具有改善的偏好的中性調味劑。
[0140] 實施例7:感官屬性與酵母提取物的比較
[0141]為了檢查本發明的中性調味劑的調味效果，將其感官屬性與酵母提取物的感官屬 性進行比較，酵母提取物是近年來最廣泛且在多方面使用的天然調味劑之一。
[0142] 在一些情況下，酵母提取物有利地用于加工食品，但在大部分情況下，其在加工食 品中的用途是受限的，因為其怪味損害了加工食品的滋味平衡，這歸因于由其怪異發酵氣 味(稱為酵母提取物味)產生的異味和臭味。
[0143] 因此，開發出簡易食品模型，并且分別向其添加酵母提取物和本發明的中性調味 劑，之后，通過由研究者(n = 45)組成的小組來評價感官屬性。
[0144] 因此，如圖6所示，在施用酵母提取物的小組中，酵母味的強度是高的，酵母提取物 的偏好是低的，并且出現將酵母提取物認為是異味和臭味的趨勢。因此，表明在本發明的天 然調味劑中的整體味道的偏好是相對高的。
[0145] 這些結果表明從本發明的中性調味劑中有效地去除了由無機離子產生的異味和 臭味，因此當施用于食品時，該中性調味劑產生良好的滋味。
[0146] 另外，使用修正定量描述分析，由9名受訓練的小組成員來比較本發明的中性調味 劑和酵母提取物的感官屬性。具體地，將小組成員訓練6小時，感官屬性重復測量三次，并且 向小組成員同時提供6種樣品并由小組成員隨機攝取。以16-分(0-15)等級來評價總計16種 屬性。所評價的16種屬性是6種香味屬性、5種味道屬性、3種滋味屬性和2種口感屬性。在攝 取樣品之后，用速食米飯或水將其沖洗掉，并且攝取下一個樣品。向小組成員提供在陶瓷杯 中容納的70ml的每一樣品，并且進行統計學分析(平均值，MAN0VA，PCA)。
[0147] 因此，對于本發明的天然調味劑，與酵母提取物相比，強烈感受到焦糖味、酸味和 黃精茶(Solomon's seal tea)味，因此天然調味劑具有美味和酸味。此外，對于中性調味 劑，感受不到推測是由培養基組分產生的煮土豆味或香味，并且視為發酵氣味的煮豆氣味 與酵母提取物相比是顯著低的。此外，本發明的天然中性調味劑與由其他公司制造的其他 調味劑相比具有顯著高的口腔包覆強度，表明甚至少量使用時，天然中性調味劑可以容易 地表現出口腔包覆感。具體地，通過本發明的天然中性調味劑的與谷氨酸相關的單獨特性， 鮮味強度是非常高的，并且燒焦的谷物香氣或味道(黃精茶)是強的，而且通過本發明的天 然中性調味劑的與IMP相關的單獨特性，鮮味強度與酵母提取物類似，焦糖香氣是強的，并 且中性調味劑具有酸味。此外，可以看出，酵母提取物具有煮土豆香氣或滋味或者煮豆氣 味。
【主權項】
1. 制備肌苷-5單磷酸鹽(IMP)發酵液或谷氨酸發酵液的方法，其包括： (a) 用真菌發酵植物蛋白質源以獲得谷物發酵液；以及 (b) 用細菌發酵所述谷物發酵液。2. 如權利要求1所述的方法，其中所述頂P發酵液或所述谷氨酸發酵液是用于制備天然 調味劑的原材料。3. 如權利要求1所述的方法，其中所述植物蛋白質源選自大豆、玉米、稻米、小麥和小麥 面筋。4. 如權利要求1所述的方法，其中所述真菌是曲霉屬(Aspergillus sp.)微生物。5. 如權利要求4所述的方法，其中所述曲霉屬微生物是醬油曲霉（Aspergillus so jae) 〇6. 如權利要求1所述的方法，其中所述細菌是棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)微生 物。7. 如權利要求6所述的方法，其中所述棒狀桿菌屬微生物是產氨棒狀桿菌 (Corynebacterium ammoniagenes)〇8. 如權利要求6所述的方法，其中所述棒狀桿菌屬微生物是谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutamicum)〇9. 如權利要求1所述的方法，其中用于制備所述IMP發酵液或所述谷氨酸發酵液的細菌 發酵所用的培養基組合物包含食品級材料。10. 如權利要求9所述的方法，其中所述細菌發酵所用的培養基組合物包含泛酸鈣 (CAPA)011. 如權利要求1所述的方法，其中用于制備所述IMP發酵液的細菌發酵所用的培養基 包含葡萄糖、果糖、硫酸鎂、磷酸、氫氧化鉀和谷物發酵液。12. 如權利要求1所述的方法，其中用于制備所述谷氨酸發酵液的細菌發酵所用的培養 基包含葡萄糖、果糖、粗糖、甜菜堿、硫酸鎂、磷酸鉀和磷酸。13. 如權利要求1所述的方法，其中用于制備所述谷氨酸發酵液的細菌發酵所用的培養 基中的碳源是粗糖。14. 如權利要求1所述的方法，其中在制備的頂P發酵液中頂P的濃度為50g/L至150g/L。15. 如權利要求1所述的方法，其中在制備的MP發酵液的固體中頂P的含量為30重量％ 以上。16. 如權利要求1所述的方法，其中在制備的谷氨酸發酵液中谷氨酸的濃度為75g/L至 150g/L〇17. 如權利要求1所述的方法，其中在制備的谷氨酸發酵液的固體中谷氨酸的含量為50 重量％以上。18. 如權利要求1所述的方法，其還包括(c)用活性炭處理通過所述細菌發酵而獲得的 發酵液。19. 如權利要求18所述的方法，其還包括在用活性炭處理所述發酵液之后，離心或過濾 經處理的發酵液。20. 如權利要求18所述的方法，其還包括在用活性炭處理所述發酵液之前，在70°C至90 °C的溫度下加熱所述發酵液15分鐘至60分鐘以誘導細胞溶解。21. 頂P發酵液，其通過權利要求1至11、14、15和18至20中任一項所述的方法制備。22. 谷氨酸發酵液，其通過權利要求1至10、12、13和16至20中任一項所述的方法制備。23. 制備天然調味劑的方法，其包括： (a) 用真菌發酵植物蛋白質源以獲得谷物發酵液；以及 (b) 用細菌發酵所述谷物發酵液以制備IMP發酵液或谷氨酸發酵液。24. 如權利要求23所述的方法，其還包括(c)混合兩種或更多種選自以下的發酵液:步 驟(a)的所述谷物發酵液，以及步驟(b)的所述IMP發酵液和所述谷氨酸發酵液。25. 如權利要求23或24所述的方法，其中在不添加任何額外的組分的情況下僅使用所 述發酵液來制備所述天然調味劑。26. 如權利要求23或24所述的方法，其中在不使所述發酵液經歷額外的化學過程的情 況下使用所述發酵液來制備所述天然調味劑。27. 如權利要求24所述的方法，其還包括在步驟(c)之前，電滲析所述頂P發酵液或所述 谷氨酸發酵液。28. 天然調味劑，其通過權利要求23所述的方法制備。29. 食品組合物，其包含權利要求28所述的天然調味劑。
【文檔編號】A23L27/22GK105886578SQ201610404930
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年2月25日
【發明人】李省勳, 嚴沼妍, 樸再承, 吳銀善, 李光熙, 張錫旼, 姜大翊, 鄭原大
【申請人】Cj第制糖株式會社, Cj第一制糖株式會社