表達豬傳染性胃腸炎病毒s蛋白的重組枯草芽孢桿菌的制作方法

表達豬傳染性胃腸炎病毒s蛋白的重組枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發明涉及表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌，屬于生物技術基因工程領域。本發明成功構建了豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白重組枯草芽孢桿菌整合表達質粒pIncotGSR，并成功電擊轉化入枯草芽孢桿菌WB800。經Western-blot驗證豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白在重組枯草芽孢桿菌內可以被成功表達。口服免疫可以刺激一月齡仔豬機體產生有效的TGEV特異性免疫應答水平。重組枯草芽孢桿菌有望開發成預防豬傳染性胃腸炎的基因工程口服疫苗。
【專利說明】
表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌 一、
技術領域
[0001] 本發明涉及表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌，屬于生物技術 基因工程領域。具體包括：豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白整合表達性質粒plncotGSR的構建， 豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的表達與鑒定以及重組枯草芽孢桿菌可以刺激一月齡仔豬機 體產生有效的TGEV特異性免疫應答水平。 二、
【背景技術】
[0002] 1.豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)主要結構蛋白之一-S蛋白（S)
[0003] 豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis of swine，TGE)是由豬傳染 性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV)引起的一種高度 接觸性腸道傳染病，以引起2周齡以內仔豬嘔吐、嚴重腹瀉、脫水和高死亡率（可達100% ) 為主要特征。TGEV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，是一種多形態有囊膜的病毒。病毒粒子呈圓 形、橢圓形或多邊形，直徑為90~200nm病毒囊膜由雙層脂質組成，在脂質雙層中穿插有 三種蛋白：纖突蛋白（S蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、和小囊膜蛋白（sM蛋白）。S糖蛋白部分 突出于病毒粒子表面，形成典型的花瓣狀突起，長20nm，使整個病毒粒子在電鏡下觀察像皇 冠狀。編碼S糖蛋白的基因長度為4344bp，最初合成的S蛋白前體由1447(Purder株）或 1449 (Miller株）個氨基酸殘基組成。切除16個起分泌信號膚作用的疏水性氨基酸殘基 后，多膚鏈還有1431個（Miller株為1433個）氨基酸殘基，分子量約為158kD ;富含甘露糖 的碳水化合物側鏈經修飾后，加到S蛋白的N糖基化位點上（共32-34個位點）上，形成胞 內EZ蛋白，分子量為175kD ;EZ蛋白在胞內高爾基復合體中再一次糖基化，成為成熟蛋白， 分子量為200kD。S糖蛋白可分為以下幾個區域：膜外區、跨膜區、膜內區。其中膜外功能區 主要形成S蛋白的冠狀突起的成分，在其羧基端1/5-1/4處形成8nm雙股α螺旋結構。S 蛋白的膜外區上分布有該蛋白的主要抗原位點，宿主細胞氨肽酶受體（ΡΑΡΝ)的識別位點， 以及一段DRTRG序列（為退化的切割位點）。跨膜區及膜內區位于S蛋白C 一末端，其中有 大約20個氨基酸殘基的疏水片段使S蛋白固定于脂膜中；由約35個氨基酸殘基組成的中 間區域分為兩個部分：半胱氨酸殘基含量比率高（約50%)的部分可能是酯酰化位點，另 一較小的疏水區可能嵌入病毒粒子內部。S蛋白主要有以下5方面的作用：①攜帶主要的Β 淋巴細胞抗原決定簇，是唯一能誘導產生中和抗體和提供免疫保護作用的結構蛋白；②含 有宿主細胞氨肽酶受體（ΡΑΡΝ)的識別位點，在決定宿主細胞親嗜性方面起關鍵作用；③決 定TGEV的致病性；④具有細胞膜融合作用，使病毒核衣殼進入細胞漿；⑤決定TEGV的血凝 作用。
[0004] 早在1979年研究發現，S糖蛋白可提供免疫保護作用。Jimenez等通過放射免疫 分析進一步證實，S糖蛋白攜帶主要的B淋巴細胞抗原決定簇，是唯一能誘導產生中和抗 體和提供免疫保護作用的結構蛋白。Gebauer等通過單克隆抗體競爭試驗確定了 S糖蛋白 存在3種層次的抗原結構，即抗原位點（sites)、抗原亞位點（subsities)和抗原決定簇 (epitoes)，S蛋白共有11個抗原決定簇，其中5個是與中和抗體產生相關的重要抗原決定 簇。S蛋白的抗原位點包括A、B、C、D四個位點，A、D位點在誘導產生中和抗體中起著主要 作用，在S基因中若編碼A、D位點的序列缺失，則其表達產物不能誘導機體產生中和抗體。 因此S基因成為TGEV基因工程疫苗研究的首選抗原基因，目前已在多種不同的表達系統中 對S蛋白進行了表達并對其免疫原性進行了研究。近年來，國內外大量學者，通過腺病毒、 桿狀病毒、大腸桿菌等成功表達過TGEV的S蛋白，而且表達的蛋白具有良好的免疫原性，卻 因為提純蛋白方法過于繁瑣或者表達基因的大小受到限制等大大限制了 S蛋白在疫苗中 應用。
[0005] 2.枯草芽孢桿菌對黏膜免疫的影響
[0006] 目前對黏膜抗原的細菌遞送載體，尤其是能夠入侵或者定植在黏膜上皮細胞的細 菌，已有廣泛研究。活細菌載體的種類很多，應用比較廣泛的包括兩類：一類為弱毒病原體 能夠誘導強而持久的免疫應答，如沙門氏菌和李斯特菌，但這些減毒細菌做為載體傳遞疫 苗存在潛在的危險性，甚至是致病性。另一類是目前較為關注的安全無致病性的共生物種， 如乳球菌、乳桿菌和枯草芽孢桿菌等益生菌。枯草芽孢桿菌作為一種安全的無致病性活細 菌載體，是廣泛存在于土壤和植物中的優勢生物種群，隸屬于芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬，其 細胞呈直桿狀，大小（0.8~1.2) μ mX (1.5~4.0) μ m，單個，革蘭氏染色陽性，著色均勻， 無莢膜，能運動。枯草桿菌作為抗原的載體具有很多優點：①是人類和動物安全紀錄的益生 菌和食品添加劑，②成本低廉、耐熱、抗干燥、便于運輸和使用，③其遺傳性狀和細菌學水平 都很容易操縱。因此，枯草芽孢桿菌非常適宜作為安全的口服疫苗和其他病原體的抗原遞 送載體。同時枯草芽孢桿菌作為抗原遞送載體可以誘導黏膜免疫應答和全身免疫應答，這 引起了研究者們極大的興趣。這對于開發新型口服疫苗，提供了廣闊的空間。
[0007] 3. 口服黏膜免疫研究進展
[0008] 口服黏膜免疫方法簡便、安全，不僅在黏膜局部和其他黏膜組織產生免疫應答，還 可引起全身性體液免疫應答，多年來受到國內外免疫學家的密切關注。目前兒童廣泛口服 的脊髓灰質炎糖丸就是一個消化道黏膜免疫成功的例子。脊髓灰質炎口服疫苗的應用，使 全球小兒麻痹發病得到有效控制，為口服疫苗的研制與應用起到了指導作用。但是在實踐 中，口服疫苗經過消化道時常受到消化液的降解，疫苗很容易被破壞，影響免疫力的效果， 使消化道黏膜免疫方法的應用和推廣受到限制。近年來疫苗遞送系統成為研究傳染病防御 領域新技術的熱點之一。尤其是細菌活載體疫苗因具有培養方便，外源基因容量大，刺激細 胞免疫力強等優點具有巨大的應用潛力。細菌載體疫苗是新興現代疫苗的重要發展方向， 所謂細菌載體疫苗是將所需的編碼病原菌特異性抗原的DNA片段插入減毒的病原菌或者 共生菌中，讓其表達所編碼的抗原，以期達到預防一種或多種疾病的目的。通過活菌載體遞 送疫苗抗原不僅可刺激腸道局部免疫應答，又可針對特異性抗原產生特異性免疫應答，使 機體可以獲得全面的保護力。
[0009] 以前的研究表明一些減毒細菌可作為疫苗抗原的載體，如沙門氏菌、弱毒李斯特 菌等。國外學者以減毒沙門氏菌為載體在真核細胞中成功表達了 lacZ基因、綠色熒光蛋 白（GFP)基因、HIV-gpl40基因、李斯特菌溶血素基因等。沙門氏菌為載體傳遞DNA疫苗還 能存在潛在危險性。首先，減毒細菌可能存在毒力返強的危險；其次，質粒DNA可能會整合 到宿主細胞基因組，從而引起調控細胞生長的基因紊亂、原癌基因和抑癌基因的表達失控、 體細胞癌變、細胞轉型等一系列問題。此外，減毒細菌對一些老弱病殘個體可能有潛在致病 性。因此，選擇理想的疫苗抗原載體是建立生物學新技術的關鍵。理想的輸送抗原的載體 應該是能夠在體內較長時間存在，本身對機體既安全又能產生持續免疫力的一些微生物。
[0010] 隨著以益生菌為活載體傳遞抗原，刺激腸道黏膜免疫這一技術路線的提出，本發 明試圖在益生菌枯草芽孢桿菌中表達TGEV的S蛋白進行活菌的口服免疫。對研制豬傳染性 胃腸炎口服疫苗，為預防豬傳染性胃腸炎開辟一條全新的黏膜免疫途徑具有重要的意義。 三、
【發明內容】

[0011] 技術問題
[0012] 本發明成功構建了豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白重組型枯草芽孢桿菌整合表達質 粒plncotGSR，并轉化進入枯草芽孢桿菌WB800。豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白在重組枯草 芽孢桿菌WB800內可以被成功表達，并通過口服免疫可以刺激一月齡仔豬機體產生有效的 TGEV特異性免疫應答水平。重組枯草芽孢桿菌WB800有望開發成預防豬傳染性胃腸炎的基 因工程口服疫苗。
[0013] 技術方案
[0014] 本發明涉及表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白重組枯草芽孢桿菌，該重組枯草芽孢 桿菌WB800菌株，屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)。檢測一月齡仔豬口服免疫該重 組枯草芽孢桿菌WB800菌株機體產生有效的TGEV特異性免疫應答水平。
[0015] 1其整合表達載體質粒構建方法包括：
[0016] 1. 1枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端和3端的克隆
[0017] 參照已發表的枯草芽孢桿菌的amyE序列（GenBank登陸號：NZ_CM000487. 1)，設計 一對擴增amyE5的引物，并在上、下游引物5端分別引入Nhel、Hindlll酶切位點（下劃線 為酶切位點），引物序列如下：
[0018] PI：GCTAGCATTCTCCAGTCTTCACATCGGT
[0019] P2 ：AAGCTTTCTTCATCATCATTGGCATACG
[0020] 設-Η對擴增amyE 3的引物，并在上、下游引物5端分別引入Kpnl、Xhol酶切位 點（下劃線為酶切位點），引物序列如下：
[0021] P3 ：GGTACCATGATATCCGTTTAGGCTGGGC
[0022] P4 ：CTCGAGCTTTGATGTCTTTTTGTTTGTGAA
[0023] 以枯草芽孢桿菌WB800提取的基因組DNA為模板，用合成的Pl、P2引物PCR擴增 amyE 5及P3、P4引物擴增amyE 3序列，PCR反應體系均為50 μ L，amyE 5PCR反應條件： 95。(：預變性511^11，951€3〇86。，691€3〇86。，72。(：111^11，30。7。168,72。(：1〇11^11，4。(：1〇11^11 ; amyE 3PCR 反應條件為 95°C 預變性 5min;95°C 30sec，69°C 30sec，72°C lmin，30cycles， 72°C 10min，4。°C lOmin，將PCR產物連接到pMDT-19載體上，構建的載體分別命名為T-amyE 5和T-amyE 3。測序后獲得具有枯草芽孢桿菌amyE 5端的DNA序列SEQ ID NO. 1和具有 枯草芽孢桿菌amyE 3端的DNA序列SEQ ID NO. 2。
[0024] 1. 2硫酸卡那霉素抗性基因的克隆
[0025] 參照已發表的硫酸卡那霉素抗性基因序列（GenBank登陸號：EU549779. 1)設計一 對擴增Kaf的引物，并在上游引物5端引入Kpnl、Hindlll酶切位點，下游引物5端引入 ΚρηΙ酶切位點（下劃線為酶切位點），引物序列如下：
[0026] P5 ：GGTACCAAGCTTTTCAACAAACGGGCCAGTTT
[0027] P6 ：GGTACCTCAAAATGGTATGCGTTTTGACA
[0028] 以pMK3質粒為模板進行PCR擴增；PCR反應體系為50 μ L，PCR反應條件：95°C預 變性 5min，95°C 30sec，7rC 30sec，72°C IminJOcycles，？〗！： 10min，4°C lOmin ;將 PCR 產 物連接到PMD19-T載體上，構建的載體命名為T-Kan%測序后獲得具有完整編碼區的硫酸卡 那霉素抗性基因序列SEQ ID NO. 3。
[0029] 1. 3枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因的克隆
[0030] 參照已發表的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列（GenBank登陸號：NZ_ CM000487. 1)設計一對擴增被膜蛋白G基因 cotG的引物，并在上游引物5端引入與枯草芽 孢桿菌amyE 5 3'末端15bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點（下劃線為 酶切位點）；下游引物5端引入與S蛋白基因5'末端10bp的同源臂序列，兩序列之間引入 Nhel酶切位點（下劃線為酶切位點），引物序列如下：
[0031] P7 ：ATGATGATGAAGAGAAGCTTTTTCCCTTTCTAAATCGC
[0032] P8 ：GTTTTTTCATGCTAGCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCC
[0033] 以枯草芽孢桿菌提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增；PCR反應體系為50 μ L， PCR 反應條件：95°C 預變性 5min，95°C 30sec，71°C 30sec，72°C lmin 12sec，30cycles， 72°C 10min，4°C lOmin ;將PCR產物連接到pMD19-T載體上，構建的載體命名為T-cotG，測 序后獲得具有完整編碼區的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列SEQ ID N0. 4。
[0034] 1. 4豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因的克隆
[0035] 參照已發表的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因序列（GenBank登陸號：KP202848) 設計一對擴增S蛋白基因 cDNA的引物，在上游引物引入與枯草芽孢桿菌cotG 3'末端12bp 的同源臂序列，兩序列之間引入Nhel酶切位點（下劃線為酶切位點）；在下游引物引入與 紅色熒光蛋白基因 RFP 5'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點（下 劃線為酶切位點），引物序列如下：
[0036] P9 ：AAGAAATACAAAGCTAGCATGAAAAAACTATTTGTG
[0037] P10 ：GGTGTTGTCCATAAGCTTATGGACGTGCACTTTTTCA
[0038] 以豬傳染性胃腸炎病毒SHXB毒株（豬傳染性胃腸炎病毒強毒株）提取的總RNA 為模板，經MLV-反轉錄酶合成cDNA第一鏈后進行PCR擴增；PCR反應體系為50 μ L，PCR 反應條件：95°C 預變性 5min，95°C 30sec，67°C 30sec，72°C ^indOcyclesJSt： 10min， 4°C lOmin ;將PCR產物連接到pMD19-T載體上，構建的載體命名為T-S，測序后獲得具有完 整編碼區的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因序列SEQ ID N0. 5。
[0039] 1· 5紅色灰光蛋白基因的克隆
[0040] 參照已發表的紅色熒光蛋白基因序列（GenBank登陸號：ΑΒ166761. 1)設計一對擴 增紅色熒光蛋白基因 RFP的引物，在上游引物引入與S蛋白基因3'末端12bp的同源臂序 列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點（下劃線為酶切位點）；在下游引物引入與枯草芽孢 桿菌amyE 35'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點（下劃線為酶 切位點），引物序列如下：
[0041] Pll：GTGCACGTCCATAAGCTTATGGACAACACCGAGGAC
[0042] P12 ：GTCGACGGTACCAAGCTTCTACTGGGAGCCGGAGTG
[0043] 以pDsRed-monomer-Nl質粒為模板進行PCR擴增；PCR反應體系為50 μ L，PCR反 應條件：95。(：預變性5111丨11，951€3〇86。，721€3〇86。，72 1€48 86。，30。7。168,72。(：1〇11^11， 4°C lOmin ;將PCR產物連接到pMD19-T載體上，構建的載體命名為T-RFP，測序后獲得具有 完整編碼區的紅色熒光蛋白基因序列SEQ ID N0. 6。
[0044] 1. 6整合表達載體骨架plnAmyE的構建
[0045] 利用酶切連接技術，分別將SEQ ID NO. 1序列、SEQ ID N0. 3序列和SEQ ID N0. 2 序列克隆至載體p⑶NA3. 1上，獲得整合表達骨架載體plnAmyE。采用限制性內切酶Nhel、 HindIII、KpnI和Xhol，分別用雙酶切驗證。
[0046] 1. 7整合表達載體plncotGSR的構建
[0047] 以SEQ ID N0. 4序列、SEQ ID N0. 5序列和SEQ ID N0. 6序列為模板，用引物P7、 P12進行重疊 PCR擴增，PCR反應體系為50 μ L，PCR反應條件：95°C預變性5min，95°C 30sec， 72°C 30sec，72°C 5min，30cycles，72°C 10min，4°C lOmin ;將 PCR 產物回收，并使用 One Step Cloning Kit定點克隆試劑盒克隆至載體骨架plnAmyE上，測序后獲得整合表達載體 plncotGSR。
[0048] 2電轉化枯草芽孢桿菌WB800菌株，屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)。
[0049] 將構建的整合表達質粒plncotGSR采用電擊轉化的方法，取60 μ L枯草芽孢桿菌 WB800電轉化感受態細胞與1 μ L(50ng/ μ L)整合表達載體plncotGSR質粒混合加入電擊杯 中冰浴5min后進行電擊，電擊條件：22KV/cm，25 μ F，200 Ω，電擊一次。加入lmL電擊恢復 液，37°C lOOrprn孵育3h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固體基礎培養基LB平板，14-18h可見陽 性菌落。將重組枯草芽孢桿菌WB800,進行PCR和Western-blot驗證，并且進行共聚焦顯微 鏡觀察。
[0050] 3檢測口服免疫該重組枯草芽孢桿菌WB800菌株機體產生的TGEV特異性免疫應答 水平
[0051] 空枯草芽孢桿菌WB800菌株（基因組中未整合外源基因）和表達豬傳染性胃 腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌WB800菌株分別口服免疫一月齡仔豬，口服劑量為 1 X lO^fu/kg，首免一周后按相同劑量進行二免，每周進行血清和糞便的采集，飼養周期為 五周。采用間接ELISA的方法進行TGEV特異性IgG和特異性SIgA水平變化檢測。檢測方 法為：豬傳染性胃腸炎抗原包被過夜，1% BSA(牛血清白蛋白）37°C封閉2h，洗滌后加待檢 樣品37°C作用lh，洗滌加適當稀釋后的辣根過氧化物酶標兔抗豬IgG或IgA抗體，37°C lh， 含四甲基聯苯胺和H202的TMB顯色液顯色后酶標儀檢測0D450。
[0052] 有益效果
[0053] 1本試驗構建的整合表達質粒plncotGSR是目前國內外第一個豬傳染性胃腸炎病 毒S蛋白重組枯草芽孢桿菌表達質粒。
[0054] 2本發明成功構建了豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白重組型枯草芽孢桿菌整合表達質 粒plncotGSR，并轉化進入枯草芽孢桿菌WB800。經Western-blot驗證豬傳染性胃腸炎病 毒S蛋白在重組枯草芽孢桿菌WB800內可以被成功表達。并通過口服免疫可以刺激一月齡 仔豬機體產生有效的TGEV特異性免疫應答水平。重組枯草芽孢桿菌WB800有望開發成預 防豬傳染性胃腸炎的基因工程口服疫苗。
[0055] 3本發明構建了枯草芽孢桿菌遞送表達系統，可插入各種抗原、活性肽和藥物等， 有利于開發各種重組枯草芽孢桿菌疫苗，為枯草芽孢桿菌在動物黏膜免疫以及口服基因工 程活疫苗等方面的研究奠定基礎。下面結合附圖及具體實施技術對本發明做進一步說明。 四、
【附圖說明】：
[0056] 圖1 :枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端基因 amyE 5、枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 3端基 因 amyE3和硫酸卡那霉素抗性基因 Kaf的PCR擴增結果凝膠電泳圖
[0057] 圖2 :枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因 cotG的PCR擴增結果凝膠電泳圖
[0058] 圖3 :豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因 S的PCR擴增結果凝膠電泳圖
[0059] 圖4 :紅色熒光蛋白基因 RFP的PCR擴增結果凝膠電泳圖
[0060] 圖5 :構建的整合表達骨架質粒plnAmyE示意圖
[0061] 圖6 :構建的整合表達載體質粒plncotGSR示意圖
[0062] 圖7 :整合表達骨架質粒plnAmyE酶切驗證電泳圖
[0063] 圖8 :整合表達載體質粒plncotGSR酶切驗證電泳圖
[0064] 圖9 :重組枯草芽孢桿菌WB800基因組PCR驗證電泳圖
[0065] 圖10 :重組枯草芽孢桿菌WB800表達產物Western-blot (免疫印跡圖）
[0066] 圖11 :重組枯草芽孢桿菌WB800共聚焦觀察圖
[0067] 圖12 :重組枯草芽孢桿菌WB800對TGEV特異性IgG水平變化的影響圖
[0068] 圖13 :重組枯草芽孢桿菌WB800對TGEV特異性SIgA水平變化的影響圖 五、
【具體實施方式】
[0069] 1整合表達質粒plncotGSR的構建
[0070] 下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規方法。具體涉及的材料和試劑 如下：枯草芽孢桿菌WB800菌株由南京農業大學植物保護學院高學文惠贈，文獻見：Wu， Η·，Wang，S.，Qiao, J.，Liu，J.，Zhan，J.，Gao, X.，2009. Expression of HpaGxooc protein in Bacillus subtilis and its biological functions. Journal of microbiology and biotechnology 19,194-203;
[0071] 豬傳染性胃腸炎病毒SHXB毒株由江蘇省農科院獸醫所何孔旺惠贈，文獻 見：Weiwei，H.，Qinghua，Y.，Liqi，Z.，Haofei，L.，Shanshan，Z.，Qi，G.，Kongwang， H.，Qian，Y. 2014. Complete genomic sequence of the coronavirus transmissible gastroenteritis virus SHXB isolated in China. Archives of virology 159， 2295-2302 ；
[0072] E. coli JM109、質粒 pDsRed-monomer-Nl (購自 Takara);質粒 pMK3、pCDNA3. 1 (購 自 Life Technologies)；
[0073] 試劑：Q5 高保真酶購自 NEB 公司；pMD19_T 載體，Agarose Gel DNA Purification Kit，限制性內切酶，T4連接酶等均購自Takara公司；硫酸卡那霉素，氨芐青霉素，細菌基因 組提取試劑盒，病毒RNA提取試劑盒等均購自OMEGA公司；試劑MLV-反轉錄酶購自Promega 公司；One Step Cloning Kit定點克隆試劑盒購自Vazyme公司；辣根過氧化物酶標兔抗豬 IgG和IgA抗體購自BETHYL公司；含四甲基聯苯胺和H202的TMB顯色液購自TIANGEN公司。
[0074] 1. 1枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端和3端的克隆
[0075] 參照已發表的枯草芽孢桿菌的amyE序列（GenBank登陸號：NZ_CM000487. 1)，設計 一對擴增amyE 5的引物，并在上、下游引物5端分別引入NheI、HindIII酶切位點（下劃線 為酶切位點），引物序列如下：
[0076] PI：GCTAGCATTCTCCAGTCTTCACATCGGT
[0077] P2 ：AAGCTTTCTTCATCATCATTGGCATACG
[0078] 設-Η對擴增amyE 3的引物，并在上、下游引物5端分別引入Kpnl、Xhol酶切位 點（下劃線為酶切位點），引物序列如下：
[0079] P3 ：GGTACCATGATATCCGTTTAGGCTGGGC
[0080] P4 ：CTCGAGCTTTGATGTCTTTTTGTTTGTGAA
[0081] 以枯草芽孢桿菌WB800提取的DNA為模板，分別用合成的Pl、P2和P3、P4引物常 規PCR克隆枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端和3端。如圖1可知：1為PCR成功克隆llOObp 的amyE 5 ;2為PCR成功克隆1170bp的amyE 3。切取目的條帶，經DNA純化試劑盒回收后， 連接到PMD19-T載體上，構建的載體分別命名為T-amyE 5和T-amyE 3,經菌落PCR及酶切 驗證后測序。所獲得的序列經BLAST及DNAstar與GenBank上已發表的序列比對。所克隆 的枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端和3端序列與已經在GenBank上發表的序列的同源性為 100%〇
[0082] 1. 2硫酸卡那霉素抗性基因的克隆
[0083] 參照已發表的硫酸卡那霉素抗性基因序列（GenBank登陸號：EU549779. 1)設計一 對擴增Kaf的引物，并在上游引物5端引入Kpnl、Hindlll酶切位點，下游引物5端引入 ΚρηΙ酶切位點（下劃線為酶切位點），引物序列如下：
[0084] Ρ5 ：GGTACCAAGCTTTTCAACAAACGGGCCAGTTT
[0085] P6 ： GGTACCTCAAAATGGTATGCGTTTTGACA
[0086] 以pMK3質粒為模板，用合成的P5、P6引物常規PCR克隆硫酸卡那霉素抗性基因。 如圖1可知：3為PCR成功克隆193bp的Kaf。切取目的條帶，經DNA純化試劑盒回收后， 連接到PMD19-T載體上，構建的載體命名為T-Kan%經菌落PCR及酶切驗證后測序。所獲得 的序列經BLAST及DNAstar與GenBank上已發表的序列比對。所克隆的硫酸卡那霉素抗性 基因序列與已經在GenBank上發表的序列的同源性為100%。
[0087] 1. 3枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因的克隆
[0088] 參照已發表的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列（GenBank登陸號：NZ_ CM000487. 1)設計一對擴增被膜蛋白G基因 cotG的引物，并在上游引物5端引入與枯草芽 孢桿菌amyE53'末端15bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點（下劃線為 酶切位點）；下游引物5端引入與S蛋白基因5'末端10bp的同源臂序列，兩序列之間引入 Nhel酶切位點（下劃線為酶切位點），引物序列如下：
[0089] P7 ：ATGATGATGAAGAGAAGCTTTTTCCCTTTCTAAATCGC
[0090] P8 ：GTTTTTTCATGCTAGCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCC
[0091] 以枯草芽孢桿菌提取的DNA為模板，用合成的P7、P8引物常規PCR克隆枯草芽孢 桿菌被膜蛋白G基因。如圖2:可知PCR成功克隆1218bp的cotG。切取目的條帶，經DNA 純化試劑盒回收后，連接到PMD19-T載體上，構建的載體命名為T-cotG，經菌落PCR及酶切 驗證后測序。所獲得的序列經BLAST及DNAstar與GenBank上已發表的序列比對。所克隆 的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列與已經在GenBank上發表的序列的同源性為100%。
[0092] 1. 4豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因的克隆
[0093] 參照已發表的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因序列（GenBank登陸號：KP202848) 設計一對擴增S蛋白基因 cDNA的引物，在上游引物引入與枯草芽孢桿菌cotG 3'末端12bp 的同源臂序列，兩序列之間引入Nhel酶切位點（下劃線為酶切位點）；在下游引物引入與 紅色熒光蛋白基因 RFP 5'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點（下 劃線為酶切位點），引物序列如下：
[0094] P9 ：AAGAAATACAAAGCTAGCATGAAAAAACTATTTGTG
[0095] P10 ：GGTGTTGTCCATAAGCTTATGGACGTGCACTTTTTCA
[0096] 以豬傳染性胃腸炎病毒SHXB毒株提取的總RNA為模板，經MLV-反轉錄酶合成 cDNA第一鏈；以cDNA為模板，用合成的P9、P10引物常規PCR克隆豬傳染性胃腸炎病毒S 蛋白基因。如圖3:可知PCR成功克隆4344bp的S。切取目的條帶，經DNA純化試劑盒回收 后，連接到PMD19-T載體上，構建的載體命名為T-S，經菌落PCR及酶切驗證后測序。所獲得 的序列經BLAST及DNAstar與GenBank上已發表的序列比對。所克隆的豬傳染性胃腸炎 病毒S蛋白基因序列與已經在GenBank上發表的序列的同源性為100%
[0097] 1. 5紅色灰光蛋白基因的克隆
[0098] 參照已發表的紅色熒光蛋白基因序列（GenBank登陸號：AB166761. 1)設計一對擴 增紅色熒光蛋白基因 RFP的引物，在上游引物引入與S蛋白基因3'末端12bp的同源臂序 列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點（下劃線為酶切位點）；在下游引物引入與枯草芽孢 桿菌amyE 35'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入Hindlll酶切位點（下劃線為酶 切位點），引物序列如下：
[0099] Pll：GTGCACGTCCATAAGCTTATGGACAACACCGAGGAC
[0100] P12 ：GTCGACGGTACCAAGCTTCTACTGGGAGCCGGAGTG
[0101] 以pDsRed-monomer-Nl質粒為模板，用合成的Pll、P12引物常規PCR克隆紅色熒 光蛋白基因。如圖4:可知PCR成功克隆678bp的RFP。切取目的條帶，經DNA純化試劑盒 回收后，連接到PMD19-T載體上，構建的載體命名為T-RFP，經菌落PCR及酶切驗證后測序。 所獲得的序列經BLAST及DNAstar與GenBank上已發表的序列比對。所克隆的紅色熒光蛋 白基因序列與已經在GenBank上發表的序列的同源性為100%。
[0102] 1. 6重組表達載體骨架plnAmyE的構建
[0103] 將枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端、硫酸卡那霉素抗性基因和枯草芽孢桿菌解淀粉 酶E3端利用酶切連接技術依次克隆至載體p⑶NA3. 1上，獲得整合表達載體骨架plnAmyE。
[0104] 1. 7重組表達載體plncotGSR的構建
[0105] 將plnAmyE用限制性核酸內切酶Hindlll進行單酶切，并回收；枯草芽孢桿菌被 膜蛋白G基因、豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因和紅色熒光蛋白基因進行重疊 PCR后，使用 One Step Cloning Kit定點克隆試劑盒克隆至整合表達載體骨架plnAmyE上，獲得整合表 達載體 plncotGSR。
[0106] 1. 8整合表達載體骨架plnAmyE的驗證
[0107] 采用限制性核酸內切酶NheI、HindIII、KpnI和Xhol，分別用雙酶切驗證整合表達 載體骨架PlnAmyE。如圖7可知：1為整合表達載體骨架plnAmyE，經Nhel和Hindlll雙酶 切得到llOObp上游整合位點amyE 5 ;2為整合表達載體骨架plnAmyE，經Hindlll和ΚρηΙ 雙酶切得到930bp篩選基因 Kan1^為整合表達載體骨架plnAmyE，經ΚρηΙ和Xhol雙酶切 得到1170bp下游整合位點amyE 3。
[0108] 1. 9整合表達載體plncotGSR的驗證
[0109] 采用限制性核酸內切酶Hindlll酶切驗證整合表達載體plncotGSR。如圖8可知： 1、2、3為整合表達載體plncotGSR經HindllI酶切得到6252bp枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基 因、豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因和紅色熒光蛋白基因融合片段。
[0110] 2重組豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白枯草芽孢桿菌WB800的驗證
[0111] 將構建的整合表達質粒PlncotGSR采用電擊轉化的方法，取60 μ L枯草芽孢桿菌 WB800電轉化感受態細胞與1 μ L(50ng/μ L)整合表達載體plncotGSR質粒混合加入電擊 杯中冰浴5min后進行電擊（型號：BTX ECM630)，電擊條件：22KV/cm，25 μ F，200 Ω，電擊一 次。加入lmL電擊恢復液，37°C孵育3h，卡那抗性固體基礎培養基LB平板篩選電擊恢復液， 14-18h可見陽性菌落，培養陽性菌落并提取基因組，經PCR驗證，重組豬傳染性胃腸炎病毒 S蛋白枯草芽孢桿菌WB800內均含有豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白AD位點基因 （1050bp)。 PCR驗證引物如下：
[0112] P13 :TCATTGAACACAACGGGTGGTGTC
[0113] P14 ：TAAGCCACTAAGTAGCGTCCTGTTAG
[0114] 以上引物均由上海英濰捷基貿易有限公司合成；
[0115] 如圖9可知：均為含有豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因的陽性重組豬傳染性胃腸 炎病毒S蛋白枯草芽孢桿菌WB800菌株基因組。
[0116] 3重組豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白枯草芽孢桿菌WB800的Western-blot分析
[0117] 對重組枯草芽孢桿菌WB800溶菌酶處理，對表達產物進行Western-blot分析， 結果與鼠抗紅色熒光蛋白單抗呈現陽性反應，如圖10可知：2、3、4為重組枯草芽孢桿菌 WB800 (基因組中含cotG、S、RFP)與1為枯草芽孢桿菌WB800 (基因組中未整合外源基因） 相比，在209kD處有一條明顯的蛋白印跡帶，且無非特異性條帶出現，證明豬傳染性胃腸炎 病毒S蛋白在重組枯草芽孢桿菌WB800內可以被成功表達。
[0118] 4重組豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白枯草芽孢桿菌WB800的共聚焦顯微鏡觀察
[0119] 將重組枯草芽孢桿菌WB800涂片，進行共聚焦顯微鏡（型號：ZISS LSM730)觀察， 如圖11可知：1為正常枯草芽孢桿菌WB800芽孢；2為重組枯草芽孢桿菌WB800芽孢，呈現 紅色熒光；3為正常枯草芽孢桿菌WB800。
[0120] 5 口服免疫重組枯草芽孢桿菌WB800菌株機體免疫應答水平的檢測
[0121] 空枯草芽孢桿菌WB800菌株（基因組中未整合外源基因）和表達豬傳染性胃 腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌WB800菌株分別口服免疫一月齡仔豬，口服劑量為 1 X lO^fu/kg，首免一周后按相同劑量進行二免，每周進行血清和糞便的采集，飼養周期為 五周。采用間接ELISA的方法進行TGEV特異性IgG和特異性SIgA抗體水平變化檢測。檢 測方法為：豬傳染性胃腸炎抗原包被過夜，1% BSA(牛血清白蛋白）37°C封閉2h，洗滌后加 待檢樣品37°C作用1 h，洗滌加適當稀釋后的辣根過氧化物酶標兔抗豬IgG或IgA抗體， 37°C lh，含四甲基聯苯胺和H202的TMB顯色液顯色后酶標儀檢測0D450。如圖12可知：口服 重組枯草芽孢桿菌WB800菌株組仔豬血清中TGEV特異性IgG抗體與口服空枯草芽孢桿菌 WB800菌株組相比（首免后第0天除外）均顯著提高（P<0. 01，P<0. 05)。如圖13可知： 口服重組枯草芽孢桿菌WB800菌株組仔豬糞便中TGEV特異性SIgA抗體與口服空枯草芽孢 桿菌WB800菌株組相比在首免后第7天、14天和21天均顯著提高（P < 0. 01，P < 0. 05)。
[0122] 應用
[0123] 本發明涉及表達豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)S蛋白的重組枯草芽孢桿菌WB800菌 株，有望成為一種豬傳染性胃腸炎口服枯草芽孢桿菌基因工程疫苗；同時為開展枯草芽孢 桿菌黏膜免疫遞送活載體的研究提供了技術方案。
【主權項】
1. 一種豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的整合表達質粒plncotGSR，是由以下方法構建而 成： I. 1枯草芽孢桿菌解淀粉酶E 5端和3端的克隆 參照已發表的枯草芽孢桿菌的amyE序列（GenBank登陸號：NZ_CM000487. 1)，設計一對 擴增amyE 5的引物，并在上、下游引物5端分別引入NheI、HindIII酶切位點（下劃線為酶 切位點），引物序列如下： Pl ：GCTAGCATTCTCCAGTCTTCACATCGGT P2 ：AAGCTTTCTTCATCATCATTGGCATACG 設-Η對擴增amyE 3的引物，并在上、下游引物5端分別引入KpnI、XhoI酶切位點（下 劃線為酶切位點），引物序列如下： P3 ：GGTACCATGATATCCGTTTAGGCTGGGC P4 ：CTCGAGCTTTGATGTCTTTTTGTTTGTGAA 以枯草芽孢桿菌WB800提取的基因組DNA為模板，用合成的PUP2引物PCR擴增amyE 5及P3、P4引物擴增amyE 3序列，PCR反應體系均為50yL，amyE 5PCR反應條件：95°C預變 性 5min，95°C 30sec，69°C 30sec，72°C IminJOcycles，？〗。。10min，4°C IOmin ;amnyE 3PCR 反應條件為 95°C預變性 5min ;95°C 30sec，69°C 30sec，72°C lmin，30cycles，72°C lOmin， 4°C lOmin，將PCR產物連接到pMD19-T載體上，構建的載體分別命名為T-amyE 5和T-amyE 3。測序后獲得具有枯草芽孢桿菌amyE 5的DNA序列SEQ ID NO. 1和具有枯草芽孢桿菌 amyE 3 的 DNA 序列 SEQ ID NO. 2。 1. 2硫酸卡那霉素抗性基因的克隆 參照已發表的硫酸卡那霉素抗性基因序列（GenBank登陸號：EU549779. 1)設計一對擴 增Kaf的引物，并在上游引物5端引入KpnI、HindIII酶切位點，下游引物5端引入KpnI酶 切位點（下劃線為酶切位點），引物序列如下： P5 ：GGTACCAAGCTTTTCAACAAACGGGCCAGTTT P6 ：GGTACCTCAAAATGGTATGCGTTTTGACA 以pMK3質粒為模板進行PCR擴增；PCR反應體系為50 μ L，PCR反應條件：95°C預變性 5min，95°C 30sec，7rC 30sec，72°C IminjocyclesJScC 10min，4°C IOmin;將 PCR 產物連 接到PMD19-T載體上，構建的載體命名為T-Kan%測序后獲得具有完整編碼區的硫酸卡那霉 素抗性基因序列SEQ ID NO. 3。 1. 3枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因的克隆 參照已發表的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列（GenBank登陸號：NZ_CM000487. 1) 設計一對擴增被膜蛋白G基因 cotG的引物，并在上游引物5端引入與枯草芽孢桿菌amyE 53'末端15bp的同源臂序列，兩序列之間引入HindIII酶切位點（下劃線為酶切位點）；下 游引物5端引入與S蛋白基因5'末端IObp的同源臂序列，兩序列之間引入NheI酶切位點 (下劃線為酶切位點），引物序列如下： P7 ：ATGATGATGAAGAGAAGCTTTTTCCCTTTCTAAATCGC P8 ：GTTTTTTCATGCTAGCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCC 以枯草芽孢桿菌WB800提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增；PCR反應體系為50 μ L， ?〇?反應條件：95。(：預變性5111丨11，951€3〇86(3,711€3〇86(3,72。(：1111丨111286(3,3(^7(3168， 72°C 10min，4°C IOmin ;將PCR產物連接到pMD19-T載體上，構建的載體命名為T-cotG，測 序后獲得具有完整編碼區的枯草芽孢桿菌被膜蛋白G基因序列SEQ ID NO. 4。 1. 4豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因的克隆 參照已發表的豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因序列（GenBank登陸號：KP202848)設計 一對擴增S蛋白基因 cDNA的引物，在上游引物引入與枯草芽孢桿菌cotG 3'末端12bp的 同源臂序列，兩序列之間引入NheI酶切位點（下劃線為酶切位點）；在下游引物引入與紅 色熒光蛋白基因 RFP 5'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入HindIII酶切位點（下 劃線為酶切位點），引物序列如下： P9 ：AAGAAATACAAAGCTAGCATGAAAAAACTATTTGTG PlO ：GGTGTTGTCCATAAGCTTATGGACGTGCACTTTTTCA 以豬傳染性胃腸炎病毒SHXB毒株（豬傳染性胃腸炎病毒強毒株）提取的總RNA為模 板，經MLV-反轉錄酶合成cDNA第一鏈后進行PCR擴增；PCR反應體系為50 μ L，PCR反應條 件：95Γ預變性 5min，95°C 30sec，67°C 30sec，72°C 4min，30cycles，72Γ lOmin，4Γ IOmin ; 將PCR產物連接到pMD19-T載體上，構建的載體命名為T-S，測序后獲得具有完整編碼區的 豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白基因序列SEQ ID NO. 5。 1. 5紅色熒光蛋白基因的克隆 參照已發表的紅色熒光蛋白基因序列（GenBank登陸號：AB166761. 1)設計一對擴增紅 色熒光蛋白基因 RFP的引物，在上游引物引入與S蛋白基因3'末端12bp的同源臂序列，兩 序列之間引入HindIII酶切位點（下劃線為酶切位點）；在下游引物引入與枯草芽孢桿菌 amyE 35'末端12bp的同源臂序列，兩序列之間引入HindIII酶切位點（下劃線為酶切位 點），引物序列如下： PU ：GTGCACGTCCATAAGCTTATGGACAACACCGAGGAC PI2 ：GTCGACGGTACCAAGCTTCTACTGGGAGCCGGAGTG 以pDsRed-monomer-Nl質粒為模板進行PCR擴增；PCR反應體系為50 μ L，PCR反 應條件：95 cC 預變性 5min，95 cC 30sec，72 cC 30sec，72 cC 48sec，30cycles，72 cC 10min， 4°C IOmin ;將PCR產物連接到pMD19-T載體上，構建的載體命名為T-RFP，測序后獲得具有 完整編碼區的紅色熒光蛋白基因序列SEQ ID NO. 6。 1. 6整合表達載體骨架pInAmyE的構建 利用酶切連接技術，分別將SEQ ID NO. 1序列、SEQ ID NO. 3序列和SEQ ID NO. 2序列克 隆至載體P⑶NA3. 1上，獲得整合表達骨架載體pInAmyE。采用限制性內切酶NheI、HindIII、 KpnI和XhoI，分別用雙酶切驗證。 1. 7整合表達載體plncotGSR的構建 以SEQ ID NO. 4序列、SEQ ID NO. 5序列和SEQ ID NO. 6序列為模板，用引物P7、P12 進行重疊 PCR擴增，PCR反應體系為50yL，PCR反應條件：95°C預變性5min，95°C 30sec， 72°C 30sec，72°C 5min，30cycles，72°C 10min，4°C IOmin ;將 PCR 產物回收，并使用 One Step Cloning Kit定點克隆試劑盒克隆至載體骨架pInAmyE上，測序后獲得整合表達載體 plncotGSR。2. -種用權利要求1所述整合表達質粒電轉化獲得的表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋 白的重組枯草芽孢桿菌。該重組枯草芽孢桿菌WB800菌株，屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)。是由以下方法轉化而成： 取60以1^枯草芽孢桿菌18800電轉化感受態細胞與1以1^(50即/^1^)整合表達載 體plncotGSR質粒混合加入電擊杯中冰浴5min后進行電擊，電擊條件：22KV/cm，25 μ F， 200 Ω，電擊一次。加入ImL電擊恢復液，37°C IOOrpm孵育3h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固 體基礎培養基LB平板，14-18h可見陽性菌落。3. -種用權利要求2所述表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組枯草芽孢桿菌WB800 菌株口服一月齡仔豬，可以刺激一月齡仔豬機體產生有效的TGEV特異性免疫應答水平的 生物學應用。動物試驗以及免疫檢測方法如下： 空枯草芽孢桿菌WB800菌株（基因組中未整合外源基因）和表達豬傳染性胃腸炎病毒 S蛋白的重組枯草芽孢桿菌WB800菌株分別口服免疫一月齡仔豬，口服劑量為IX IO1Yfu/ kg，首免一周后按相同劑量進行二免，每周進行血清和糞便的采集，飼養周期為五周。采用 間接ELISA的方法進行TGEV特異性IgG和特異性SIgA水平變化檢測，檢測方法為：豬傳染 性胃腸炎抗原包被過夜，1 % BSA (牛血清白蛋白）37 °C封閉2h，洗滌后加待檢樣品37 °C作用 lh，洗滌加適當稀釋后的辣根過氧化物酶標兔抗豬IgG或IgA抗體，37°C lh，含四甲基聯苯 胺和H2O2的TMB顯色液顯色后酶標儀檢測0D450。結果發現表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋 白的重組枯草芽孢桿菌WB800菌株可以刺激一月齡仔豬機體產生有效的TGEV特異性免疫 應答水平。
【文檔編號】C12N1/21GK105886523SQ201410833720
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月25日
【發明人】楊倩, 牟春曉, 朱立麒, 林 建
【申請人】南京農業大學