一種高效的細菌轉化方法
【專利摘要】本發明公開了一種高效的細菌轉化方法，其主要內容包括：(1)納米氧化鋁可用于細菌的轉化；(2)革蘭氏陰性菌HB101、K12可基于納米氧化鋁作用發生轉化；(3)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌可基于納米氧化鋁作用發生轉化。本發明的技術和方法不要求低溫條件，室溫即可實現；本發明步驟簡便，無熱激步驟；本發明高效，細菌轉化效率高于統CaCl2法；本發明不但能實現革蘭氏陰性菌轉化，也可以實現革蘭氏陽性菌轉化。因此本發明中的技術和方法簡單、高效、通用，非常適合實驗室科研及工程菌制備等領域。
【專利說明】
一種高效的細菌轉化方法
技術領域
[0001]本發明屬于分子生物學與基因工程技術領域，具體涉及一種基于納米氧化鋁的高效細菌轉化方法。
【背景技術】
[0002]把外源基因導入受體細菌中，使之具有新的可遺傳性狀的過程稱之為轉化，是現代基因工程與分子生物學最重要的操作技術之一。轉化效率的高低決定后續工作的開展，而細菌的狀態是影響轉化效率最關鍵的因素之一。目前革蘭氏陽性細菌發生轉化比較困難，高效成熟的技術尚處于探索之中。革蘭氏陰性細菌以大腸桿菌為例感受態細胞的獲得方法主要有兩種，CaCl2法和電轉化法，其缺陷要么是步驟復雜轉化率低，要么是需要特定的儀器設備條件，且對于低溫環境和細菌的對數生長狀態都有較高的要求。納米材料能引起細菌細胞膜的氧化損傷，引起皺褶甚至孔洞，造成膜功能通透性的改變。因此探究一種基于納米材料作用的轉化效率高、操作步驟簡單、溫度和細菌生長條件要求低、革蘭氏陰性菌和陽性菌通用的細菌轉化方法對分子生物學與基因工程技術領域具有重要的意義。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種基于納米鋁高效細菌轉化方法。本發明用納米氧化鋁處理方法實現細菌轉化，可以用10ng質粒與18細胞作用獲得15-1O7個轉化子。
[0004]本發明的技術方案概述如下:
[0005]一種基于納米氧化鋁的高效細菌轉化方法，包括以下步驟:
[0006](I)挑取新活化的細菌單克隆，接種到1ml Luria-Bertani培養基,在37°C、21Orpm條件下振蕩培養至0D_約為I ;
[0007](2)將(I)中的菌體按 1%接種到 1ml Luria-Bertani 培養基,在 37°C、210rpm條件下振蕩培養12h ；
[0008](3)用Luria-Bertani培養基將(2)中的菌體稀釋100倍，取1.5ml菌體稀釋液置于滅菌的1.5ml離心管中，在室溫下離心，棄上清收集細菌，離心參數為5000 X 1min ；
[0009](4)向離心管中加入濃度10mmol/L的納米氧化鋁(顆粒直徑小于50nm) 100 μ I與細菌細胞震蕩混勻，室溫下靜止作用一定時間；
[0010](5)將菌液過0.22 μ m微孔濾膜，濾除去納米氧化鋁顆粒；
[0011](6)滅菌生理鹽水沖洗微孔濾膜回收細胞，在室溫下離心菌液，棄上清去除殘留的納米氧化鋁，離心參數為5000 X 1min ；
[0012](7)用100 μ I生理鹽水重懸菌體細胞備用；
[0013](8)加入10ng質粒DNA,潤輪振蕩2min ；
[0014](9)加 Luria-Bertani 培養基 900 μ I,在 37°C、21rpm 條件下振蕩復蘇 Ih ；
[0015](10)菌液涂布在含有相應抗生素的選擇性平板上，37°C培養，生長的菌落即為轉化成功的克隆。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發明采用的納米鋁原子力顯微鏡照片，其中(a)2D，(b)3D。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明:
[0018]實施例1本發明大腸桿菌HBlOl轉化pBR322質粒及轉化效率檢測
[0019]材料:pBR322質粒、大腸桿菌HB101、納米氧化招(顆粒< 50nm)、CaCl2
[0020]試劑:LB液體培養基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化鈉1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C滅菌20min。LB固體培養基為液體配方加入1.5%的瓊脂。
[0021]主要實施步驟如下:
[0022]一、本發明大腸桿菌HBlOl轉化pBR322質粒及轉化效率檢測
[0023](I)挑取新活化的細菌單克隆，接種到1ml LB培養基，37°C，210rpm，振蕩培養，至OD600約為I ;
[0024](2)將菌體按I %接種到1mi LB培養基，37°C，210rpm,振蕩培養12h ；
[0025](3)菌體稀釋100倍，1.5ml菌體稀釋液/1.5mlEP管，室溫,5000rpm,離心1min,
棄上清，收集細胞；
[0026](4)每1.5mlEP管加入1mM納米氧化鋁(顆粒直徑小于50nm) 100 μ 1，室溫作用9h ；
[0027](5)作用體系過0.22 μ m微孔濾膜，回收細胞，除去納米鋁顆粒；
[0028](6)滅菌的生理鹽水沖洗，室溫，5000rpm，離心lOmin，棄上清去除殘留的納米鋁；
[0029](7)重懸菌體細胞備用；
[0030](8)取100 μ I菌體細胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ngDNA,渦輪振蕩2min ；
[0031](9)加 LB 液體培養基 900μ l，37°C，210rpm，振蕩復蘇 Ih ；
[0032](10)轉化菌體傾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培養，待長出菌落后觀察計數。
[0033]二、CaCl2法大腸桿菌HBlOl轉化pBR322質粒及轉化效率檢測(作為本發明方法的對比)
[0034](I)挑取新活化的細菌單克隆，接種到1ml LB培養基，37°C，210rpm，振蕩培養，至OD600約為I ;
[0035](2)將菌體按I %接種到1ml LB培養基，37°C，210rpm,振蕩培養12h ；
[0036](3)菌體稀釋100倍，1.5ml菌體稀釋液/1.5mlEP管，室溫,5000rpm,離心1min,
棄上清，收集細胞；
[0037](4)每 1.5mlEP 管加入 1.5ml 10mM 冰冷的 CaCl2 中，輕吹，4°C作用 30min ；
[0038](5) 4°C, 5000rpm,離心 1min,棄上清，收集細胞；
[0039](6)菌體重懸于冰冷的CaCl2中，輕吹，4°C備用；
[0040](7)取100 μ I感受細胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ng pBR322質粒，輕輕搖勻，冰上放置30min ；
[0041]⑶42°C水浴，放置90s熱激；
[0042](9)快速置冰浴，保持2min ；
[0043](10)加 LB 液體培養基 900μ l，37°C，210rpm，振蕩復蘇 lh。
[0044](11)轉化菌體傾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培養，待長出菌落后觀察計數。
[0045]本發明方法轉化效率7.30±0.91 XlOVyg pBR322plasmid
[0046]傳統CaCl2 方法轉化效率 3.65±0.51 X 16/ μ g pBR322plasmid
[0047]結論:由上述結果可知，本發明方法可實現革蘭氏陰性菌大腸桿菌HBlOl轉化PBR322質粒，其轉化效率是傳統氯化鈣法的20倍左右。
[0048]實施例2本發明大腸桿菌K12轉化pBR322質粒及轉化效率檢測
[0049]材料:pBR322質粒、大腸桿菌K12、納米氧化鋁(顆粒< 50nm)
[0050]試劑:LB液體培養基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化鈉1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C滅菌20min。LB固體培養基為液體配方加入1.5%的瓊脂。
[0051]主要實施步驟如下:
[0052](I)挑取新活化的細菌單克隆，接種到1ml LB培養基，37°C，210rpm，振蕩培養，至OD600約為I ;
[0053](2)將菌體按I %接種到1ml LB培養基，37°C，210rpm,振蕩培養12h ；
[0054](3)菌體稀釋100倍，1.5ml菌體稀釋液/1.5mlEP管，室溫,5000rpm,離心1min,
棄上清，收集細胞；
[0055](4)每1.5mlEP管加入1mM納米氧化鋁(顆粒直徑小于50nm) 100 μ 1，室溫作用9h ；
[0056](5)作用體系過0.22 μ m微孔濾膜，回收細胞，除去納米鋁顆粒；
[0057](6)滅菌的生理鹽水沖洗,室溫，5000rpm,離心1min,棄上清去除殘留的納米氧化招；
[0058](7)重懸菌體細胞備用；
[0059](8)取100 μ I菌體細胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ngDNA,渦輪振蕩2min ；
[0060](9)加 LB 液體培養基 900 μ 1，37°C，210rpm,振蕩復蘇 Ih ；
[0061](10)轉化菌體傾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培養，待長出菌落后觀察計數。
[0062]本發明方法轉化效率3.53 ± 1.28χ105/μ g pBR322plasmid
[0063]結論:由上述結果可知，本發明方法可以實現革蘭氏陰性菌大腸桿菌K12轉化PBR322 質粒。
[0064]實施例3本發明金黃色葡萄球菌轉化PBR322質粒及轉化效率檢測
[0065]材料:pBR322質粒、金黃色葡萄球菌、納米氧化鋁(顆粒< 50nm)
[0066]試劑:LB液體培養基:蛋白胨1g,酵母提取物5g,氯化鈉1g,蒸懼水定容至1000ml, 121°C滅菌20min。LB固體培養基為液體配方加入0.9%的瓊脂。
[0067]主要實施步驟如下:
[0068](I)挑取新活化的細菌單克隆，接種到1ml LB培養基，37°C，210rpm，振蕩培養，至OD600約為I ;
[0069](2)將菌體按I %接種到1ml LB培養基，37°C，210rpm,振蕩培養12h ；
[0070](3)菌體稀釋100倍，1.5ml菌體稀釋液/1.5mlEP管，室溫,5000rpm,離心1min,
棄上清，收集細胞；
[0071](4)每1.5mlEP管加入1mM納米氧化鋁(顆粒直徑小于50nm) 100 μ 1，室溫作用9h ；
[0072](5)作用體系過0.22 μ m微孔濾膜，回收細胞，除去納米氧化鋁顆粒；
[0073](6)滅菌的生理鹽水沖洗,室溫，5000rpm,離心1min,棄上清去除殘留的納米氧化招；
[0074](7)重懸菌體細胞備用；
[0075](8)取100 μ I菌體細胞(1s)置于1.5mlEP管，加入10ngDNA,渦輪振蕩2min ；
[0076](9)加 LB 液體培養基 900 μ 1，37°C，210rpm,振蕩復蘇 Ih ；
[0077](10)轉化菌體傾注在抗性平板中，含Amp 80μ g/ml, Tet 50mg/ml，37°C培養，待長出菌落后觀察計數。
[0078]本發明方法轉化效率2.96 ±0.56x106/μ g pBR322plasmid
[0079]結論:由上述結果可知，本發明方法可以實現革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌轉化PBR322 質粒。
【主權項】
1.一種高效的細菌轉化方法，其特征包括以下步驟: (1)挑取新活化的細菌單克隆，接種到1mlLuria-Bertani培養基,在37°C、210rpm條件下振蕩培養至0D6。。約為I ; (2)將(I)中的菌體按1%接種到1mlLuria-Bertani培養基,在37°C、210rpm條件下振蕩培養12h ； (3)用Luria-Bertani培養基將(2)中的菌體稀釋100倍，取1.5ml菌體稀釋液置于滅菌的1.5ml離心管中，在室溫下離心，棄上清收集細菌，離心參數為5000 X 1min ； (4)向離心管中加入濃度10mmol/L的納米氧化鋁(顆粒直徑小于50nm)100 μ I與細菌細胞震蕩混勻，室溫下靜止作用一定時間； (5)將菌液過0.22 μ m微孔濾膜，濾除去納米氧化鋁顆粒； (6)滅菌生理鹽水沖洗微孔濾膜回收細胞，在室溫下離心菌液，棄上清去除殘留的納米氧化鋁，離心參數為5000 X 1min ； (7)用100μ I生理鹽水重懸菌體細胞備用； (8)加入10ng質粒DNA,潤輪振蕩2min； (9)加Luria-Bertani培養基900μ I,在37°C、21rpm條件下振蕩復蘇Ih ； (10)菌液涂布在含有相應抗生素的選擇性平板上，37°C培養，生長的菌落即為轉化成功的克隆。
【文檔編號】C12N15/74GK105886522SQ201410668128
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月20日
【發明人】邱志剛, 李君文, 丁誠實, 金敏, 諶志強, 楊棟, 王新為
【申請人】中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所