一種蘋果酸脫氫酶基因rkmdh1及其重組表達載體的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種從紅冬孢酵母YM25235中分離的編碼蘋果酸脫氫酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，通過構建重組載體并在大腸桿菌中表達，表達產物具有蘋果酸脫氫酶功能，能催化蘋果酸轉化成草酰乙酸。
【專利說明】
一種蘋果酸脫氫酶基因RKMDH1及其重組表達載體
技術領域
[0001]本發明涉及一種蘋果酸脫氫酶基因/aMH/及其重組表達載體，具體涉及以紅冬孢酵母(Rhodosporidiun kratochvi /ov?;e)YM25235總RNA反轉錄的cDNA為模板，擴增得到編碼蘋果酸脫氫酶(MDH)的基因，將其克隆到大腸桿菌表達載體后誘導表達，親和層析法純化后得到純酶，并對該酶進行了酶活測定及酶學性質的相關研究，屬于基因工程和酶工程領域。
【背景技術】
[0002]蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布于生物體內，是一種活性非常強的酶，它催化草酰乙酸鹽和蘋果酸鹽的相互轉化反應，與二核苷酸輔酶的氧化還原相關。草酰乙酸鹽在許多代謝途徑中都有重要作用，包括三羧酸循環、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原異生等，并維持氧化還原平衡，還能促進胞質和亞細胞器代謝物的交換。依生物體的功能不同、組織差異、細胞內定位的不同其表達種類不同，MDH具有多種同工酶形式。胞質蘋果酸脫氫酶(cMDH)存在于細胞胞質內，擔負著將NADH轉入線粒體的重任，并且還對調控三羧酸循環有作用，同時cMDH還是核酸通路(NACh)復合體的一個組成部分。
[0003]蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布在動物組織、微生物和植物中。它是一種活性最強的酶，根據亞細胞定位，蘋果酸脫氫酶可分為5種類型，存在于乙醛酸體、線粒體、過氧化物體、葉綠體、細胞漿以及錐蟲甘油體內。MDH為多聚體酶，是由相同或相似亞基組成的二聚體或四聚體，亞基的分子量為30-35kDa，MDH在醫學方面也引起越來越多的關注如利用基因工程疫苗預防人體帶絳蟲病已是備受關注的研究方向，通過牛帶絳蟲亞洲亞種MDH基因的生物信息學分析，預測到胞漿型MDH是一個潛在的診斷抗原，這為帶絳蟲在診斷、藥物及疫苗研究中的應用前景提供了重要的線索，在臨床診斷中用于多酶分析及疾病的早期診斷，例如用于診斷DIC(彌散性血管內凝血)，心肌梗塞，急慢性肝炎等。在食品領域，蘋果酸脫氫酶用于有機酸含量的測定，如L-蘋杲酸、醋酸、檸檬酸等物質的測定，應用前景廣泛。利用MDH底物專一性，還可將其用于拆分D，L-蘋果酸酶。總之，MDHs作為生物體中樞代謝途徑的關鍵酶，國內外對其己進行了較為廣泛的研究，MDHs同工酶正應用于生物分類、物種分化、遺傳變異、物種雜交和個體發育等研究。因此深入了解MDHs的生理生化特性、結構及功能、催化機制，對于酶重組蛋白的表達、純化及免疫特性分析，探討生物體中MDHs的代謝作用以及一些疾病的分子致病機制有著重要的意義。同時MDH的應用研究也將會推動MDHs轉基因植物及手性藥物的進一步發展。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種從紅冬孢酵母?.?/?.ωη kratochvi lovae)
YM25235中分離的蘋果酸脫氫酶基因/i/MHZ，該基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或該核苷酸序列的片段，或與SEQ ID NO:1互補的核苷酸序列，該基因序列長為948bp(堿基)，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的多肽或其片段。
[0005]本發明另一目的是提供一種含有所分離的蘋果酸脫氫酶基因/aMH?的重組表達載體，是將SEQ ID NO:1所示基因直接與不同表達載體(質粒、病毒或運載體)連接所構建的重組載體。
[0006]本發明另一目的是提供一種含有該蘋果酸脫氫酶基因/?/ΜΗ/的重組表達載體或上述重組表達載體的宿主細胞大腸桿菌(EschericWfl； coli)菌株BL21。
[0007]用本發明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體轉化宿主細胞可用本領域的技術人員熟知的方法進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，用CaCl2、電穿孔等方法進行。當宿主是真核生物，可選用DNA轉染法、顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等方法。
[0008]本發明提供的核苷酸序列是一種高效、特異性的蘋果酸脫氫酶基因，可以將其與載體連接后轉化至微生物細胞體內生產蘋果酸脫氫酶，具有產物特異性高、生產周期短、生產不受場地、氣候、季節的影響及利用不同的菌種和培養基適合開發商業化蘋果酸脫氫酶等優點;本發明應用基因工程技術構建特異性生產蘋果酸脫氫酶的轉基因大腸桿菌生產蘋果酸脫氫酶，具有操作簡單、成本低、可行性高等優點，為蘋果酸脫氫酶基因工程化生產奠定基礎。
【附圖說明】
[0009]圖1為利用本發明的紅冬孢酵母YM25235蘋果酸脫氫酶基因/?/ΜΗ/構建的大腸桿菌重組表達質粒pET32aRKMDHl質粒圖譜；
圖2為本發明的蘋果酸脫氫酶基因/?/ΜΗ/誘導表達并純化后的SDS-PAGE分析圖，其中:I為蛋白電泳Marker;2為轉化了pET32a( + )并經IPTG誘導的大腸桿菌BL21總蛋白；3為轉化了pET32aRKMDHl并經IPTG誘導的大腸桿菌BL21總蛋白；4為純化的目的蛋白條帶。
【具體實施方式】
[0010]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容，實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規試劑和使用常規方法。[0011 ] 實施例1:紅冬孢酵母蘋果酸脫氫酶基因/aMH/的克隆
采用OMEGA試劑盒E.Z.N.A Fungal RNA Ki t從紅冬孢酵母(/fhorfos/jor
/ov?;e)YM25235中提取總RNA，用反轉錄試劑盒Thermo Scientific Maxima HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，取Ιμ?為模板進行聚合酶鏈式反應。設計引物(引物I和引物2)進行PCR擴增，反應所用引物、組分和擴增條件如下:
引物P1:RKMDHF1: 5'-ATGTTCGCCGCTACTCGCTCCAC-3'(SEQ ID NO:3)
引物P2:RKMDHR1: 5'-CTACGCGTGGAGCTCGCCAAC-3' (SEQ ID NO:4)
PCR擴增體系(50 yL)組成如下:
5 X Trans PFU Buffer1yL
dNTP(2.5ymol/L)5yL
cDNAIyL
RKMDHFl(10ymol/L)2yL
RKMDHRl(10ymol/L)2yL
Fast Pfu DNA polymerase(5U/yL)2yL 無菌ddifeO補足至50yL;
擴增條件:94°C變性4min，再用94°C 45s,59°C 45s,72°C 90s進行30個循環，最后72°ClOmin，反應完后取產物lyL，然后在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中，進行電泳分析。經凝膠成像系統成像確認片段大小正確后，用百泰克生物技術有限公司多動能DNA純化回收試劑盒回收目的片段，然后將PCR擴增得到的目的基因連接到PMD18-T上，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，用含有氨芐青霉素(Amp+)的LB固體平板進行篩選，挑取平板上的轉化子進行菌落PCR篩選陽性克隆，然后送去上海生工測序。測序結果結果顯示，獲得一段948bp長的序列，命名為ΖδΜΗΤ，序列組成如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0012]實施例2:重組表達質粒pET32aRKMDHl的構建
采用實施例1中的cDNA為模板進行PCR擴增，反應所用引物組合、反應組分和擴增條件如下:
引物P3:RKMDHF2: 5'-TACGGATCCATGTTCGCCGCTACTCGCTC-3' (SEQ ID NO:5)
引物P4:RKMDHR2: 5'-CGTCTCGAGCGCGTGGAGCTCGCCAAC-3' (SEQ ID NO:6)
PCR擴增體系(50 yL)組成如下:
5X Fast Pfu Buffer1yL
dNTP(2.5 ymol/L)5yL
cDNAIyL
RKMDHF2C10 ymol/L)IyL
RKMDHR2C10 ymol/L)IyL
Fast Pfu DNA polymerase(5U/pL) IyL無菌ddifeO補足至50yL;
擴增條件:94°C變性4min，再用94°C 45s,64°C 45s,72°C 2min進行30個循環，最后72°C 1min;取純化的PCR產物和質粒pET-32a分別用toHI和所III酶切過夜，50μ1 PCR產物反應體系:PCR產物25yL，10 XTango Buffer 10μ1，—ΗΙ2μ1 和所肌/ III 1.5yL，用滅菌的雙蒸水補齊，37°C酶切過夜。50μ1質粒pET-32a反應體系:質粒pET-32a 15μ1，10 XTangoBuffer 10μ1，β_ΗΙ2μ1和所III 1.5yL，用滅菌的雙蒸水補齊，37°C酶切過夜。電泳檢驗酶切產物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產物進行純化和回收。連接體系(1yL):純化的PCR產物和表達載體pET-32a按7:1加樣，140嫩連接酶0.541^，14 Buffer lyL，16°C連接過夜。取連接產物轉入大腸桿菌DH5a中。37°C振蕩培養1.5h后，培養液涂布含氨芐的LB培養基平板，37°C培養箱中培養12h，挑取平板上的轉化子進行菌落PCR，篩選陽性克隆，構建獲得重組表達質粒命名為pET32aRKMDHl，該質粒圖譜如圖1所示。
[0013]實施例3:蘋果酸脫氫酶基因/?/ΜΗ/在大腸桿菌BL21中的誘導表達 1、蘋果酸脫氫酶蛋白RKMDHl的誘導表達及純化
為了驗證該基因編碼蛋白的活性，將Iyg重組質粒pET32aRKMDHl加入50yL大腸桿菌BL21感受態細胞中，將整個體系冰浴30min之后于42°C熱擊90s，再次冰浴2min，然后將連接體系吸取并加入至950yL LB液體培養基中，37°C、100rpm振蕩孵育lh。孵育結束后于5000rpm離心10 min，留下約80yL上清液懸浮沉淀后涂布于含有氨節青霉素(Amp+)的LB固體平板，37°C倒置培養10h。
[0014]挑取陽性轉化子于100 mL LB(含100yg/mL氨芐霉素)培養基中，37 °C振蕩培養過夜，將富集的菌液按1%比例接種到IL LB液體培養基中，于37°C，160rpm培養至0D600值約為0.8。取5ml菌液作為空白對照，其余加入IPTG至終濃度為Immo 1/L，于15 °C恒溫搖床80rpm誘導培養8小時，12000 rpm離心15min收集菌體。SDS-PAGE分析顯示，pET32aRKMDHl轉化的大腸桿菌中表達出一條分子量約為50kD的蛋白(見圖2泳道3)，但在空載體pET32a( + )轉化的大腸桿菌中沒有(見圖2泳道2 )。
[0015]進一步用該菌體懸浮于適量(使菌懸液的OD6qq ? 20)30 mM的咪唑緩沖液中，冰上超聲破碎細胞，4°C、14000 rpm離心15 min。將離心后的上清液用0.2μπι的微型濾膜過濾，濾液上樣于已用30mM味卩坐緩沖液平衡好的His Trap HP柱(I mL，GE Healthcare)，用200mM味唑緩沖液進行洗脫，洗脫液用離心管按順序收集，洗脫樣品用SDS-PAGE電泳檢測，獲得一純蛋白條帶(見圖2泳道4)。
[0016]2、蘋果酸脫氫酶RKMDHl的酶活測定
蘋果酸脫氫酶是調控蘋果酸代謝的關鍵酶，可以催化蘋果酸進行脫氫氧化，伴隨著產生草酰乙酸和NADH。由于MDH的酶活在一定的反應時間內與反應產物NADH的濃度變化呈線性關系，所以MDH的活性可通過檢測NADH的濃度變化來測定。以蘋果酸和NAD(+)為底物加入蘋果酸脫氫酶進行反應，用紫外分光光度計在340nm處測定酶活。MDH酶活的的計算:
單位定義:一個酶活力單位是指25°C時每分鐘生成IymolNADH所需的酶量。
[0017]蘋果酸脫氫酶酶活計算公式:
E=[( Ae/At) XVtXdf]/(eXDXVsXC)
= [(0.315-0.236) X 1.9X95]/(6.42X1X0.02X0.3482)
=318.93U/mg
Vt-----反應溶液總體積(ml)
ε-----340nm處測定的NADH的吸光度為6.42
D-----光路長(I cm)(比色皿直徑)
Vs-----酶液體積(ml)
C-----蛋白質濃度(mg/ml)
A e/ Δ t----1min內340nm處吸光度的變化
df稀釋因子
結果顯示，所純化的蘋果酸脫氫酶RKMDHl的酶活為318.93 U/mg，表明基因重組載體在大腸桿菌BL21中誘導表達出來的蘋果酸脫氫酶RKMDHl具有蘋果酸脫氫酶的活性。
【主權項】
1.一種蘋果酸脫氫酶基因/aMffi，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.—種含有權利要求1所述蘋果酸脫氫酶基因/aMH/的重組表達載體。
【文檔編號】C12N15/53GK105886517SQ201610258939
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月25日
【發明人】張琦, 肖虎, 季秀玲, 魏云林, 林連兵
【申請人】昆明理工大學