一種用于制備檢測禽腺病毒4型試劑盒的引物對及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種用于制備檢測禽腺病毒4型試劑盒的引物對及其應用，該引物對包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明還公開了一種包含所述引物對的試劑盒以及檢測禽腺病毒4型的方法。所述引物對能特異地擴增出樣品中的禽腺病毒4型的Hexon基因片段，檢測靈敏度高，最低檢測限達7.2×10?4ng/μL，結果準確，可將其應用到對禽腺病毒4型的檢測和鑒定當中；引物對對禽腺病毒4型的不同毒株的檢測具有通用性；本發明建立的一種快速、特異、準確的禽腺病毒4型的檢測方法，為今后對該病的流行檢測和防控提供檢測工具。
【專利說明】
一種用于制備檢測禽腺病毒4型試劑盒的引物對及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種用于制備檢測禽腺病毒4型試劑盒的引 物對及其應用。
【背景技術】
[0002] 禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒，可分為I，n，m 三群，其中I群FAdV有12個血清型(FAV1~12)。1群禽腺病毒的不同血清型對禽類的致病性 各有不同，快速準確區分I群禽腺病毒的不同血清型對臨床診斷和治療有十分重要的意義。
[0003] 禽腺病毒編碼的主要結構蛋白有六鄰體(Hexon)、五鄰體(基體、Ilia)、纖突、pVI、 pvn、pvm。已證實六鄰體蛋白帶有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種特異性 抗原決定簇，可以引發極強的中和反應，當六鄰體被替代或突變將導致中和免疫缺失。因 此，Hexon蛋白對診斷I群禽腺病毒的感染有著重要意義。
[0004] 李海英等(2011)對12個血清型毒株進行了 Hexon全基因序列測定和聚合酶鏈式反 應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析。利用三對引物(A、B、C)分別進行I群禽腺病毒 的12個血清型毒株的Hexon全基因序列PCR擴增，并進行序列測定和PCR-RFLP分析，研究表 明，Hexon基因全長為2800左右個核苷酸，編碼約940個氨基酸，不同血清型之間的同源性在 75.2 % -99.5 %，變異范圍是0.5-34.6 %。推導的氨基酸同源性在20.7 % -98.8 %，差異性在 1.1 % -213.0 %。12個血清型之間Hexon全基因序列信息用來評價I群禽腺病毒家族的種系 發育關系，構建的進化樹顯示出五個主要的分支。選用限制性內切酶Haell，利用片段D特異 性可以有效區分大部分血清型。
[0005] I群FAdV的12個血清型均可導致包涵體肝炎，但只有4型腺病毒(FAdV4)會引起心 包積液，該病稱為肝炎-心包積液綜合征，也稱安卡拉病。
[0006] 該病早在1985年就已見有散發病例，1987年3月在巴基斯坦卡拉奇附近的安卡拉 地區一個肉雞場發生暴發性流行。安卡拉病就由此而得名。該病主要危害3~6周齡肉雞，而 后備母雞和蛋雞只偶爾發生。該病潛伏期短，發病急，發病之后迅速波及全群。發育良好的 雞群發病嚴重。發病率高，群體發病率100%，個體平均發病率30%，嚴重的雞群發病率高于 80%。死亡率高，平均死亡率10%，極少數嚴重的雞群死亡率高達60%。
[0007] 安卡拉病在我國通常只是零星爆發。但是2012年以來，該病在我國全國范圍內報 導病例上升，2015年6月以來更是在江蘇、安徽、山東、遼寧、河南、內蒙古等地大規模地流行 和爆發該病，給我國的養雞業帶來了很大的經濟損失。因此，建立一種特異、敏感和快速的 病原檢測方法對于禽腺病毒4型的鑒定具有重要意義。
【發明內容】
[0008] 本發明提供了一個引物對，該引物對能特異性地擴增出禽腺病毒4型的Hexon的基 因片段，能夠用于快速鑒定禽腺病毒4型。
[0009] 引物對，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010] 所述引物對是根據禽腺病毒高度保守的結構蛋白Hexon的基因設計合成的，對禽 腺病毒FAdV4不同毒株的檢測具有通用性。
[0011] 本發明提供了一種所述引物對的PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括：
[0012] (l)DNA提取試劑，包括Digestion Buffer、BD Buffer'Proteinase K、PW Solution、Wash Solution以及Elution Buffer，來自生工UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試 劑盒。
[0013] (2)PCR反應試劑，包括20U/yL的ExTaq酶、10mM的上下游引物，2 · 5mM的dNTP、10 X PCR buffer；
[0014] 所述上游引物為5'-ATACCAACACGAGCACCTC-3'；下游引物為5'-TTATCCCTGAACCCGATG-3 '；
[0015] (3)陽性對照，可選用本實驗室分離的FAdV4ZJ2015-1毒株的核酸樣品，以該核酸 樣品為模板，利用上述引物對進行PCR擴增獲得403bp的產物，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所 示，序列分析表明擴增的DNA片段為Hexon基因片段；
[0016] (4)陰性對照，正常雞胚尿囊液中提取的DNA。
[0017] 本發明提供了一種所述引物對在制備檢測禽腺病毒4型試劑盒中的應用。
[0018] 本發明提供了一種檢測禽腺病毒4型的方法，包括：
[0019] (1)提取待測樣品的總DNA;
[0020] (2)建立PCR反應體系，以所述總DNA為模板，采用權利要求1所述的引物對進行PCR 擴增；
[0021 ] (3)對PCR擴增產物進行凝膠電泳檢測；
[0022]如擴增產物中出現403bp的條帶，則說明待測樣品中含有禽腺病毒4型，否則，說明 待測樣品中不含禽腺病毒4型。
[0023]所述待測樣品為禽類胚尿囊液或離體病理組織。所述離體病理組織為病死禽類的 肝臟、脾臟等易分離的組織。從病死禽類中解剖得到的待測樣品進行預處理，再用于PCR擴 增。
[0024]作為優選，所述禽類為雞。
[0025] 所述PCR反應體系包括:PCR反應緩沖液終濃度為1 X，ExTaq酶1.0U，dNTP各0.2mM， 上下游引物各〇.4mM，所述的上下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2 所示。
[0026] PCR反應的條件為：94°C預變性5min，94°C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸30s，35 個循環，72°C延伸10min。
[0027] 以上述PCR反應體系及反應條件，對禽腺病毒4型核酸的最低檢測限為0.0072ng/y L〇
[0028] 本發明與現有技術相比，具有如下優點：
[0029] (1)本發明的引物對能特異地擴增出樣品中的禽腺病毒4型的Hexon基因片段，檢 測靈敏度高，最低檢測限達7.2 X l(T4ngAiL，結果準確，可將其應用到對禽腺病毒4型的檢測 和鑒定當中。
[0030] (2)本發明的引物對對禽腺病毒4型的不同毒株的檢測具有通用性。
[0031] (3)本發明建立了一種快速、特異、準確的禽腺病毒4型的檢測方法，為今后對該病 的流行檢測和防控提供檢測工具。
【附圖說明】
[0032]圖1為本發明禽腺病毒4型PCR擴增結果圖，其中Μ為DNA marker;l為ZJ2015-1分離 株陽性結果;2和3為陰性對照。
[0033]圖2為實施例3的禽腺病毒4型PCR特異性擴增結果圖，其中Μ為DNA marker; 1-3為 禽腺病毒4型3個分離株(ZJ2015-1、ZJ2015-2，ZJ2015-3)感染尿囊液核酸抽提物PCR結果； 4-9分別為減蛋下降綜合征病毒(腺病毒1型）、pAeas y-l腺病毒載體(腺病毒5型）、禽流感病 毒、傳染性支氣管炎病毒、雞新城疫病毒和雞傳染性法氏囊病毒核酸抽提物PCR結果。
[0034]圖3為實施例4的禽腺病毒PCR檢測敏感性結果圖，其中Μ為DNA marker;l，7.2X H^ngAiLdJJXn^ngAiLdJJXloVgAiLdJJXKAigAiLdJJXlO-VgAxLW，？·〗 X 10-2ng/yL; 7，7 · 2 X 10-3ng/yL; 8，7 · 2 X 10-4ng/yL; 9，7 · 2 X 10-5ng/yL; 10，7 · 2 X 10-6ng/y L;11，7.2X10-7ng/yL。
[0035]圖4為實施例5試劑盒的臨床樣品檢測結果，其中M為DNA marker; 1-7為7份鴨臨床 樣品的PCR檢測結果。
【具體實施方式】
[0036]下面結合具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明，但下述實施例僅用于說 明目的，而不用于限制本發明的范圍。
[0037]本發明利用的試劑盒組成包括：
[0038] (l)DNA提取試劑，包括Digestion Buffer、BD Buffer、P;roteinase K、PW Solution、Wash Solution以及Elution Buffer，來自生工UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試 劑盒。
[0039] (2)PCR反應試劑，包括20u/yL的ExTaq酶、10mM的I群禽腺病毒4型特異性上游引物 FAdV-F、10mM 的FAdV4特異性下游引物FAdV-R，2 · 5mM 的 dNTP、10 X buf fer;
[0040] 所述禽腺病毒通用上游引物FAdV-F為5 ' -ATACCAACACGAGCACCTC-3 ' ；
[0041 ] 所述禽腺病毒通用下游引物?4狀-1?為5'-7^1^〇^6440〇1^了6-3'；
[0042] (3)陽性對照:新分離的FAdV4ZJ2015-l株的雞胚尿囊液提取的核酸樣品；陰性對 照:正常雞胚尿囊液提取的核酸樣品。
[0043] 實施例1 DNA抽提
[0044] 1、樣品處理
[0045] 組織樣品的處理:采取病死雞肝臟和脾臟等易分離FAdV4的組織，用剪刀剪碎后按 照1:3體積比加入滅菌PBS充分研磨。將勻漿好的組織懸液于-20°C (或更低溫度)_室溫反復 凍融3次后12,000g離心10min，取上清液200yL于新的滅菌離心管中。
[0046] 尿囊液處理:收集病毒感染的雞胚尿囊液進行12,000g離心10min，取上清液200yL 于新的滅菌離心管中。同時收集未感染雞胚的尿囊液作為陰性樣品;FAdV4ZJ2015-l感染尿 囊液作為陽性對照。
[0047] 2、DNA 抽提
[0048] 取上述處理的樣品200yL加入1 ·5ml EP管中，然后加入0·4mL Digestion Buffer 與20uL Proteinase K，振蕩混勻，室溫靜置30-60min;再加入0.2mL BD Buffer，充分混勻 (如果產生白色沉淀，70°C水浴靜置lOmin，可溶解）；加入400yL無水乙醇，充分顛倒混勻;將 吸附柱放入收集管，用移液器將溶液與半透明纖維狀懸浮物移到吸附柱中，室溫靜置兩分 鐘，12000g離心3min;棄廢液，吸附柱加500yL PW Solution(使用前確認已經按說明加入異 丙醇），10000g離心lmin;棄收集管中廢液，吸附柱中加500yL Wash Solution(使用前確認 已經按說明加入無水乙醇），l〇〇〇〇g離心lmin;棄收集管中廢液，將吸附柱放回收集管， 10000g離心2min;將吸附柱轉移到干凈的1.5mL EP管，并往吸附膜中央加入30yL Elution Buffer(使用前60°C預熱），室溫靜置5min，10000g離心lmin;收集洗脫液即為DNA溶液。紫外 分光光度計測定DNA濃度后用于PCR反應。
[0049] 實施例2 PCR反應
[0050] 1、引物設計
[0051]根據FAdV4結構蛋白Hexon基因上的保守序列，設計合成了如下引物：
[0052] FAdV-F為5，-ATACCAACACGAGCACCTC-3，；
[0053] FAdV-R為5，-TTATCCCTGAACCCGATG-3，；
[0054] 預計擴增禽腺病毒403bp的DNA片段。所述引物的序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID NO. 2所示。
[0055] 2、PCR 反應
[0056] 取抽提的DNA2.5yL，分別加入10uM的引物FAdV-F和10uM的引物FAdV-R各2yL， 2.5mM的dNTP 4yL，10 X buffer 5yL，模板2.5yL，加水至50yL;上述PCR反應體系經：95°C預 變性5min，95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸3〇8,35個循環，72°(：延伸1〇1^11的程序進行 PCR擴增。
[0057] PCR產物經1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳后，DueRed染色，在紫外線下觀察。結果如圖1 所示，FAdV4ZJ2015-l感染尿囊液提取的DNA樣品在403bp的位置出現了明亮的DNA條帶，而 陰性樣品沒有條帶出現。
[0058] 3、PCR產物測序驗證
[0059]害搬回收陽性的PCR產物，將回收的PCR產物連接到T載體后，送測序公司測序。序 列分析的結果顯示，擴增的片段為403bp，其序列如SEQ ID N0.3所示。經BLAST分析也顯示， 該序列為FAdV4的Hexon基因序列。
[0060] 實施例3試劑盒的特異性驗證
[0061] 取本實驗室獲得的來自山東的3份陽性病料的提取的DNA和常見禽類病毒包括其 他血清型的腺病毒（1型和5型）、禽流感病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒等感染 的雞胚尿囊液抽提的DNA在相同條件下進行PCR。
[0062]結果如圖2所示，只有從3份病料提取DNA中擴增到預期大小的目的DNA片段，而從 其它選用的禽病病毒中未擴增出任何DNA條帶，說明建立的PCR方法具有高的特異性。
[0063]實施例4試劑盒的敏感性檢測
[0064] 禽腺病毒4型ZJ2015-1毒株感染的雞胚尿囊液提取DNA，用FAdV-F和FAdV-R引物 PCR后。將產物連接T載體，轉化大腸桿菌，挑取帶有陽性重組質粒的大腸桿菌擴繁，抽提重 組質粒，定量后作為PCR敏感性試驗擴增的模板。
[0065] 帶有FAdV4 PCR擴增片段的陽性重組質粒DNA濃度為7.2 X 103ngAxL，將其進行10 倍系列稀釋后進行PCR反應。
[0066] 結果如圖3顯示，模板稀釋到7.2Xl(T4ngAiL，還能看到明顯PCR擴增目的片段。因 此，本發明建立的禽腺病毒4型PCR方法至少能檢測到每微升里的0.00072ng即7.2Xl(T4ng 的 DNA。
[0067]實施例5試劑盒的臨床樣品檢測
[0068]將實驗室保存的7份FAdV4感染的臨床樣品，處理后抽提DNA，用本發明研制的試劑 盒檢測驗證。結果如圖4所示，7份樣品均擴增出預期大小的DNA條帶。
【主權項】
1. 引物對，包括上游引物和下游引物，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. -種包含如權利要求1所述引物對的PCR檢測試劑盒。3. 如權利要求1所述的引物對在制備檢測禽腺病毒4型試劑盒中的應用。4. 一種檢測禽腺病毒4型的方法，其特征在于，包括： (1) 提取待測樣品的總DNA; (2) 建立PCR反應體系，以所述總DNA為模板，采用權利要求1所述的引物對進行PCR擴 增； (3) 對PCR擴增產物進行凝膠電泳檢測； 如擴增產物中出現403bp的條帶，則說明待測樣品中含有禽腺病毒4型，否則，說明待測 樣品中不含禽腺病毒4型。5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述待測樣品為禽類胚尿囊液或離體病理組 織。6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述禽類為雞。7. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反應體系包括:PCR反應緩沖液終濃 度為I X，ExTaq酶1 · OU，dNTP各0 · 2mM，上下游引物各0 · 4mM。8. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，PCR反應的條件為:94 °C預變性5min，94 °C變 性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 3〇8,35個循環，72°(：延伸1〇11^11。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886502SQ201610338455
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月19日
【發明人】廖敏, 莫開昆, 周繼勇, 鄭肖娟
【申請人】浙江大學