核酸信號放大序列及放大方法

核酸信號放大序列及放大方法
【專利摘要】本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種核酸信號放大序列及核酸信號放大方法。本發明所述核酸信號放大序列包括一個前導序列和一個若干倍數的重復序列構成，所述前導序列與目的靶標序列互補，所述重復序列與報告探針序列互補。本發明所述核酸信號放大序列可以通過前導序列將目的靶標捕獲雜交，再經過若干倍數的重復序列結合相應的報告探針即可實現信號放大，從而檢測到目的靶標的核酸信號。相對于PCR技術需要酶來維系雜交體系，本發明可以實現不增加檢測物濃度的前提下實現核酸物質的檢測，且穩定性好，重復性高，成本低，檢測流程短。
【專利說明】
核酸信號放大序列及放大方法
技術領域
[0001] 本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種核酸信號放大序列及核酸信號放大方 法。
【背景技術】
[0002] 聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種用于放大擴增特定的 DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，其能將微量的DNA大幅增 加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的 毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。
[0003] PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互 補的寡核苷酸引物。PCR由變性一退火一延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模 板DNA經加熱至93 °C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使 之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備;②模板DNA與引物的退火(復性）：模板 DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55 °C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;③ 引物的延伸:DNA模板一引物結合物在72 °C、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP 為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性一退火一延伸三過程就可獲得更多的"半保留復制 鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘，2~3小時就能 將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
[0004] 但是，PCR技術的穩定性和重復性較差，存在嚴重的氣溶膠污染缺陷，雖然后續的 閉管熒光PCR解決了交叉污染的問題，但是仍沒能解決PCR技術的天生缺陷問題。其次PCR成 本較高，PCR反應需要建設較高的空氣凈化級別的專用實驗室，對實驗要分區管理，管理成 本大大增加;而且反應時間流程太長導致每次檢測的時間成本增加。此外，PCR反應中Taq酶 或者聚合酶還容易受到樣本中的物質影響，導致假陽性或者假陰性的結果出現。

【發明內容】

[0005] 有鑒于此，本發明的目的在于針對現有技術的缺陷提供一種核酸信號放大序列及 其制備方法，以及利用該序列進行核酸信號放大的方法。
[0006] 為了實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案。
[0007] -種核酸信號放大序列，包括一個前導序列和一個若干倍數的重復序列構成，所 述前導序列與目的靶標序列互補，所述重復序列與報告探針序列互補。
[0008]在一些實施方案中，本發明所述核酸信號放大序列中，所述前導序列的Tm值為55 。(:_62°C ;所述重復序列的Tm值小于55°C。
[0009]在一些實施方案中，本發明所述核酸信號放大序列中所述前導序列5'端還包括硫 代三磷酸腺苷保護的限制性內切酶I酶切位點酶切后的片段，所述限制性內切酶I的酶切位 點酶切后為粘性末端。
[0010] 進一步的，在一些實施方案中，本發明所述核酸信號放大序列中所述核酸信號放 大序列3'端還包括限制性內切酶II的酶切位點酶切后的片段;所述限制性內切酶II的酶切 位點酶切后為平整末端。
[0011] 在一些實施方案中，本發明所述核酸信號放大序列中，所述限制性內切酶I為EcoR I、BamH I、HindII、HindIII;所述限制性內切酶II為EcoR V、Alu I、BsuR I、Bal I、HalIII、 HPa I、Sma I〇
[0012] 進一步的，在一些實施方案中，所述核酸信號放大序列中所述重復序列的倍數為5 倍-20倍。
[0013] 本發明還提供了所述核酸信號放大序列的制備方法，具體包括以下步驟：
[0014] A、根據目的靶標設計核酸信號前導序列和若干倍數的重復序列，并分別在前導序 列5'端加上限制性內切酶I的酶切位點，在若干倍數的重復序列3'端加上限制性內切酶II 的酶切位點;所述限制性內切酶I的酶切位點與核酸信號放大序列的前導序列相連，酶切后 為粘性末端;所述限制性內切酶II的酶切位點與核酸信號放大序列的重復序列相連，酶切 后為平整末端；
[0015] B、合成序列插入載體后進行克隆復制；
[0016] C、限制性內切酶I和限制性內切酶Π 酶切后，硫代三磷酸腺苷對限制性酶切末端 進行保護；
[0017] D、核酸外切酶ΙΠ 酶切獲得核酸信號放大序列。
[0018] 其中，所述核酸信號放大序列的制備方法中，所述載體為pGEM-3ZF( + )載體。
[0019] 本發明還提供了一種核酸信號放大的方法，將含有目的靶標的樣品包被在微孔板 上，然后加入上述核酸信號放大序列雜交，之后加入報告探針雜交后加入化學發光底物讀 取結果。
[0020] 進一步的，在一些實施方案中，本發明所述核酸信號放大的方法還包括以核酸信 號放大序列中的重復序列為前導序列進行次級信號放大的步驟。
[0021] 由上述技術方案可知，本發明提供了一種核酸信號放大序列及其制備方法，以及 利用該序列進行核酸信號放大的方法。本發明所述核酸信號放大序列包括一個前導序列和 一個若干倍數的重復序列構成，所述前導序列與目的靶標序列互補，所述重復序列與報告 探針序列互補。本發明所述核酸信號放大序列可以通過前導序列將目的靶標捕獲雜交，再 經過若干倍數的重復序列結合相應的報告探針即可實現信號放大，從而檢測到目的靶標的 核酸信號。相對于PCR技術需要酶來維系雜交體系，本發明可以實現不增加檢測物濃度的前 提下實現核酸物質的檢測，且穩定性好，重復性高，成本低，檢測流程短。
【附圖說明】
[0022] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0023] 圖1示核酸信號放大序列結構示意圖；
[0024] 圖2示核酸外切酶ΙΠ 酶切獲得核酸信號放大序列的示意圖；
[0025] 圖 3 示pGEM-3ZF( + )載體圖譜；
[0026] 圖4示初級信號放大加次級信號放大構象圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發明保護的范圍。
[0028] 為了實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案。
[0029] -種核酸信號放大序列，包括一個前導序列和一個若干倍數的重復序列構成，所 述前導序列與目的靶標序列互補，所述重復序列與報告探針序列互補。
[0030] 本發明所述核酸信號放大序列為針對目的靶標設計并合成的一種非自然存在的 基因序列，該基因序列是由一個前導序列和一個若干倍數的重復序列構成。其結構如圖1所 不。
[0031] Tm值是DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結構在熱變性過程中紫外吸收值達到最大 值的1/2時的溫度。
[0032] 本發明所述核酸信號放大序列中所述前導序列可以與目的靶標序列互補形成雙 螺旋結構。所述若干重復序列可以與報告探針序列互補形成雙螺旋結構。
[0033]為了保證結構的穩定，本發明所述核酸信號放大序列中所述前導序列的Tm值保證 在60°C左右。在一些實施方案中，所述前導序列的Tm值為55°C-62°C。
[0034] 同樣的，本發明所述核酸信號放大序列中所述核酸信號放大序列中所述重復序列 的Tm值小于55°C，以確保重復序列的特異性雜交。
[0035] 如，在一些實施例中所述核酸信號放大序列中所述前導序列具體為 ACGITTTAGAGAGAGATATGAT，所述重復序列為 TCCCGGGAGGCGAGCA。
[0036] 如，在一些實施例中所述核酸信號放大序列中所述前導序列具體為 TCCCTGAATGCCTAACGAT，所述重復序列為 AGGTCTTTACCACCAATATTCTITT。
[0037]在一些實施方案中，所述核酸信號放大序列中所述前導序列5'端還包括硫代三磷 酸腺苷保護的限制性內切酶I酶切位點酶切后的片段，所述限制性內切酶I的酶切位點酶切 后為粘性末端。即所述前導序列5'端連接有限制性內切酶I的酶切位點，而該酶切位點經酶 切后形成粘性末端，隨后粘性末端經硫代三磷酸腺苷進行保護后補齊為平末端，獲得包括 硫代三磷酸腺苷保護的限制性內切酶頂每切位點酶切后的片段。
[0038] 在一些實施方案中，本發明所述核酸信號放大序列3'端還包括限制性內切酶II的 酶切位點酶切后的片段;所述限制性內切酶II的酶切位點酶切后為平整末端。
[0039] 本領域技術人員可以理解，所述核酸信號放大序列中，所述限制性內切酶I可以為 任意一種酶切后形成粘性末端的任何一種酶，如為EcoR 13&111!11、把11(111、把11(1111等。在一 些實施方案中，所述限制性內切酶I為Hindll。
[0040] 所述限制性內切酶II可以為任意一種酶切后形成平整末端的任何一種酶，如為 EcoR V、Alu I、BsuR I、Bal I、HalIII、HPa I、Sma I等。在一些實施方案中，所述限制性內 切酶Π 為EcoR V。
[0041] 本發明所述核酸信號放大序列中所述重復序列的倍數為5倍-20倍。在一些實施例 中，所述重復序列為20倍。在另一些實施例中，所述重復序列為10倍。
[0042]本發明還提供了上述核酸信號放大序列的制備方法，具體包括以下步驟：
[0043] A、根據目的靶標設計核酸信號前導序列和若干倍數的重復序列，并分別在前導序 列5'端加上限制性內切酶I的酶切位點，在若干倍數的重復序列3'端加上限制性內切酶II 的酶切位點;所述限制性內切酶I的酶切位點與核酸信號放大序列的前導序列相連，酶切后 為粘性末端;所述限制性內切酶II的酶切位點與核酸信號放大序列的重復序列相連，酶切 后為平整末端；
[0044] B、合成序列插入載體后進行克隆復制；
[0045] C、限制性內切酶I和限制性內切酶Π 酶切后，硫代三磷酸腺苷對限制性酶切末端 進行保護；
[0046] D、核酸外切酶IΠ 酶切獲得核酸信號放大序列。
[0047] 本發明所述制備方法是通過硫代三磷酸腺苷對酶切后的片段進行保護，利用核酸 外切酶III不能切割含有硫代三磷酸腺苷序列的特點，將未被硫代三磷酸腺苷保護的片段 切割成單鏈探針。
[0048]核酸外切酶III具有外切酶活性，該酶作用于雙鏈DNA，從3MH末端方向逐 步切去單核苷酸。每次酶與底物結合催化，只有幾個核苷酸被除掉，從而在DNA分子群內產 生漸進缺失。盡管可以作用于雙鏈DNA的切刻產生單鏈缺口，但該酶最適底物是平齊末端或 3'凹陷末端DNA。由于對單鏈DNA無活性，因此該酶無法切割3'突出末端。且核酸外切酶III 的3' 外切酶活性對底物的切割程度隨3'突出末端的長度而變化，四堿基或更長的突出 末端完全不能被切割。
[0049]由于核酸外切酶III不能作用于粘性末端，本發明所述制備方法在需要保護的那 條鏈前段聚合上若干個硫代三磷酸腺苷后，核酸外切酶III只能切割未保護的那條鏈，而保 留硫代三磷酸腺苷保護的那條鏈，從而制備出單鏈特異性探針，即核酸信號放大序列。具體 如圖2所示。
[0050] 其中，所述硫代三磷酸腺苷有α-dAtp、a-dTtp、a-dGtp和α-dCtp四種，結構式分別 如下：
[0052]本發明所述核酸信號放大序列的制備方法中，所述載體為pGEM_3ZF(_)載體。序列 插入載體后，命名為pGEM-3ZF( + )-Amplifier。圖譜如圖3所示。
[0053]本發明所述核酸信號放大序列的制備方法中，步驟C具體為使用限制性內切酶I單 酶切載體序列產生5 '粘性末端，使用Kelnow大片段聚合酶和硫代三磷酸腺苷對5 '粘性末端 進行補平操作;再用限制性內切酶II將目的條帶從載體上切除下來。
[0054] 本發明所述核酸信號放大序列的制備方法中，步驟D具體為使用核酸外切酶III對 硫代保護的雙鏈進行單鏈消化，確保5 '硫代保護的序列能夠轉換成單鏈探針結構。
[0055] 本發明還提供了一種核酸信號放大的方法，將含有目的靶標的樣品包被在微孔板 上，然后加入上述核酸信號放大序列雜交，之后加入報告探針雜交后加入化學發光底物讀 取結果。
[0056]其中，所述核酸信號放大序列雜交的溫度為50°C~55°C，所述雜交時間為40~ 50min〇
[0057] 而所述核酸信號放大的方法中，與報告探針雜交的條件為51°C~53°C反應30~ 40min〇
[0058] 本發明所述核酸信號放大的方法中所述化學發光底物可以為任何一種可以識別 報告探針的化學發光底物。在一些實施方案中，所述化學發光底物為lumi-Phos Plus。
[0059] 本發明所述核酸信號放大的方法中實驗結果采用化學發光分析儀讀取數據。
[0060] 進一步的，本發明所述核酸信號放大的方法還包括以核酸信號放大序列中的重復 序列為前導序列進行次級信號放大的步驟。具體構象如圖4所示。
[0061] 在初級信號放大的基礎上進行次級信號放大可以形成倍數的累積放大，從而進一 步提供檢測的靈敏度。如初級核酸信號放大重復序列為20倍，而次級信號放大再20倍的放 大，初級加次級信號放大累積可以達到400倍放大，大大提高了檢測靈敏度。
[0062] 由上述技術方案可知，本發明提供了一種核酸信號放大序列及其制備方法，以及 利用該序列進行核酸信號放大的方法。本發明所述核酸信號放大序列包括一個前導序列和 一個若干倍數的重復序列構成，所述前導序列與目的靶標序列互補，所述重復序列與報告 探針序列互補。本發明所述核酸信號放大序列可以通過前導序列將目的靶標捕獲雜交，再 經過若干倍數的重復序列結合相應的報告探針即可實現信號放大，從而檢測到目的靶標的 核酸信號。相對于PCR技術需要酶來維系雜交體系，本發明可以實現不增加檢測物濃度的前 提下實現核酸物質的檢測，且穩定性好，重復性高，成本低，檢測流程短。
[0063] 為了進一步理解本發明，下面結合具體實施例對本發明進行詳細闡述。如無特殊 說明，本發明所使用的試劑及儀器均為本領域常用試劑及儀器。本發明所涉及的方法均為 本領域的通用方法。其中化學發光底物為lumi-Phos Plus，購自美國Beckman Coulter Lumigen。
[0064] 實施例1、核酸信號放大序列的制備
[0065] 根據引物序列1設計前導序列，同時設計不同倍數的重復序列，并分別在前導序列 5'端加上Hindll的酶切位點，在重復序列3'端加上EcoR V的酶切位點，合成不同構象序列 后插入pGEM-3ZF(_)載體后進行克隆復制;Hindll單酶切載體序列產生5'粘性末端，使用 Kelnow大片段聚合酶和硫代三磷酸腺苷對5'粘性末端進行補平，再用EcoR V將目的條帶從 載體上切除下來，核酸外切酶ΙΠ 酶切成單鏈DNA探針。各序列如表1所示。
[0066] 表1各序列

[0068] 實施例2、初級信號放大
[0069] 1、將lOOpmol濃度的表1中的目的靶標包被在微孔板上；
[0070] 2、按照實施例1的方法合成各序列并制備成單鏈探針，將合成序列1、合成序列2和 合成序列3制備的探針分別命名為預放大1、預放大2、預放大3;
[0071] 3、控制雜交溫度控制在5 0 °C~5 5 °C之間，每孔加入預放大1、2、3的濃度均為 lOOpmol/yL，雜交 40 ~50 分鐘；
[0072] 4、分別加入報告探針（AAAAGAATATTGGTGGTAAAGACCT-AP)，51°C ~53°C 反應 30 ~ 40min；
[0073] 5、加入化學發光底物lumi-Phos Plus(Beckman Inc.)，讀取實驗結果。
[0074] 其中布板設計如表2,對應數據結果如表3。
[0075]表2布板設計
[0078]表3對應數據結果
[0080]由表3結果可見，預放大1、2、3分別在背景發光值的基礎上大約放大了20倍、10倍、 5倍的化學發光信號值，與預期設計是一致的。
[0081] 實施例3、次級信號放大
[0082] 在實施例2基礎上再設計一種核酸信號放大序列-合成序列4,其前導序列與實施 例2合成序列的重復序列互補，合成序列4的序列具體為:AAAAGAATATTGGTGGTAAAGACCT-20X-GATATCATTTCTTGATGGC)。
[0083] 方法：
[0084] 1、將lOOpmol濃度的的表1中的目的靶標包被在微孔板上；
[0085] 2、按照實施例1的方法合成各序列并制備成單鏈探針，將合成序列1、合成序列2、 合成序列3和合成序列4制備的探針分別命名為預放大1、預放大2、預放大3和放大1;
[0086] 3、控制雜交溫度控制在5 0 °C~5 5 °C之間，每孔加入預放大1、2、3的濃度均為 lOOpmol/yL，雜交 40 ~50 分鐘；
[0087] 4、控制雜交溫度控制在50°C~55°C之間，每孔加入50pmolAiL的放大1，雜交40~ 50分鐘；
[0088] 5、加入報告探針(GCCATCAAGAAATGATATC-AP)，51°C ~53°C 反應 30 ~40min。
[0089] 6、加入化學發光底物lumi-Phos Plus(Beckman Inc.)，讀取實驗結果。
[0090] 其中布板設計如表4,對應數據結果如表5。
[0091] 表4布板設計
[0094]表5對應數據結果
[0096]由表5結果可見，預放大1、2、3與放大1分別在背景發光值的基礎上大約放大了330 倍、160倍、40倍的化學發光信號值，與預期設計是一致的。
【主權項】
1. 一種核酸信號放大序列，包括一個前導序列和一個若干倍數的重復序列構成，所述 前導序列與目的靶標序列互補，所述重復序列與報告探針序列互補。2. 根據權利要求1所述的核酸信號放大序列，所述前導序列的Tm值為55°C-62°C;所述 重復序列的Tm值小于55°C。3. 根據權利要求1或2所述的核酸信號放大序列，所述前導序列5'端還包括硫代三磷酸 腺苷保護的限制性內切酶I酶切位點酶切后的片段，所述限制性內切酶I的酶切位點酶切后 為粘性末端。4. 根據權利要求1-3任意一項所述的核酸信號放大序列，所述核酸信號放大序列3'端 還包括限制性內切酶II的酶切位點酶切后的片段;所述限制性內切酶II的酶切位點酶切后 為平整末端。5. 根據權利要求1-4任意一項所述的核酸信號放大序列，所述限制性內切酶I為EcoR I、BamH I、Hind II、HindIII;所述限制性內切酶II為EcoR V、Alu I、BsuR I、Bal I、 HalIII、HPa I、Sma I。6. 根據權利要求1-5任意一項所述的核酸信號放大序列，所述重復序列的倍數為5倍-20倍。7. 權利要求1所述核酸信號放大序列的制備方法，包括以下步驟： A、 根據目的靶標設計核酸信號前導序列和若干倍數的重復序列，并分別在前導序列5' 端加上限制性內切酶I的酶切位點，在若干倍數的重復序列3'端加上限制性內切酶II的酶 切位點;所述限制性內切酶I的酶切位點與核酸信號放大序列的前導序列相連，酶切后為粘 性末端;所述限制性內切酶II的酶切位點與核酸信號放大序列的重復序列相連，酶切后為 平整末端； B、 合成序列插入載體后進行克隆復制； C、 限制性內切酶I和限制性內切酶Π 酶切后，硫代三磷酸腺苷對限制性酶切末端進行 保護； D、 核酸外切酶III酶切獲得核酸信號放大序列。8. 根據權利要求7所述的制備方法，所述載體為pGEM-3ZF (+)載體。9. 一種核酸信號放大的方法，將含有目的靶標的樣品包被在微孔板上，然后加入權利 要求1-6任意一項所述核酸信號放大序列雜交，之后加入報告探針雜交后加入化學發光底 物讀取結果。10. 根據權利要求9所述的方法，還包括以核酸信號放大序列中的重復序列為前導序列 進行次級信號放大的步驟。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886501SQ201610267807
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月26日
【發明人】張鷺鷺, 李先坤, 張愛國
【申請人】科蒂亞(新鄉)生物技術有限公司