CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特異性靶向PCSK9基因的sgRNA的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特異性靶向PCSK9基因的sgRNA，通過云端高通量計算設計、合成了一組利用CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因中特異性靶向PCSK9基因的sgRNA，并分別將該sgRNA與線性的pCG-U6-SgRNA質粒連接成載體，將一對正向和方向sgRNA寡核苷酸載體與pCG-NLS-FLAG-Cas9質粒一起成功轉染細胞即可實現PCSK9基因的敲除，sgRNA只需要小量合成多核苷酸片斷，就能大批量生產的優點，該制備方法簡單易行、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系統的敲除效率高。
【專利說明】
CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特 異性靶向PCSK9基因的sgRNA
技術領域
[0001] 本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及CRISPR_Cas9特異性敲除人PCSK9基因 的方法以及用于特異性靶向PCSK9基因的sgRNA。
【背景技術】
[0002] 規律成族間隔短回文重復系統（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat ;CRISPR_associated， CRISPR_Cas9)是一種具有核酸 內切酶活性的復合體，識別特定的DNA序列，進行特定位點切割造成雙鏈DNA斷 裂（Double-strandbreaks，DSB)，在沒有模板的條件下，發生非同源重組末端連接 (Non-homologous endjoining，NHEJ)，造成移碼突變（frameshift mutation)，導致基因敲 除（如圖1)。
[0003] 這一技術由于能快速、簡便、高效地靶向基因組任何基因，從而引起了廣泛的關 注，在2012年開始流行開來。由于其容易操作、可以同時靶向多個基因，可以高通量制 備、造價低等優勢，Cas9已經成為一種發展最快的技術。正是由于其優越性，這一技術在 Nature推薦的2013十大進展中位列第一，在Science推薦的2013十大進展中位列第二位。 近年來，全世界的科學家已經利用此技術在小鼠、大鼠及獼猴上開展了高效的基因編輯工 作。
[0004] Cas9靶向切割DNA是通過兩種小RNA_crRNA(CRISPR RNA)和 tracrRNA(trans_activating crRNA)和革E序列互補識別的原理實現的。現在已經把兩種 小RNA融合成一條RNA鏈，簡稱sgRNA (single guide RNA)。因此，sgRNA能否做到特異性、 精確靶向目標基因是CRISPR-Cas9能否特異性敲除目標基因的先決條件，無論是脫靶還是 錯誤靶向，都會影響CRISPR-Cas9對目標基因的特異性敲除。因此，能夠設計、制備出精確 性和特異性靶向目標基因的sgRNA成為CRISPR-Cas9基因敲除的關鍵技術（如圖1)。
[0005] 前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶 9 型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)是降脂的一個新的靶點。PCSK9為分泌型絲氨酸蛋白酶，可與低密度脂蛋 白膽固醇受體（low-density lipoprotein receptor，LDL-R)結合并將其內化引導至溶酶 體降解，抑制其再循環到肝細胞表面，從而減弱肝臟代謝血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C) 的能力。PCSK9的無義突變可以降低血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)。
[0006] PCSK9的單克隆抗體在臨床階段備受關注，如美國安進公司研發的PCSK9單克隆 抗體AMG145即可以顯著降低正常人及高膽固醇血癥患者的LDL-C水平。但是，利用PCSK9 抗體的治療高血脂也具有一定的局限性。因為利用抗體進行靶基因的治療還受到一些因 素的限制：（1)抗體的作用只是暫時阻斷的作用；（2)需要定期進行注射，如每兩周到四周 需要注射一次，增加了患者的負擔；（3)不容易研發出有效的抗體；(4)只針對細胞外靶點； (5)抗體藥物昂貴等。
[0007] CRISPR-Cas9快速、簡便、高效、特異性靶向敲除基因，通過靶向敲除PCSK9基因， 為實現腫瘤免疫治療提供了一種可行的策略。但是，能否設計、制備出精確性和特異性靶向 PCSK9基因的sgRNA成為CRISPR-Cas9特異性敲除PCSK9基因的關鍵技術。本發明的目的 就是要解決這一關鍵技術問題，提供相應的技術方案，達到特異性敲除PCSK9基因的目的。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于針對現有技術的缺陷和不足，提供一種結構簡單，設計合理、使 用方便的CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特異性靶向PCSK9基因的 sgRNA，它通過云端高通量計算設計、合成了一組利用CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基 因中特異性靶向PCSK9基因的sgRNA，并分別將該sgRNA與線性的pCG-U6-SgRNA質粒連接 成載體，將一對正向和方向sgRNA寡核苷酸載體與pCG-NLS-FLAG-Cas9質粒一起成功轉染 細胞即可實現PCSK9基因的敲除，有效地解決了利用抗體治療存在的問題：直接敲除PCSK9 基因，可以實現永久的效果；提供了高效的SgRNA ;sgRNA只需要小量合成多核苷酸片斷，就 能大批量生產的優點。
[0009] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：
[0010] 本發明所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特異性靶向 PCSK9基因的sgRNA，它采用如下的技術方案：
[0011] -、sgRNA寡核苷酸的高通量設計和選擇
[0012] 1.靶向PCSK9基因的sgRNA的設計：
[0013] 文中的設計均采用著作權軟件《云端CRISPR_Cas9二核酸內切酶靶點優化設計系 統VI. 0》高通量設計。基本原理如下：
[0014] (1)在PCSK9基因上選擇5，-GGN(19)GG的序列，如果沒有5，-GGN(19)GG的序列， 5' -GN(20)GG 或者 5' -N(21)GG 也可以。
[0015] (2) sgRNA在PCSK9基因上的靶向位點位于基因的外顯子。
[0016] (3) sgRNA在PCSK9基因上的靶向位點位于不同的各種剪切形式的共有外顯子上。
[0017] (4)在NCBI數據庫中用BLAST，對sgRNA的靶序列進行計算打分，選取并保留高分 的sgRNA，確保sgRNA對PCSK9的特異性。
[0018] 2.靶向PCSK9基因的sgRNA的選擇：
[0019] (1)不能離ATG起始子太近，防止轉錄會后下游另一個ATG開始而出現一個被截短 的基因形式，不能保證基因完全失活；
[0020] (2) SgRNA在PCSK9基因上的靶向位點位于整個基因的前半段，優先選擇基因的第 一或者第二外顯子；
[0021] (3)選擇相隔一定距離（5~30bp)成對的位點。這樣既有利于形成特異性的片段 缺失，也有利于降低脫靶效應；
[0022] 二、構建sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈
[0023] 根據選擇的sgRNA，在其5'加上CCGG得到正向寡核苷酸（Forward oligo)(如果序 列本身在5'端已經有1或者2個G，那么就對應的省略1或者2個G);根據選擇的sgRNA， 獲得其對應DNA的互補鏈，并且在其5'加上AAAC得到反向寡核苷酸（Reverse oligo)。分 別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo 和reverse oligo成對變性、退火，退火之后形成可以連入U6真核表達載體的雙鏈，如下：
[0027] 三、sgRNA寡聚核苷酸質粒的構建
[0028] 1.線性化pCG-U6_sgRNA質粒（結構如圖4所示）。
[0029] 2.將退火的sgRNA寡聚核苷酸雙鏈與線性化pCG-U6_SgRNA質粒連接獲得 pCG-U6-hPCSK9sg 質粒。
[0030] 3.轉化并涂氨芐平板（50 μ g/ml)。
[0031] 4.用通用引物U6測序的方法鑒定陽性克隆。
[0032] 5. 37°C搖床搖菌過夜并用 Qiagen Plasmid Miniprep Kit 抽提 pCG-U6_hPCSK9sg 質粒。
[0033] 四、轉染細胞獲得PCSK9基因敲除細胞
[0034] 1、按照 Lipofectamine?2〇OOTransfection Reagent (Invitrogen，11668_019)的 操作手冊，將分別帶有對應sgRNA寡聚核苷酸的pCG-U6-sgRNA質粒（一種或者多種）與序 列為SEQ ID N0. 457的pCG-NLS-Cas9質粒混勻，共轉染細胞。
[0035] 2、用T7EN1酶切檢測和TA克隆測序確認PCSK9基因已經被敲除。
[0036] 更進一步的，同時利用一對相鄰（在PCSK9基因上的靶向起始位點相距5bp_10bp) 的sgRNA可以顯著提高敲除效率。在靶向PCSK9的sgRNA寡核苷酸設計、選擇和合成之后， 將靶向PCSK9的sgRNA寡聚核苷酸與線性化pCG-U6-sgRNA質粒連接獲得含靶向PCSK9的 sgRNA寡聚核苷酸的載體pCG-U6-hPCSK9sg，在轉染細胞獲得PCSK9基因敲除細胞過程中， 如下操作：
[0037] 1、按照 LipofectamineTM 2000Transfection Reagent 操作手冊，將兩個分別含 1個靶向PCSK9的sgRNA寡聚核苷酸的載體pCG-U6-sgRNA(這兩個載體分別帶有的靶向 PCSK9的sgRNA寡聚核苷酸在PCSK9基因上的互補起始位點相距5bp-8bp)與序列為SEQ ID NO. 457的pCG-NLS-FLAG-Cas9質粒混勻，共轉染細胞。
[0038] 2、用T7EN1酶切檢測和TA克隆測序確認PCSK9基因已經被敲除。本發明還提供 了特異性靶向PCSK9基因的sgRNA，其序列如SEQ ID N0. . 46-54所示。
[0039] 相比于現有利用PCSK9抗體進行降血脂的方法，本發明的優點在于：
[0040] (1)抗體的作用只是暫時封閉的作用，本發明直接敲除PCSK9基因，可以實現永久 的效果；
[0041] (2)抑制性受體有多種，如何利用多種抗體封閉多種抑制性受體還沒有對策，本發 明既可以針對PCSK9的多個編碼序列進行敲除；
[0042] (3)有效的PCSK9抗體研發很困難，本發明提供了針對人PCSK9基因的一組高效的 sgRNA ；
[0043] (4)抗體作用只能針對細胞外靶點，本發明既可以針對胞外，也能針對胞內靶點；
[0044] (5)開發抗體藥物是一項費時、費力、費錢的過程，使得抗體藥物昂貴等，利用 sgRNA只需要小量合成多核苷酸片斷，就能大批量生產
[0045] 采用上述結構后，本發明有益效果為：本發明所述的CRISPR_Cas9特異性敲除人 PCSK9基因的方法以及用于特異性靶向PCSK9基因的sgRNA，它針對現有利用PCSK9抗體 進行降血脂的問題：（1)抗體的作用只是暫時阻斷的作用；（2)需要定期進行注射，如每兩 周到四周需要注射一次，增加了患者的負擔；(3)不容易研發出有效的抗體；(4)只針對細 胞外靶點；（5)抗體藥物昂貴等等問題，本發明通過云端高通量計算設計、合成了一組利 用CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因中特異性靶向PCSK9基因的sgRNA，并分別將該 sgRNA與線性的pCG-U6-SgRNA質粒連接成載體，將一對正向和方向sgRNA寡核苷酸載體與 pCG-NLS-FLAG-Cas9質粒一起成功轉染細胞即可實現PCSK9基因的敲除，有效地解決了利 用抗體治療存在的問題：直接敲除PCSK9基因，可以實現永久的效果；提供了高效的SgRNA， sgRNA只需要小量合成多核苷酸片斷，就能大批量生產的優點。
【附圖說明】
[0046] 圖1是Cas9實現定點切割導致DNA雙鏈斷裂過程示意圖；
[0047] 圖2是T7EN1酶切鑒定sgRNA/Cas9介導的基因人PCSK9特異性切割；
[0048] 圖3是載體pCG-U6_sgRNA的結構；
[0049] 圖 4 是載體 pCG-NLS-FLAG_Cas9 的結構。
【具體實施方式】
[0050] 下面結合附圖對本發明作進一步的說明。
[0051] 針對上述【附圖說明】的圖1和圖2,進一步說明如下：
[0052] 圖1是Cas9實現定點切割導致DNA雙鏈斷裂過程示意圖，CRISPR/Cas9系統定向 識別和剪切從而導致基因敲除是通過sgRNA和Cas9實現的。sgRNA決定了 Cas9的靶向性。
[0053] 圖2是T7EN1酶切鑒定sgRNA/Cas9介導的基因人PCSK9特異性切割，以提取的 HEK293T細胞基因組為模板，使用序列如SEQ ID N0. 464和SEQ ID N0. .465的hPCSK9test For和hPCSK9test Rev為引物進行PCR擴增，PCR產物為390bp，純化PCR產物。將上述PCR 產物取200ng退火，使用T7EN1酶切鑒定，電泳。如圖2所示，加入針對人PCSK9的sgRNA 的樣品都出現了切割條帶，而且具有很高的效率。
[0054] 本發明所述的CRISPR_Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特異性靶 向PCSK9基因的sgRNA，實施例lCRISPR_Cas9特異性敲除人PCSK9基因中用于特異性靶向 PCSK9基因的sgRNA的設計和合成
[0055] 1.靶向人PCSK9基因的sgRNA的設計：
[0056] (1)在PCSK9基因上選擇5，-GGN(19)GG的序列，如果沒有5，-GGN(19)GG的序列， 5' -GN(20)GG 或者 5' -N(21)GG 也可以。
[0057] (2) sgRNA在PCSK9基因上的靶向位點位于基因的外顯子，這樣更容易引起片段的 缺失或移框突變，從而達到基因完全失活的目的。
[0058] (3) sgRNA在PCSK9基因上的靶向位點位于不同的各種剪切形式的共有外顯子上。
[0059] (4)在NCBI數據庫中用BLAST，確定sgRNA的靶序列是否唯一，減少潛在的脫靶位 點。
[0060] 根據以上方法，我們一共設計了 457個靶向人PCSK9基因的SgRNA，序列分別如序 列表 SEQ ID N0. . 1-457 所示。
[0061] 2.靶向人PCSK9基因的sgRNA的選擇：
[0062] (1)靶向PCSK9基因的sgRNA的靶序列在PCSK9基因上不能離ATG起始子太近，防 止轉錄會后下游另一個ATG開始而出現一個截短的基因形式，不能保證基因完全失活。
[0063] (2) sgRNA在PCSK9基因上的靶向位點位于整個基因的前半段，尤其宜在基因的功 能結構域中，常常位于第二外顯子中。
[0064] (3)在PCSK9基因上選擇相隔一定距離（5~30bp)成對的位點。這樣有利于形成 特異性的片段缺失，也有利于降低脫靶效應。
[0065] 根據以上方法，在457個靶向人PCSK9基因的包含PAM序列的sgRNA (序列分別如 序列表SEQ ID N0. . 46-80所示）中符合的序列有35個我們從中選擇了 6個（分別如序列 表SEQ ID N0. .46,49, 51，52, 54或70所示）進行后續實驗。
[0066] 3.靶向人PCSK9基因的sgRNA寡聚核苷酸的合成和構建
[0067] 根據選擇的 6 個（SEQ ID N0. .46,49, 51，52, 54 或 70 所示），在其 5' 加上 CACC 得到正向寡核苷酸（Forward oligo)(如果序列本身在5'端已經有1或者2個G，那么就 對應的省略1或者2個G);根據選擇的sgRNA，獲得其互補鏈，并且在其5'加上AAAC得到 反向寡核苷酸（Reverse oligo)。分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的 sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火，退火之后形成可以 連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸，模式如下：
[0068] Forward oligo ：5, -CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNN
[0069] I I I I I I I I I I I I I I I I I
[0070] Reverse oligo :NNNNNNNNNNNNNNNNNN CAAA-5'
[0071] 變性、退火體系為：
[0072] 2. 5 μ L forward Oligo (100 μ Μ)
[0073] 2. 5 μ L reverse Oligo (100 μ Μ)
[0074] 1 μ L NEB buffer2
[0075] 4 μ 1滅菌水
[0076] 在 PCR 儀中按照以下 touch down 程序運行：95 °C，5min ;95_85 °C at 2 °C /s ; 85-25°C at-0. 1°C /s ;hold at4°C。
[0077] 選擇的第1個sgRNA(如序列表SEQ ID NO. · 46所示），其forward oligo和 reverseoligo(Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID Ν0· .466和467 所示意）成對變性、退火之后獲得可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸。
[0078] 選擇的第2個sgRNA(如序列表SEQ ID N0. · 49所示），其forward oligo和 reverseoligo(Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID Ν0· .468和469 所示）成對變性、退火之后獲得可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸。
[0079] 選擇的第3個sgRNA(如序列表SEQ ID N0. · 51所示），其forward oligo和 reverseoligo(Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID Ν0· .470和471 所示）成對變性、退火之后獲得可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸。
[0080] 選擇的第4個sgRNA(如序列表SEQ ID N0. · 52所示），其forward oligo和 reverseoligo(Forward oligo和Reverse oligo序列分另如序列表SEQ ID Ν0· .472和473 所示）成對變性、退火之后獲得可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸。
[0081] 選擇的第5個sgRNA(如序列表SEQ ID N0. · 54所示），其forward oligo和 reverseoligo(Forwardoligo和Reverseoligo序列分另如序列表SEQIDN0··474和475 所示）成對變性、退火之后獲得可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸。
[0082] 選擇的第6個sgRNA(如序列表SEQ ID N0. · 70所示），其forward oligo和 reverseoligo(Forwardoligo和Reverseoligo序列分別如序列表SEQIDN0··476和477 所示）成對變性、退火之后獲得可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸。
[0083] 實施例2利用CRISPR_Cas9特異性敲除人PCSK9基因（用于靶向PCSK9基因的 sgRNA 如序列表 SEQ ID N0. .46,49, 51，52, 54 或 70 所示，以 46 為例）
[0084] 1、線性化序列如序列表SEQ ID N0. · 458所示的pCG-U6-sgRNA質粒。
[0085] 酶切體系和條件如下：
[0086] 2 μ g pCG-U6-sgRNA(400ng/μ L)；
[0087] 1 yL CutSmart Buffer ；
[0088] 1 μ L BfuAI (NEB，R0701L);
[0089] 補水至50 μ L，37°C孵育3~4小時，每隔一段時間振蕩一下并離心以防液滴蒸發
[0090] 至管蓋上。
[0091] 酶切完成后用 AxyPr 印 PCR Clean up Kit (AP-PCR-250)純化回收至 20 ~40 μ L 滅菌水中。
[0092] 2、將變性、退火之后獲得的可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸 (其Forward oligo和Reverse oligo序列分別如序列表SEQ ID N0. .466和467所不）與 線性化的pCG-U6-sgRNA質粒相連獲得pCG-U6-hPCSK9sgl質粒。
[0093] 連接體系如下：
[0094] 3 μ L，50 μ Μ退火產物（雙鏈sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID N0. · 466 所示，其 reverse oligo 如序列表 SEQ ID N0. · 467 所示）
[0095] 1 μ L 線性化的 pCG_U6_sgRNA 質粒（25ng/ μ L)
[0096] 1 μL Τ4 ligation Buffer
[0097] 0· 5 μ 1 T4 ligase (NEB，M0202S)
[0098] 4. 5 μ 1 滅菌水
[0099] 16°C孵育1小時。
[0100] 4、將上述步驟獲得的連接產物轉化DH5a感受態細胞并涂氨芐平板（50 μ g/ml)， 并挑取克隆。
[0101] 5、用如序列表SEQ ID N0.. 463所示的通用引物U6,用常規測序的方法鑒定獲得陽 性克隆。
[0102] 6、37°C搖床搖菌過夜培養陽性克隆，用Qiagene質粒抽提試劑盒抽提質粒，獲得 pCG-U6-PCSK9sgl 質粒（如序列表 SEQ ID N0. · 478 所示）。
[0103] 7、細胞培養與轉染
[0104] (1)293T 細胞接種培養于 DMEM 培養基中，其中含 10% FBS，penicillin (100U/ml) 和 streptomycin(100 μ g/ml)〇
[0105] (2)在轉染前分至6孔板中，待70 %~80 %密度時進行轉染。（3)按照 Lipofectamine? 2000Transfection Reagent(Invitrogen，11668-019)的操作手 冊，將 〇· 5 μ g pCG-U6-hPCSK9sgl (如序列表 SEQ ID Ν0· · 14 所示）與 1· 5 μ g 的 pCG-NLS-FLAG-Cas9質粒（如序列表SEQ ID NO. 457所示）混勻，共轉染至每孔細胞中，6~ 8小時后換液，并加入G418 (Sigma，A1720)進行藥篩，48小時后收取細胞。
[0106] 8、T7EN1 酶切檢測
[0107] ⑴將收集的細胞在裂解液（10 μΜ Tris-HCl，0. 4M NaCl，2 μΜ EDTA，1% SDS)中 用100 μ g/ml蛋白酶Κ裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50 μ L去離子水中。
[0108] (2)使用序列如 SEQ ID N0. · 464 和 SEQ ID N0. · 465 的引物 hPCSK9test For 和hPCSK9test Rev進行PCR擴增，用AxyPr印PCR cleanup純化獲得PCR回收產物， 取200ng統一稀釋到20 μ L進行變性、退火，程序如：95 °C，5min ;95-85 °C at 2 °C /s ; 85-25°C at-0. 1°C /s ;hold at4°C。
[0109] (3)在20yL體系中加入T7E N1 0.3yL，37°C酶切30分鐘后，加入2yL 10X Loading Buffer，用2. 5%的瓊脂糖膠電泳檢測。如圖2所示，靶向序列為46, 51，52, 54時 敲除成功。
[0110] 以上所述僅是本發明的較佳實施方式，故凡依本發明專利申請范圍所述的構造、 特征及原理所做的等效變化或修飾，均包括于本發明專利申請范圍內。
【主權項】
1. CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特異性靶向PCSK9基因的 sgRNA，其特征在于： (1) 所述SgRNA在PCSK9基因上的靶序列符合5 ' -GGN (19) GG、5 ' -GN (20) GG或者 5' -N(21)GG的序列排列規則； (2) 所述SgRNA在PCSK9基因上的靶序列位于基因的外顯子； (3) 所述SgRNA在PCSK9基因上的靶序列位于不同的各種剪切形式的共有外顯子上； (4) 所述SgRNA在PCSK9基因上的靶序列是唯一的。2. 根據權利要求1所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特 異性靶向PCSK9基因的sgRNA，其特征在于：其對應的DNA序列如序列表SEQ ID NO. . 1-456 任意一條序列所示。3. 根據權利要求1所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特 異性靶向PCSK9基因的sgRNA，其特征在于：其對應的DNA序列如序列表SEQ ID NO. . 46-80 任意一條序列所示。4. 根據權利要求1所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特異 性靶向PCSK9基因的sgRNA，其特征在于：其對應的DNA序列如序列表SEQ ID NO. 46、51、52 或者54任意一條序列所示。5. 根據權利要求1所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法，其特征在于： (1) 權利要求1-4任意一項所述的sgRNA，在其對應DNA序列的5'加上CACC，合成得到 正向寡核苷酸即Forward oligo ;權利要求1-4任意一項所述的sgRNA，獲得其對應DNA序 列的互補鏈，并且在互補鏈的5'加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo ;將合 成的一對互補的SgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火，退 火之后形成可以連入U6真核表達載體的雙鏈SgRNA寡聚核苷酸； (2) 線性化序列如序列表SEQ ID No. 458所示的pCG-U6-BfuAI-sgRNA質粒；將 退火的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸與用BfuAI線性化pCG-U6-BfuAI-sgRNA質粒連接獲 得pCG-U6-hPCSK9sg質粒；pCG-U6-hPCSK9sg質粒轉化stabl3感受態細菌并涂氨芐平 板，挑選陽性克隆并用序列如序列表SEQID NO. . XX所示的通用引物U6測序的方法鑒 定出陽性克隆；37°C搖床搖陽性克隆菌過夜并用康為試劑Plasmid Miniprep Kit抽提 pCG-U6-hPCSK9sg 質粒； (3) 用脂質體 Iipofectamine 2000 混合 pCG-U6-hPCSK9sg 質粒和序列為 SEQ ID NO. . 457 的 pCG-NLS-FLAG-Cas9 質粒，共轉染細胞； (4) 用T7EN1酶切檢測和TA克隆測序確認PCSK9基因已經被敲除并獲得基因敲除的細 胞。6. 根據權利要求5所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法，其特征在于： 步驟（3)所述的脂質體為 Lipofectamine?2000 Transfection Reagent。7. 根據權利要求5所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法，其特征在于： 步驟⑴所述的sgRNA其對應的DNA序列為序列表SEQ ID NO. 46、51、52或者54任 意一條序列所示，分別對應的步驟（2)和（3)所述的pCG-U6-hPCSK9sg質粒的序列為序列 表 SEQ ID Nd. 459-462,即 sgRNA 序列為 SEQ IDNd. 46 對應的 pCG-U6-hPCSK9sg 質粒為 SEQ ID NO. · 459, sgRNA 序列為 SEQ ID NO. · · 51 對應的 pCG-U6-hPCSK9sg 質粒為 SEQ ID NO. · 460, sgRNA 序列為 SEQ ID NO. · 52 對應的 pCG-U6-hPCSK9sg 質粒為 SEQ ID NO. · 461， sgRNA 序列為 SEQ ID Nd · 54 對應的 pCG-U6-hPCSK9sg 質粒為 SEQ ID Nd · 462。8. 根據權利要求7所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法中用到的 pCG-U6-hPCSK9sg質粒，其特征為序列如序列表SEQ ID NO. . 459-462任意一條所述。9. 根據權利要求7所述的CRISPR-Cas9特異性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特異 性靶向PCSK9基因的sgRNA，其特征在于： (1)權利要求1-4任意一項所述的sgRNA，在其對應的DNA鏈5'加上CACC合成得到正 向寡核苷酸即Forward oligo ;權利要求1-4任意一項所述的sgRNA，獲得其對應DNA的互 補鏈，并且在互補鏈的5'加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo ;將合成的I 對互補的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成對變性、退火，退火之后 形成可以連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸； ⑵線性化序列如序列表SEQ ID NO. . 458所示的pCG-U6-sgRNA質粒；將退火的 雙鏈sgRNA寡聚核苷酸與線性化pCG-U6-sgRNA質粒連接獲得pCG-U6-hPCSK9sg質粒； pCG-U6-hPCSK9sg質粒轉化感受態細菌并涂氨芐平板，挑選陽性克隆并用序列如序列表 SEQID NO. 463所示的通用引物U6測序的方法鑒定出陽性克隆；37°C搖床搖陽性克隆菌過 夜并用康為試劑Plasmid Miniprep Kit抽提質粒； (3) 用Lipofectamine?2000 Transfection Reagent裝載兩種或者兩種以上不同的 pCG-U6-hPCSK9sg質粒和序列為SEQ ID NO. 457的pCG-NLS-Cas9質粒，共轉染細胞； (4) 用T7EN1酶切檢測確認PCSK9基因已經被敲除并獲得基因敲除的細胞。
【文檔編號】C12N15/57GK105886498SQ201510240981
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年5月13日
【發明人】沈志榮, 王鳳超
【申請人】沈志榮