一種黃緣盒龜糞便提取dna的方法
【專利摘要】本發明涉及一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，屬于DNA分離純化技術領域。將黃緣盒龜糞便作為樣品采集后，立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs浸泡；離心管中，加入二硫蘇糖醇裂解液，裂解液與糞便混勻后水浴處理；加入蛋白酶K（PK）定量后，冰上靜置；離心，取上清至另一無菌離心管中，棄沉淀；向上清中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液抽提；加入NaAc在旋渦混合器上混勻后，再加入預冷的無水乙醇，充分混勻后靜置；再次離心，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；加入乙醇，重新洗滌沉淀；室溫晾干，當沉淀趨于透明時加入TE溶解。將發明應用于黃緣盒龜DNA提取，具有操作便捷、黃緣盒龜損傷小等優點。
【專利說明】
一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，屬于DNA分離純化技術領域。
【背景技術】
[0002] 黃緣盒龜（Cistoclemmys flavomarginata,Yellow-margined Box Turtle)隸屬 于龜鱉目（Testudinata)、淡水龜科(Geoemydidae)、盒龜屬（Cistoclemmys)。因其背甲緣盾 腹部黃色，眼眶上有一條金黃色條紋，故得名。黃緣盒龜在我國主要分布于浙江、安徽、福 建、江蘇、河南、廣西、廣東、臺灣等地，鄰國日本也有分布。我省主要分布在臨安、建德、安 吉、龍游、天臺、新昌等地。由于黃緣盒龜為龜中珍品，是高級的滋補品，其藥用價值較高，還 具有較大的觀賞價值。近年來，由于人為過渡捕捉，野生黃緣盒龜資源及其棲息地受到嚴重 破壞，野生數量急劇減少。1998年該種群已被列入國家珍稀瀕危動物，2006年被聯合國列為 瀕危級動物種群（IUCN，2006)。除人為因素以外，由于野生黃緣盒龜生長緩慢，加之，全球氣 候變暖以及惡劣反常天氣的頻繁出現，使其交配環境、孵化條件等與最適條件有了不小的 差距，所以性成熟后產卵量極少，受精率、孵化率及成活率均極低，并且對其性別分化等也 產生了較大影響，導致野生種群瀕臨滅絕。
[0003] 目前，對我省野生黃緣盒龜的種質資源調查，以及與臨近省份野生種群親緣關系 分析鑒定尚未有效開展，對黃緣盒龜擬生態馴養繁殖開展尚處于探索階段。我省已有幾家 養殖企業開始試探性養殖黃緣盒龜，但由于黃緣盒龜生長周期長，純系和雜交龜在稚龜期 差異較小，養殖6-8年后珍品黃緣盒龜性狀才能顯現，從而產生了較大的養殖風險。傳統用 于DNA提取的樣本主要來源于血液或組織塊，但是對于野生瀕危動物，取血和獲取組織塊都 對動物本身具有傷害并有可能帶來疾病感染，對其生存具有一定的隱患。
[0004] 基于此，做出本申請。
【發明內容】
[0005] 為了克服現有黃緣盒龜鑒定所存在的上述缺陷，本申請提供一種簡便易行、操作 方便、無需離體解剖的黃緣盒龜糞便提取DNA的方法。
[0006] 為實現上述目的，本申請采取的技術方案如下：
[0007] -種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，包括如下步驟：（1)將黃緣盒龜糞便作為樣品 采集后，立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs(DMS0/EDTA/Tris鹽溶液)浸泡；（2)取上述浸 泡中的糞便于離心管中，加入二硫蘇糖醇(DTT)裂解液，裂解液與糞便混勻后水浴處理；（3) 加入蛋白酶K(PK)定量后，立即放入冰上靜置；（4)離心，取上清至另一無菌離心管中，棄沉 淀；向上清中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液抽提；（5)加入NaAc在旋渦混合器上混勻 后，再加入預冷的無水乙醇，充分混勻后靜置；（6)再次離心，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；
[7] 加入體積濃度70 %乙醇，重新洗滌沉淀；（8)室溫晾干，當沉淀趨于透明時加入TE溶解。
[0008] 進一步的，作為優選：
[0009] 步驟（1)中，樣品自采集到用于步驟(2)及其后續步驟的DNA提取常溫保存90天~ 120 天。
[0010] 步驟（2)中，裂解液構成為：1 OOmmo 1 /LTr i s-HCl，pH8，1 · 4mo 1 /LNaCl，20mmo 1 / LEDTA,0.4mol/L DTT〇
[0011] 步驟(2)中，水浴溫度為40~60°C，水浴時間1-4小時。
[0012] 步驟(3)中，加入蛋白酶K定量后于50-55°C下處理5~15分鐘后，于冰上靜置5~15 分鐘。
[0013]步驟⑷中，酸/氯仿/異戊醇混合液中，酚:氯仿:異戊醇=25:24:1 (體積比）。
[0014] 步驟(5)中，NaAc濃度為1.5~5mol/L，添加量為步驟⑷處理后溶液體積的0.1~ 〇. 3倍;無水乙醇的添加量為添加 NaAc后溶液體積的1~3倍;混勻后于-10~-30°C下靜置 0.5~1小時。
[0015] 通過本申請技術方案的實施，通過收集評價野生黃緣盒龜種質資源，采用"排泄 物"取樣方式，這種方式可在不傷害甚至不必見到動物的情況下，利用這些樣品提取動物 DNA并進行PCR擴增，再利用mtDNA，PCR等遺傳學、分子生物學技術，建立黃緣盒龜種質分子 鑒定分析方法，實現在不影響野生種群分布的前提下探明黃緣盒龜野生資源現狀，所建立 的黃緣盒龜種質分子鑒定方法，有利于探明野生黃緣盒龜種質資源，并通過對野生黃緣盒 龜的生活、交配、繁育等條件調查，構建黃緣盒龜擬生態馴養繁殖體系，從而進行生物個體 遺傳信息的分析;最終有效的保護這一瀕危物種，為保護物種多樣性，也為中醫藥自然資源 的可持續利用提供途徑。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本申請的瓊脂糖核酸電泳檢測譜圖。
【具體實施方式】 [0017] 實施例！
[0018] 糞便樣品在采集后立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs(DMSO/EDTA/Tris鹽溶液） 浸泡，常溫保持90天，待用。
[0019] 1)取100mg上述糞便于lmL離心管中，加入lmL二硫蘇糖醇(DTT)裂解液，混勻后40 °C水浴4h，其中裂解液構成為：100mmol/LTris-HCl，pH=8,1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA， 0.4mol/L DTT；
[0020] 2)加入蛋白酶 K(PK)至 0.0211^，55°(：，1〇11^11，立即放入冰上1511^11。
[0021 ] 3)12000g離心5min，取上清至另一無菌1.5mL離心管中，棄沉淀。向上清中加入等 體積酚:氯仿:異戊醇為25:24:1的混合物抽提；
[0022] 4)加入0.15倍體積的1.5mol/LNaAc，在旋渦混合器上混勻后加入2倍體積(加入鹽 之后計算的體積)預冷的無水乙醇，充分混勻后-1 〇 °C放置0.5h~lh;
[0023] 5)12000r/min離心10min，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；
[0024] 6)加入500yL70 %乙醇重新洗滌沉淀2次；
[0025] 7)室溫晾干，當沉淀趨于透明時加入lOOyLTE溶解。
[0026] 實施例2
[0027] 糞便樣品在采集后立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs(DMS0/EDTA/Tris鹽溶液） 浸泡，常溫保持100天，待用。
[0028] 1)取100mg上述糞便于lmL離心管中，加入lmL二硫蘇糖醇(DTT)裂解液，混勻后45 °C水浴3h，其中裂解液構成為：100mmol/LTris-HCl，pH=8,1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA， 0.4mol/L DTT；
[0029] 2)加入蛋白酶K(PK)至0.02mg，50°C，15min，立即放入冰上5min。
[0030] 3)12000g離心5min，取上清至另一無菌1.5mL離心管中，棄沉淀。向上清中加入等 體積酚:氯仿:異戊醇為25:24:1的混合物抽提；
[0031] 4)加入0.2倍體積的4mol/LNaAc，在旋渦混合器上混勻后加入2倍體積（加入鹽之 后計算的體積)預冷的無水乙醇，充分混勻后-20 °C放置0.5h~lh;
[0032] 5)12000r/min離心10min，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；
[0033] 6)加入500yL70%乙醇重新洗滌沉淀2次；
[0034] 7)室溫晾干，當沉淀趨于透明時加入lOOyLTE溶解。
[0035] 實施例3
[0036] 糞便樣品在采集后立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs(DMS0/EDTA/Tris鹽溶液） 浸泡。
[0037] 1)取100mg上述浸泡的糞便于lmL離心管中，加入lmL二硫蘇糖醇(DTT)裂解液，裂 解液（l〇〇mmol/LTris-HCl，pH=8，1 ·4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，0 · 4mol/L DTT)，混勻后55 °C水浴2h;
[0038] 2)加入蛋白酶K(PK)至0.02mg，50°C，8min，立即放入冰上lOmin。
[0039] 3)12000g離心5min，取上清至另一無菌1.5mL離心管中，棄沉淀。向上清中加入等 體積酚:氯仿:異戊醇為25:24:1的混合物抽提；
[0040] 4)加入0.1倍體積的3mol/LNaAc，在旋渦混合器上混勻后加入1.5倍體積(加入鹽 之后計算的體積)預冷的無水乙醇，充分混勻后-20 °C放置0.5h~lh;
[0041 ] 5)12000r/min離心10min，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；
[0042] 6)加入500yL70%乙醇重新洗滌沉淀2次；
[0043] 7)室溫晾干，當沉淀趨于透明時加入1 OOyLTE溶解。
[0044] 實施例4
[0045] 糞便樣品在采集后立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs(DMS0/EDTA/Tris鹽溶液） 浸泡，常溫保持120天，待用。
[0046] 1)取100mg上述奠便于lmL離心管中，加入lmL二硫蘇糖醇(DTT)裂解液，混勾后60 °C水浴lh，其中裂解液構成為：100mmol/LTris-HCl，pH=8,1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA， 0.4mol/L DTT；
[0047] 2)加入蛋白酶K(PK)至0.02mg，55°C，5min，立即放入冰上lOmin。
[0048] 3)12000g離心5min，取上清至另一無菌1.5mL離心管中，棄沉淀。向上清中加入等 體積酚:氯仿:異戊醇為25:24:1的混合物抽提；
[0049] 4)加入0.3倍體積的5mol/LNaAc，在旋渦混合器上混勻后加入3倍體積（加入鹽之 后計算的體積)預冷的無水乙醇，充分混勻后-30 °C放置0.5h~lh;
[0050] 5)12000r/min離心10min，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干；
[0051 ] 6)加入500yL70%乙醇重新洗滌沉淀2次；
[0052] 7)室溫晾干，當沉淀趨于透明時加入1 OOyLTE溶解。
[0053]將上述實施例的溶解液進行如下處理：
[0054] (a)PCR引物設計
[0055] 表1黃緣盒龜線粒體基因組全序列擴增引物
[0056]
[0057] (b)PCR 擴增
[0058] PCR擴增使用東洋紡(上海)生物技術有限公司的高保真酶KOD FX。
[0059] 表2PCR反應組分
[0061 ] 表3PCR反應程序
[0063] 對線粒體基因 PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測，并用凝膠回收試劑盒（DNA GelExtractionKit，Takara)進行目的片斷的回收;對微衛星PCR產物進行聚丙稀酰胺電泳 檢測；用純化試劑盒(￡.2.1'1.4〇7〇16?11代1(;[1:，0111683)進行純化回收。回收后的產物進行測 序，該序列可用于在NCBI數據庫中比對分析，即完成整個DNA的提取和檢測應用。
[0064] 電泳檢測：1 %瓊脂糖電泳，結合圖1，可以看到DNA條帶明顯，DNA采集純度較高。
[0065] 通過本申請技術方案的實施，通過收集評價野生黃緣盒龜種質資源，采用"排泄 物"取樣方式，這種方式可在不傷害甚至不必見到動物的情況下，利用這些樣品提取動物 DNA并進行PCR擴增，再利用mtDNA，PCR等遺傳學、分子生物學技術，建立黃緣盒龜種質分子 鑒定分析方法，實現在不影響野生種群分布的前提下探明黃緣盒龜野生資源現狀，所建立 的黃緣盒龜種質分子鑒定方法，有利于探明野生黃緣盒龜種質資源，并通過對野生黃緣盒 龜的生活、交配、繁育等條件調查，構建黃緣盒龜擬生態馴養繁殖體系，從而進行生物個體 遺傳信息的分析;最終有效的保護這一瀕危物種，為保護物種多樣性，也為中醫藥自然資源 的可持續利用提供途徑。
[0066]以上內容是結合本發明創造的優選實施方式對所提供技術方案所作的進一步詳 細說明，不能認定本發明創造具體實施只局限于上述這些說明，對于本發明創造所屬技術 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明創造構思的前提下，還可以做出若干簡單推演 或替換，都應當視為屬于本發明創造的保護范圍。
【主權項】
1. 一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將黃緣盒龜糞便作為樣品采集后，立即裝入滅過菌的離心管中，用DETs浸泡； (2) 取上述浸泡中的糞便于離心管中，加入裂解液，裂解液與糞便混勻后水浴處理； (3 )加入蛋白酶K定量后，立即放入冰上靜置； (4) 離心，取上清至另一無菌離心管中，棄沉淀；向上清中加入等體積的酚/氯仿/異戊 醇混合液抽提； (5) 加入NaAc在旋渦混合器上混勻后，再加入預冷的無水乙醇，充分混勻后靜置； (6) 再次離心，吸棄上清，沉淀在室溫中涼干； (7) 加入體積濃度70%乙醇，重新洗滌沉淀； (8) 室溫晾干，當沉淀趨于透明時加入TE溶解。2. 如權利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于：步驟（1)中，樣 品自采集到用于步驟(2)及其后續步驟的DNA提取常溫保存90天~120天。3. 如權利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于：步驟(2)中，裂 解液構成為：100 mm〇l/LTris-HCl，pH8，1.4 mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，0.4 mol/L DTT04. 如權利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于：步驟(2)中，水 浴溫度為40~60°C，水浴時間1-4小時。5. 如權利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于：步驟(3)中，加 入蛋白酶K定量后于50-55 °C下處理5~15分鐘后，于冰上靜置5~15分鐘。6. 如權利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于:步驟(4)中，酚/ 氯仿/異戊醇混合液中，酚:氯仿:異戊醇=25:24:1。7. 如權利要求1所述的一種黃緣盒龜糞便提取DNA的方法，其特征在于：步驟（5)中， NaAc濃度為1.5~5moI/L，添加量為步驟(4)處理后溶液體積的0.1~0.3倍;無水乙醇的添 加量為添加 NaAc后溶液體積的1~3倍;混勻后于-10~-20°C下靜置0.5~1小時。
【文檔編號】C12N15/10GK105886495SQ201610439317
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月17日
【發明人】壽建昕
【申請人】紹興文理學院元培學院