一種固定化脂肪酶及其制備方法和在催化合成甘油酯型pufa中的應用
【專利摘要】本發明公開了一種固定化脂肪酶及其制備方法和在催化合成甘油酯型PUFA中的應用，所述脂肪酶為來源于放線菌(Streptomyces)的脂肪酶MAS1，固定化載體為XAD1180樹脂。其制備方法，包括以下幾個步驟：(1)將XAD1180樹脂依次用乙醇、酸和堿浸泡，以去除樹脂大孔中的氣泡和殘留物；(2)在pH 6.0?9.0的磷酸鹽緩沖液中，將MAS1脂肪酶與處理好的XAD1180樹脂按25～150mg/g樹脂比例混合靜置，即制得固定化脂肪酶。本發明使用的固定化脂肪酶，相對于游離脂肪酶具有更佳穩定性，可重復性，節約了生產成本；同時酯化效率到達99.31％，而PUFA甘油三酯含量達到92.26％。
【專利說明】
一種固定化脂肪酶及其制備方法和在催化合成甘油酯型PUFA 中的應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種固定化脂肪酶的制備及其在催化合成高含量甘油酯型PUFA中的 應用技術。
【背景技術】
[0002] 多不飽和脂肪酸(PUFA)-般是指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18~22 個碳原子的直鏈脂肪酸，主要來源于海產魚油及植物油脂。目前研究表明具有重要生理活 性的HJFA主要有二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(DPA)、花生四 烯酸(AA)、十八碳四烯酸(SDA)、a-亞麻酸(ALA)、γ-亞麻酸(GLA)等。其具有降低人體血液 粘稠度，改善血液微循環，降低血中膽固醇和甘油三酯等生理調節功能，目前日益受到關 注。
[0003] 甘油酯型的PUFA相對于其他形式PUFA(主要是乙酯型和游離脂肪酸型）具有穩定 性強容易被人體吸收，是保健品和藥品的最佳產品形式，具有更高的商業價值。相對于化學 法合成甘油酯型的PUFA，酶法催化合成方法具有反應條件溫和，特異強及環境友好等優點。 但目前文獻報道的大部分脂肪酶均表現出Sn-Ι，3位特異性脂肪酶，鮮有非特異性脂肪酶。 在實際應用中，由于產物的反饋抑制作用導致PUFA酰基供體的轉化率不高、甘油酯中甘油 三酯含量低的問題。雖然可以通過延長反應時間或者提高酶添加量來提高產物的量，但會 導致生產成本的提高。
【發明內容】
[0004] 針對現有甘油酯型PUFA制備方法酶催化效率低、底物轉化率不高、甘油酯中甘油 三酯含量低的問題，本發明提供了一種固定化脂肪酶的制備及其在催化合成高含量甘油酯 型PUFA中的應用技術。本發明中所用的放線菌Streptomyces的脂肪酶MAS1是一種位置非特 異性的脂肪酶，而其固定化形式，提高了它的使用頻率和壽命，反應的酯化率達到99.31%， 甘油三酯含量為92.26 %，且結合到甘油三酯中PUFA含量達到92.26 %。
[0005] 本發明為了達到上述目的，通過以下技術方案實現：
[0000] -種固定化脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶為來源于放線菌（Streptomyces)的 脂肪酶MAS1，固定化載體為XAD1180樹脂。
[0007] 所述固定化脂肪酶的制備方法，包括以下幾個步驟：
[0008] (1)將XAD1180樹脂依次用乙醇、酸和堿浸泡，以去除樹脂大孔中的氣泡和殘留物； [0009] (2)在?!16.0-9.0的磷酸鹽緩沖液中，將1^31脂肪酶與處理好的乂401180樹脂按25 ~150mg/g樹脂比例混合靜置，即制得固定化脂肪酶。
[0010] 所述MAS1脂肪酶與XAD1180樹脂按50-75mg/g樹脂比例混合。
[0011] 所述磷酸鹽緩沖液pH為8.0。
[0012] 所述MAS1脂肪酶與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:1。
[0013] 步驟(1)中每一步浸泡后均用水反復清洗至中性后，才進行下一步的處理。
[0014] 所述乙醇、酸和堿分別為95 %乙醇，5 %鹽酸和2%氫氧化鈉，浸泡時間分別為24小 時，4小時，4小時。
[0015] 所述固定化脂肪酶在催化合成甘油酯型PUFA中的應用。具體為，利用所述固定化 脂肪酶為催化劑，PUFA的酰基供體與甘油進行反應，甘油與PUFA的摩爾比為1:(1-5)，酶添 加量為112.5-225U/g底物，反應溫度為50-70°C，反應時間0_24h。
[0016] 優選地，所述反應溫度為65°C，最佳酶添加量為150U/g底物，甘油與PUFA的最佳摩 爾比為1:3。
[0017] 與現有技術相比，本發明的有益效果在于：
[0018] (1)本發明使用的脂肪酶MAS1為非位置特異性脂肪酶，避免了普通脂肪酶在催化 反應中所遇到的轉化效率不高、PUFA甘油三酯含量低等問題，其酯化效率達到99.31%， PUFA甘油三酯含量達到92.26%，而常用Novozym 435在相同條件下酯化效率為82.16%，甘 油三酯含量只有47.26%。
[0019] (2)本發明使用的固定化脂肪酶，相對于游離脂肪酶具有更佳穩定性，可重復性， 節約了生產成本。
【附圖說明】
[0020] 圖1為起始pH值(a)和酶/樹脂比率(b)對酶固定化效率的影響圖。
[0021 ]圖2為固定化MAS1脂肪酶催化反應效果圖，（a)溫度的影響，（b)加酶量的影響，（c) 甘油與PUFA摩爾比的影響。
[0022]圖3為固定化MAS1脂肪酶(a)與N〇V〇zym435(b)催化合成PUFA甘油酯效率比較圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例對本發明作進一步具體詳細描述，但本發明的實施方式不限 于此，對于未特別注明的工藝參數，可參照常規技術進行。
[0024] 實施例1
[0025]固定化脂肪酶MAS1的制備 [0026] 1.1固定化樹脂的前處理及篩選
[0027] 10g XAD1180/DA201/HP20/HP2MGL/AB8五種大孔吸附樹脂分別依次用30mL 95% 乙醇，5 %鹽酸和2 %氫氧化鈉各處理24h，4h，4h，每步處理后，上清液濾掉，用蒸餾水反復多 次洗，直到上清液的pH值為7.0為止，才進行下一步的處理，最后樹脂用20mmol/L不同pH值 的緩沖液浸泡4h，將濾干后的樹脂置于4°C冰箱中保存備用。用乙醇和酸堿浸泡樹脂的目的 分別是為了趕出大孔中的氣泡和除去大孔中殘留的單體和化合物。
[0028] 將脂肪酶MAS1酶液50mg/g樹脂、等體積的20mM pH8磷酸鹽緩沖液和用相應pH值預 處理后的樹脂按照一定比例混勾，200rpm，30°C水浴振蕩吸附一定時間，抽濾分離載體和上 清液，并用相應pH值的緩沖液沖洗固定化酶，再將洗凈后的固定化酶于40°C真空干燥8h后， 分別測定所得固定化酶的蛋白含量、酯化活力和比酶活，結果如表1所示。蛋白吸附量的測 定采用考馬斯亮藍染色法(Bradford法）。固定化脂肪酶MAS1的酯化活力的測定參照諾維信 標準分析方法進行。
[0029]表1固定化樹脂的篩選
[0032] 由表1可知，以XAD1180樹脂為載體的固定化脂肪酶具有最大的蛋白吸附量 (106.08mg/g)、最高的酯化酶活（2510.06U/g)和比酶活（~23.66U/mg蛋白），接著是以 DA201樹脂為載體的固定化酶表現出的特性僅次于XAD1180樹脂。雖然AB-8樹脂對脂肪酶 MAS1的最大吸附量只有67.93mg/g，但其酯化酶活和比酶活與HP20和HP2MGL樹脂接近。說明 低蛋白吸附量并不意味著低酯化酶活和比酶活。因此，在后續的實驗中，選擇XAD1180樹脂 作為固定化MAS1脂肪酶的最佳載體。
[0033] 1.2最適固定化緩沖液pH值
[0034]固定化條件為:MAS1脂肪酶/載體比為50mg/g樹脂，酶液與20mmol/L pH6.0-9.0的 磷酸鹽緩沖液體積比為1:1，200rpm，30°c水浴振蕩吸附一定時間，抽濾分離載體和上清液， 并用相應pH值的緩沖液沖洗固定化酶，再將洗凈后的固定化酶于40°C真空干燥8h后，分別 測定所得固定化酶的蛋白含量、酯化活力和比酶活，結果如圖1所示。
[0035] 從圖la可以看出，固定化酶的蛋白吸附量在pH6-9范圍內沒有明顯的變化。固定化 酶的酯化活性和比酶活均隨著pH值的增加，先上升后下降，在pH8時，固定化MAS1獲得最大 的酯化活力(2712.96U/g)和比活力(26.35U/mg)。在固定化過程中，pH值的變化會影響酶的 構象，或促進酶的沉淀(等電點）。因此，選擇PH8為脂肪酶MAS1的最佳固定化緩沖液pH值。
[0036] 1.3最佳酶/載體比的確定
[0037]固定化條件為：MAS1脂肪酶/載體比為25，50，75，100，150mg/g樹脂，酶液與 20mmol/L pH8.0的磷酸鹽緩沖液體積比為1:1，200rpm，30°C水浴振蕩吸附一定時間，抽濾 分離載體和上清液，并用PH8.0的緩沖液沖洗固定化酶，再將洗凈后的固定化酶于40°C真空 干燥8h后，分別測定所得固定化酶的蛋白含量、酯化活力和比酶活，結果如圖1所示。
[0038]由圖lb可知，隨著酶/載體比的增加，固定化酶的蛋白吸附量逐漸增加，而其酯化 活力和比酶活的變化趨勢則不一樣。當酶/載體比從25mg/g增加到75mg/g時，固定化酶的酯 化活性和比酶活均逐漸增加；當酶/載體比為75mg/g樹脂時，酯化酶活和比酶活均達到最大 值，分別為2731.67U/g和27.34U/mg;然而，隨著酶/載體比的進一步增加，酯化活性和比酶 活均下降。可能是因為當酶添加量過高時，酶分子在樹脂表面發生了多層吸附，產生了一定 的空間位組，使底物分子與酶活性中心的定位和接近受到影響，對酶活性產生一定的抑制 作用，從而導致固定化酶的酯化活性和比活力下降。因此，樹脂XAD1180吸附脂肪酶MAS1的 最適酶/載體比為75mg/g。
[0039]綜述所述，固定化脂肪酶MAS1選擇樹脂XAD1180為最適載體時的最佳固定化條件 為:緩沖液pH=8，最適酶/載體比為75mg/g。
[0040] 實施例2
[00411固定化脂肪酶MAS1催化酯化反應合成富含n-3PUFA的甘油三酯 [0042] 10g底物(甘油與PUFA摩爾比為1: 1，1:2，1:3，1:4，1: 5)置于250mL具塞三角瓶中， 按照酶活單位添加一定量的脂肪酶（750U，1125U，1500U，1875U，2250U)，置于不同溫度（50 °C，55°C，60°C，65°C，70°C)的恒溫振蕩器中抽真空反應24h，轉速為200rpm，于不同的反應 時間取樣，HPLC分析反應混合物的組成，GC分析TAG的脂肪酸組成，并與相同條件下相同酶 活單位的Novozym 435催化的酯化反應作對比。
[0043]由圖2(a)可知，在甘油與n-3PUFA的摩爾比為1:3,750U固定化酶的條件下，當溫度 在50-65°C的范圍內，固定化脂肪酶MAS1催化甘油與n-3PUFA反應的酯化率和TAG含量均隨 著溫度的增加而逐漸增加；在溫度為65°C時，酯化率和TAG含量均獲得最大值，分別為 75.60%和65.29% ;再提高溫度，酯化率和TAG含量反而下降了。
[0044]由圖2(b)可知，在甘油與n-3PUFA的摩爾比為1:3,溫度為65°C的條件下，當酶添加 量從750U增加到1500U時，酯化率從75.60 %增加到95.01 % ;繼續增加酶添加量，酯化率稍 微下降。TAG含量的變化趨勢與酯化率相同，此時TAG含量為89.37%。
[0045]由圖2(c)可知，在1500固定化酶和溫度為65°C的條件下，隨著甘油含量的增加，酯 化率和TAG含量逐漸增加；當甘油與n-3HJFA的摩爾比為1: 3時，TAG含量獲得最大值，為 90.84%，此時酯化率為98.77 %。繼續增加甘油的含量，酯化率變化不明顯，TAG含量下降， 此時甘油與n-3PUFA的摩爾比為1:1，酯化率達到最大，為99.59%。
[0046]綜上所述，固定化脂肪酶MAS1催化甘油和n-3PUFA反應的最優條件為：甘油：11-3PUFA=l:3(mol/mol)，65°C，1500U 固定化酶。
[0047]在甘油與n-3PUFA的摩爾比為1:3，1580U固定化脂肪酶MAS1，溫度為65°C的條件 下，固定化MAS1催化甘油與n-3PUFA反應24h，用HPLC分析不同取樣時間點的甘油酯組成，GC 分析TAG中各種脂肪酸組成，并與相同條件下相同酶活單位的Novozym 435催化的酯化反應 作對比，結果如圖3所示。
[0048]由圖3可知，在相同的反應條件下，固定化MAS1和目前文獻報道催化甘油與PUFA反 應最好的商品化酶Novozym435相比，固定化MASl(a)催化該反應的酯化率達到99.31 %，基 本可實現n-3PUFA的完全轉化，其中TAG含量高達92.26%，DAG含量為6.8%，MAG含量為 0.23%，接近天然魚油的甘油酯組成。而如￥〇"111435(13)催化該反應酯化率僅為82.16%，與 文獻報道基本一致，明顯低于固定化MAS1，其中TAG含量僅為47.26 %，DAG含量為33.31 %， MAG含量為1.41 %。
【主權項】
1. 一種固定化脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶為來源于放線菌（Streptomyces)的脂 肪酶MSl，固定化載體為XADl 180樹脂。2. 權利要求1所述固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，包括以下幾個步驟： (1) 將XAD1180樹脂依次用乙醇、酸和堿浸泡，以去除樹脂大孔中的氣泡和殘留物； (2) 在pH 6.0-9.0的磷酸鹽緩沖液中，將MASl脂肪酶與處理好的XADl 180樹脂按25~ 150mg/g樹脂比例混合靜置，即制得固定化脂肪酶。3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述MASl脂肪酶與XADl 180樹脂按50-7 5mg/g樹脂比例混合。4. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液pH為8.0。5. 根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述MASl脂肪酶與磷酸鹽緩沖液的體 積比為1:1。6. 根據權利要求2或3或4或5所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中每一步浸泡后均 用水反復清洗至中性后，才進行下一步的處理。7. 根據權利要求2或3或4或5所述的制備方法，其特征在于，所述乙醇、酸和堿分別為 95 %乙醇，5 %鹽酸和2 %氫氧化鈉，浸泡時間分別為24小時，4小時，4小時。8. 權利要求1所述固定化脂肪酶在催化合成甘油酯型PUFA中的應用。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，利用所述固定化脂肪酶為催化劑，PUFA的 酰基供體與甘油進行反應，甘油與PUFA的摩爾比為1: (1-5)，酶添加量為112.5-225U/g底 物，反應溫度為50-70 °C，反應時間0_24h。10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述反應溫度為65°C，酶添加量為150U/g 底物，甘油與PUFA的摩爾比為1:3。
【文檔編號】C12P7/64GK105886492SQ201610397164
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月6日
【發明人】王永華, 藍東明, 汪秀妹, 楊博, 王衛飛
【申請人】華南理工大學