芽孢桿菌菌株dr011及用其制備的植物耐旱誘導劑的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種芽孢桿菌菌株DR011及用其制備的植物耐旱誘導劑，該菌株為芽孢桿菌（Bacillus sp.），保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期2016年5月23日，保藏編號為CGMCC No.12482。由DR011菌株液體發酵培養制成的菌劑，提高植物的耐旱性；在溫室中使用菌劑DR011對提高番茄和黃瓜的耐旱性具有較好效果，黃瓜干旱10天后重新澆水，存活率達到80.1%；番茄干旱15天后重新澆水，存活率達到90%。CGMCC No. 1248220160523
【專利說明】
芽孢桿菌菌株DR011及用其制備的植物耐旱誘導劑
技術領域
[0001]本發明屬于農業微生物領域，涉及芽孢桿菌菌株DR011及用其制備的植物耐旱誘 導劑。
【背景技術】
[0002] 我國干旱和半干旱地區面積占國土面積1/2,干旱已成為限制植物生長發育、基因 表達和產量的重要生態環境因素，對植物的危害在所有非生物危害中占居首位。隨著全球 性的氣候異常和生態平衡的破壞，土地日趨沙漠化和鹽堿化，干旱問題將日益嚴重。全國每 年因干旱而造成的作物減產估計達20%，提高作物耐干旱性是減輕災害的重要措施。因此， 提高作物的耐旱能力是現代農業研究工作中的熱點問題之一。除了培育抗旱性的品種，在 自然界中尋找安全無毒性的抗逆保護劑也是提高作物耐旱性的重要手段。
[0003] 植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生 活在土壤或附生于植物根系的一類促進植物生長及其對礦質營養的吸收和利用，并能抑制 有害生物的有益菌類。PGPR對植物沒有致病性，而且對植物具有防病作用和促生作用。
[0004] 植物根際促生菌PGPR改善植物根際土壤生態環境，尤其是對植物根系生長具有顯 著的促進作用。PGPR通過固氮、溶磷、分泌植物生長激素和抗生素類物質促進植物生長，提 高植物體對干旱等環境脅迫的抵抗反應能力。因此，將植物根際促生菌PGPR用于提高植物 的耐旱性具有很大的應用潛力。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是:提供一種芽孢桿菌菌株DR011及用其制備的植物耐旱誘導劑，采 用微生物菌株DR011制備的細菌制劑，提高植物耐旱性，增加植物在干旱環境下的存活率。
[0006] 本發明的技術解決方案是：該芽孢桿菌菌株DR011，經鑒定屬于芽孢桿菌屬，分類 命名為feciDus sp.，于2016年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究 所，菌種保藏號為CGMCC No. 12482。
[0007] 其中，所述菌株DR011制備的植物耐旱誘導劑，該植物耐旱誘導劑的制備方法是： 將芽孢桿菌DR011的種子菌液以1:100體積比接種至LB發酵培養液中發酵培養，28-30°C、 180_200rpm培養40-48 h;然后5000-6000 rpm離心10-15 min，用滅菌水進行稀釋制成菌 劑，菌劑成品中活菌總濃度為1X10 9~1X10 1(3 CFU/mL。
[0008] 其中，所述的保藏號為CGMCC No. 12482的芽孢桿菌DR011種子菌液制備方法是： 將保藏號為CGMCC No.12482的芽孢桿菌DR011菌株接種到LB培養液中28°C培養，180 rpm 振蕩培養至600 nm的0D值為0.8時結束培養。
[0009] 其中，所述的保藏號為CGMCC No. 12482的芽孢桿菌菌株DR011制備的植物耐旱誘 導劑的應用方法是:所述的菌劑稀釋100~200倍，在干旱10-15天后灌根處理。
[0010] 本發明的有益效果是:該生物制劑完全沒有因化學藥劑的使用所帶來的一系列問 題，有利于作物的無公害生產，有效提高植物的耐干旱能力。
【具體實施方式】
[0011] 實施例1:芽孢桿菌菌株DR011的篩選 芽孢桿菌DR011 (CGMCC No. 12482)由江蘇省淮安市碼頭鎮番茄根圍土中分離獲得;將 番茄根系切成lcm的小片，用質量濃度1%的次氯酸鈉浸泡5 min，質量濃度70%酒精浸泡1-2 min，無菌水清洗3次；取最后一次清洗的溶液100μΙ涂于R2A固體培養基上培養，若48 h 后無菌生長則認為表面消毒干凈，無菌;取3 g消毒好的樣品置于菌研缽中，加入27 ml無菌 的質量濃度0.85% NaCl，浸軟組織，研磨，用無菌的質量濃度0.85% NaCl梯度稀釋；取10 一\10 _2、10 _3三個梯度的稀釋液各100μΙ涂于R2A上，28°C培養48 h;挑取最大的單菌落 接種到新鮮R2A固體培養基，經反復轉接得到純化菌株，將純化后的菌株用40%甘油保存于-70 °C超低溫冰箱中。
[0012] 鑒定方法:通過形態特征，生理生化實驗和16S rDNA序列分析對該菌株進行鑒定。
[0013] 形態學特征:革蘭氏陽性桿菌，產芽孢，白色，半透明，光滑濕潤菌落，稍隆起，圓形 齊整菌落，無莢膜，周生鞭毛。
[0014] 16S rRNA基因擴增和序列分析：芽孢桿菌屬DR011在R2A培養基中28°C培養至 對數期，以12 000 r/min離心5 min收集菌體，采用上海賽百盛基因技術有限公司的基因組 DNA快速提取試劑盒，提取細菌的基因組DNA，以提取的DNA產物為模板，用細菌16S rRNA擴 增通用引物1]8-27(5'-厶6厶61'1^6厶1'<：(厶〇了66(：1^厶6-3'）、1^1494-1514(5'-(^厶〇66(八6) TACCTTGTTACGAC-3'）從基因組DNA中擴增出16S rDNA基因片段;PCR產物送上海生工生物 工程有限公司進行測序;通過BLAST軟件對測定16S rRNA基因序列進行同源性比較，結 果見表1，因此，將該菌株鑒定為芽孢桿菌屬sp.)。
[0015] 表1 DR011菌株16SRDNA測序比對結果
實施例2: DR011菌劑的制備 將芽孢桿菌0如11(061〇：如.12482)菌株接種到1^培養液中28°(：180印111振蕩培養 16 h后，每隔2 h在超凈工作臺中取樣測其在600 nm處的0D值，當0D值為0.8時結束培養，此 菌液作為種子菌液;把種子菌液以1:100體積比接種至LB發酵培養液中發酵培養，28°C、180 rpm培養48 h，然后6000 rpm離心10 min，取沉淀即得所述的菌劑DR011，所得生防菌劑中 活菌總濃度為1X10 8~1X10 9 CFU/mL。
[0016] 實施例3:DR011菌劑的制備 將芽孢桿菌0如11(061〇：如.12482)菌株接種到1^培養液中28°(：180印111振蕩培養 16 h后，每隔2 h在超凈工作臺中取樣測其在600 nm處的0D值，當0D值為0.8時結束培養，此 菌液作為種子菌液;把種子菌液以1:100體積比接種至LB發酵培養液中發酵培養，29°C、190 rpm培養44 h，然后5500 rpm離心12min，取沉淀即得所述的菌劑DR011，所得生防菌劑中活 菌總濃度為1X10 8~1X10 9 CFU/mL。
[0017] 實施例4:DR011菌劑的制備 將芽孢桿菌0如11(061〇：如.12482)菌株接種到1^培養液中28°(：180印111振蕩培養 16 h后，每隔2 h在超凈工作臺中取樣測其在600 nm處的0D值，當0D值為0.8時結束培養，此 菌液作為種子菌液;把種子菌液以1:100體積比接種至LB發酵培養液中發酵培養，30°C、200 rpm培養40 h，然后5000 rpm離心15 min，取沉淀即得所述的菌劑DR011，所得生防菌劑中 活菌總濃度為1X10 8~1X10 9 CFU/mL。
[0018] 當然，利用所述的提高植物耐旱性的植物根圍促生菌DR011制備菌劑并不限于以 上方法，凡是能夠大量培養DR011，且保持其生防活性的方法均可用于制備本發明請求保護 的植物耐旱性誘導菌劑。
[0019] 實施例5:溫室試驗測定DR011菌劑提高黃瓜耐旱性效果 黃瓜品種為天津市黃瓜研究所選育的津優1號;黃瓜品種的種子浸種催芽48h (25°C) 后播種于育苗穴盤內，置于溫室，正常管理澆水，15d后移苗至容積為450cm2的盆缽中，隔天 澆水25mL;移苗15天后開始處理，設以下2個處理： (1 )DR011菌劑處理:每個棵苗澆灌20mL根圍菌液，正常澆水5d之后，斷水進行模擬干旱 處理； (2)對照組:每棵苗澆灌20mL LB，正常澆水5d后，斷水進行模擬干旱處理； 模擬干旱處理l〇d后重新澆水，重新澆水24 h后統計存活率;抗旱系數測定方法:斷水 后，跟蹤觀察黃瓜干旱癥狀的出現，根據黃瓜植株表現出的萎蔫程度，按照以下分級標準對 各重復分株進行調查統計;〇級:植株生長正常，無萎蔫現象；1級:植株生長基本正常，只有1 片葉表現輕微萎蔫;2級:植株萎蔫加重，2片葉出現萎蔫3級:植株明顯萎蔫，3片葉以上均萎 蔫;葉片萎蔫下垂，恢復困難。
[0020] 將統計結果按以下公式計算抗旱系數:抗旱系數(％) = [1-Σ (各級株數X相應級 數)/(總株數Χ3)] Χ100;斷水3天后，總體中50%植株發生中度萎蔫，以此時各處理抗旱 系數作比較，DR011菌劑處理組的抗旱系數比對照組增加43.90 %。
[0021] 實驗結果:干旱脅迫處理10 d后，DR011菌劑處理組和對照組黃瓜都顯示嚴重的 萎蔫癥狀，但是重新澆水24 h后，DR011菌劑處理組黃瓜能快速恢復，并且經統計存活率 為80.1%，而對照組恢復緩慢，并且存活率只為36.32%;這些結果表明，DR011菌劑能顯著 提高黃瓜的耐旱性，增強干旱脅迫后黃瓜的恢復能力。
[0022]實施例6:溫室試驗測定DR011菌劑提高番茄耐旱性效果 番茄品種為上海903;將番茄種子浸種催芽48h后播種于育盤內，正常管理澆水，15d后 移苗至容積為450cm2的盆缽中，隔天澆25mL自來水;移苗15天后開始處理，設以下2個處理： (1) 根圍菌液處理:每個棵苗澆灌20mL根圍菌液，正常澆水5d之后，斷水進行模擬干旱 處理； (2) 對照組:每棵苗澆灌20mL LB，正常澆水5d后，斷水進行模擬干旱處理； 模擬干旱處理15d后重新澆水，重新澆水24 h后統計存活率;實驗結果:干旱脅迫處理 15 d后，DR011菌劑處理組和對照組番茄都顯示嚴重的萎蔫癥狀，但是重新澆水24 h后， DR011菌劑處理組番茄能快速恢復，并且經統計存活率為90.00%，而對照組恢復緩慢，并且 存活率只為35.33%;這些結果表明，DR011菌劑能顯著提高番茄的耐旱性，增強干旱脅迫后 番茄的恢復能力。
【主權項】
1. 芽孢桿菌菌株DROll，其特征是：它經鑒定屬于芽孢桿菌屬，分類命名為feciDt/s sp .，于2016年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)， 保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為 CGMCC No. 12482〇2. 菌株DROll制備的植物耐旱誘導劑，其特征是該植物耐旱誘導劑的制備方法是:將芽 孢桿菌DROl 1的種子菌液以1:100體積比接種至LB發酵培養液中發酵培養，28-30°C、180-200rpm培養40-48 h;然后5000-6000 rpm離心10-15 min，用滅菌水進行稀釋制成菌劑，菌 劑成品中活菌總濃度為1X10 9~1X10 1(3 CFU/mL。3. 根據權利要求2所述的菌株DROll制備的植物耐旱誘導劑，其特征是所述的保藏號為 CGMCC No. 12482的芽孢桿菌DROll種子菌液制備方法是：將保藏號為CGMCC No. 12482的 芽孢桿菌DROll菌株接種到LB培養液中28°C培養，180 rpm振蕩培養至600 nm處的OD 值為0.8時結束培養。4. 根據權利要求2所述的菌株DROll制備的植物耐旱誘導劑，其特征是所述的保藏號為 CGMCC No. 12482的芽孢桿菌菌株DRO11制備的植物耐旱誘導劑的應用方法是:所述的菌劑 稀釋100~200倍，在干旱10-15天后灌根處理。
【文檔編號】C12R1/07GK105886447SQ201610507771
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年7月1日
【發明人】王云鵬, 王曉莉, 熊清平, 石瑩瑩
【申請人】淮陰工學院