一種降低煙草特有亞硝胺的解淀粉芽胞桿菌da9及其應用
【專利摘要】本發明涉及微生物領域，具體地，本發明涉及一株具有降煙草特有亞硝胺的解淀粉芽孢桿菌。本發明采用的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)DA9已于2014年6月12日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2014252。本發明從白肋煙煙葉表面細菌中篩選到一株能顯著降低煙草特有亞硝胺的解淀粉芽孢桿菌DA9，該菌株的特點為降亞硝酸鹽能力強而降硝酸鹽能力弱，通過液體發酵制備菌液，將菌液運用于白肋煙晾曬和陳化過程中，分別比對照低47.08％和47.57％，具有良好的應用價值。CCTCC NO: M201425220140612
【專利說明】
一種降低煙草特有亞硝胺的解淀粉芽胞桿菌DA9及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及微生物領域，具體是開發一種能高效降解亞硝酸鹽而降解硝酸鹽能力 弱的解淀粉芽胞桿菌，通過液體發酵制備菌液，將菌液應用在煙草晾曬和陳化過程中，降低 煙草特有亞硝胺含量。
【背景技術】
[0002] 煙草特有亞硝胺（以下簡稱TSNA)是一種存在于煙草中的有害物質，主要包括四 種N-亞硝基去甲基煙堿（NNN)、4- (N-甲基-亞硝氨）-1- (3-吡啶基）-1- 丁酮（NNK)、N-亞 硝基新煙草堿（NAT)和N-亞硝基假木賊堿（NAB)。早在1962年，國際上就首次報道了關于 煙草特有亞硝胺（TSNA)的潛在致癌作用，導致人類肺部、口腔、食道、胃、胰臟、肝臟等部位 形成腫瘤。因此，降低煙草TSNA對提高煙草的品質和安全性至關重要，成為近年的研究熱 點。
[0003] 煙草生物堿和亞硝酸鹽是TSNA的前體物質，而煙草生物堿的含量是煙草亞硝酸 鹽的成百上千倍，煙草亞硝酸鹽是TSNA形成的限制性因素。TSNA主要在煙草晾曬，儲存和 發酵過程中形成，微生物的硝酸鹽還原作用對其有重要影響。為了降低TSNA的含量，就要 減少煙草亞硝酸鹽的形成，即阻斷亞硝酸鹽的形成途徑，抑制煙葉上有害微生物的硝酸鹽 還原作用。
[0004] 隨著人們對無公害化生產和消費認識程度的提高，微生物制劑在發展優質、無公 害的煙草產業中發揮了重要作用。目前研究者將能降解硝酸鹽和亞硝酸鹽內生細菌應用于 煙草種植和調制期間，但硝酸鹽的降解會導致亞硝酸鹽的積累，這是一個動態變化的過程， 不能達到專一性降解亞硝酸鹽的目的，導致該過程穩定性不足（參見：汪安云.中國煙草學 報，2007,13 (4) :45-49)。本發明為了在煙草調制和陳化期間降低亞硝酸鹽和煙草特有亞硝 胺含量，篩選了一株降解亞硝酸鹽能力強而降解硝酸鹽能力弱的解淀粉芽胞桿菌DA9,專一 性的降解亞硝酸鹽，將其應用于低害卷煙制品的生產實踐中。
【發明內容】
[0005] 本發明目的是提供一種降解亞硝酸鹽能力強而降解硝酸鹽能力弱的解淀粉芽胞 桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9來降低煙草特有亞硝胺含量，同時提供一種解淀 粉芽胞桿菌菌液的制備方法，并提供用該菌液在煙葉晾曬和陳化過程中降低煙草特有亞硝 胺的應用方法。
[0006] 本發明的目的是這樣實現的：
[0007] 發明人提供了一株解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9,此菌株 能高效降解亞硝酸鹽而降解硝酸鹽能力弱，在煙草環境中有很好的適應生存能力。經過生 理生化鑒定和16S rDNA鑒定，該菌株被鑒定為解淀粉芽胞桿菌，于2014年6月12日保存 于中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址：湖北省武漢市武漢大學，保藏號為CCTCC N0 : M2014252。
[0008] 本發明所提供的解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9分離方 法如下：取新鮮煙葉，煙草根際土壤及陳化煙葉l〇〇g，加入100mL亞硝酸鹽分離培養基 (NaN0 20. 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ040 · 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20.0 g/L，瓊脂 15 ~20g/ L，pH7. 2)中，37°C，180r/min，培養2d。倍比稀釋至10 4, 10 5, 10 6涂于固體亞硝酸鹽分離培 養基（NaN020. 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ04(λ 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. 0g/L，瓊脂 15 ~ 20g/L，pH7. 2)平板上，挑選單菌落劃線接種于LB(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/ L，瓊脂20g/L，pH7. 2~7. 4)斜面上，37°C培養24h，放冰箱保存。通過菌種活化，將菌種接 種于硝酸鹽培養基（ΚΝ030· 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ040· 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. 0g/ L，固體培養基瓊脂15~20g/L，pH7. 2)和亞硝酸鹽分離培養基（NaN020. 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ040 · 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. 0g/L，瓊脂 15 ~20g/L，ρΗ7· 2)中，37°C，180r/ min,培養12h，不接種菌株的為對照。菌液8000r/min離心10min，收集上清液，檢測上清 液中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，選取能夠高效降解亞硝酸鹽而硝酸鹽降解能力弱的菌株。本 發明所提供的菌株，有芽胞形成，革蘭氏染色為陽性。在LB平板上生長24h后，觀察菌落形 態，菌落白色，表面粗糙，呈火山口狀，邊緣形狀不規則。生理生化實驗結果表明，該菌株能 利用多種碳源，不能還原硝酸鹽，能液化明膠，淀粉水解呈陽性，檸檬酸為陽性。將篩選得 到的菌株的16S rDNA進行擴增、純化、測序后，將16S rDNA序列通過Blast序列分析，通 過MEGA4. 0軟件構建降煙草亞硝酸鹽菌株和參考菌株之間的系統發育樹。根據形態特征、 生理生化特性和16S rDNA序列分析方法，將DA9菌株鑒定為解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)〇
[0009] 本發明提供的解淀粉芽胞桿菌菌液制備方法包括以下步驟：
[0010] 1、菌種活化：
[0011] 將保藏的解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9劃線接種到LB (蛋 白胨 l〇g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂 20g/L，pH7. 2 ~7. 4)固體斜面，37°C培養 24h， 得到活化菌種。
[0012] 2、種子液培養：
[0013] 將活化菌株接種于LB液體培養基中（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，瓊 脂 20g/L，ρΗ7· 2 ~L 4)，于 37°C，180r/min 下培養 12h 得種子液。
[0014] 3、發酵培養：
[0015] 將種子液以2% (V/V)的接種量接種于發酵培養基（葡萄糖40g/L，玉米漿8g/L， 氯化銨4g/L，硫酸錳0· 01g/L，磷酸二氫鉀1. 0g/L，硫酸鎂0· 3g/L)，37°C，180r/min，培養 24h，8000r/min 離心 10min，收集菌體。
[0016] 將本發明所提供的解淀粉芽胞桿菌制備濃度為10sCFU/mL的菌液，在20%、30%、 40 %、60 %含水量條件下，將菌液均勻噴灑于煙葉上進行發酵，5d后檢測亞硝酸鹽和TSNA 含量，以確定該菌株在煙葉上降解煙草亞硝酸鹽和TSNA的效果。
[0017] 將本發明所提供的解淀粉芽胞桿菌制成的10sCFU/mL菌液，運用于白肋煙晾曬和 陳化期間。在煙葉晾曬期間，將菌液均勻噴灑到剛采收的新鮮白肋煙煙葉上，30mL/株，按行 業標準晾曬45d ;在煙葉陳化期間，以菌液體積（mL):煙葉質量（g)為10%的比例均勻噴灑 陳化煙葉，放入自封袋中，于37°C、相對濕度為80%條件下陳化2d。
[0018] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0019] (1)解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9降解亞硝酸鹽能力強而 降解硝酸鹽能力弱，從而達到減少煙草特有亞硝胺形成的目的。
[0020] (2)解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9在煙葉表面有很強的生 存能力，能夠在煙草表面微生物群落中占主導地位。
[0021] (3)解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9運用于白肋煙瞭曬和陳 化過程中，能明顯降低亞硝酸鹽和煙草特有亞硝胺各個組分的含量。
【附圖說明】
[0022] 圖1解淀粉芽胞桿菌DA9的亞硝酸鹽降解能力
[0023] 圖2解淀粉芽胞桿菌DA9的硝酸鹽降解能力
[0024] 圖3解淀粉芽胞桿菌DA9的系統發育樹
[0025] 圖4不同含水量發酵煙葉表面菌數
[0026] 圖5不同晾曬時期煙葉亞硝酸鹽含量檢測結果
[0027] 圖6不同晾曬時期煙葉TSNA含量檢測結果
【具體實施方式】
[0028] 以下通過實施例對本發明進行詳細說明。
[0029] 實施例1高效降解亞硝酸鹽而不能降解硝酸鹽的菌株的篩選
[0030] 1、降煙草亞硝酸鹽菌株的分離純化
[0031] 取新鮮煙葉，煙草根際土壤及陳化煙葉100g，加入100mL亞硝酸鹽分離培養基 (NaN0 20. 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ040 · 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20.0 g/L，瓊脂 15 ~20g/ L，pH7. 2)中，37°C，180r/min，培養2d。倍比稀釋至104，105，106涂于固體亞硝酸鹽分離 培養基（NaN0 20 . 5g/L、MgS04 ·7Η20 0· 2g/L、K2HP040 . 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. 0g/L，瓊脂 15 ~ 20g/L，pH7. 2)平板上，37°C培養24h，挑選單菌落劃線接種于LB (蛋白胨10g/L，酵母粉5g/ L，NaCl 10g/L，瓊脂 20g/L，ρΗ7· 2 ~7. 4)斜面上，37°C培養 24h，放 4°C冰箱保存。
[0032] 2、降煙草亞硝酸鹽菌株的篩選
[0033] 挑取分離保存的菌株接種于液體LB (蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，瓊 脂20g/L，pH7.2~7.4)中，37°C，180r/min，培養12h做種子液。將種子液以2% (V/V)的 接種量接種于硝酸鹽培養基（KN030 . 5g/L、MgS04 · 7H20 0. 2g/L、K2HP040 . 5g/L和酒石酸鉀 鈉20. 0g/L，固體培養基瓊脂15~20g/L，pH7. 2)，和亞硝酸鹽分離培養基（NaN020. 5g/L、 MgS04 · 7H20 0· 2g/L、Κ2ΗΡ040· 5g/L 和酒石酸鉀鈉 20. 0g/L，瓊脂 15 ~20g/L，ρΗ7· 2)中， 37°C，180r/min，培養12,不接種菌株的為對照。菌液8000r/min離心10min，收集上清液， 檢測上清液中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，選取能夠高效降解亞硝酸鹽而硝酸鹽降解能力弱的 菌株，結果如圖1、圖2所示，得到效果最佳的菌株為DA9,亞硝酸鹽降解率為30. 36%。DA9 的硝酸鹽降解率最低，為10. 78%，是最符合篩選要求的菌株。
[0034] 3、硝酸鹽檢測（Cataldo et al 1975)
[0035] 預處理：稱取煙樣2. 00g，加 40mL 1 %的醋酸，震蕩60min，過濾，加入5g活性炭， 震蕩30min，過濾，得到無色透明的溶液。
[0036] 硝酸鹽標準曲線的繪制：取適量硝酸鈉于烘箱中80°C烘至恒重后，稱取100mg溶 于lOOmL蒸餾水，分別取OmL、l. 00mL、2. 00mL、3. 00mL、4. 00mL、5. OOmL硝酸鈉標準溶液，轉 移到10mL容量瓶中，用蒸餾水定容。分別取0. 10mL上述硝酸鈉溶液于10mL容量瓶中，加 入0. 40mL5 %水楊酸，室溫下，靜置20min，用8 % NaOH定容，靜置至室溫，在紫外可見分光 光度計上于420nm波長下，以空白（即量取標準溶液OmL)為參比液，測其吸光度（Cataldo et al 1975)〇
[0037] 取0.1〇1^煙液于1〇1^容量瓶，加入0.4〇1^5%水楊酸，室溫下，靜置2〇11^11，用 8 % NaOH定容，靜置至室溫，在紫外可見分光光度計上于420nm波長下，測其吸光度。
[0038] 4、亞硝酸鹽的測定（Donald Nicholas and Nason 1957)。
[0039] 亞硝酸鹽標準曲線的繪制：取適量NaN02于烘箱中80°C烘至恒重后，稱取lOOmg 溶于100mL蒸餾水，稀釋100倍，NaN02濃度為10 μ g/mL，再分別取0mL、0. 20mL、0. 40mL、 0. 60mL、0. 80mL、1. 00mL亞硝酸鈉標準溶液，轉移到10mL容量瓶中，用蒸餾水定容，再分別 取2. 00mL亞硝酸鹽溶液加入4. 00mL 1 %磺胺，再加入4. 00mL 0. 02% α -萘胺，25°C反應 30min，在紫外可見分光光度計上于540nm波長下，以空白（即量取標準溶液OmL)為參比 液，測其吸光度。
[0040] 取2. 00mL煙液，加入4. 00mL 1 %磺胺，再加入4. 00mL 0.02% α-萘胺，25°C反應 30min，在紫外可見分光光度計上于540nm波長下，測其吸光度。
[0041] 5、TSNA的檢測方法
[0042] (1)樣品前處理
[0043] 萬分一只天平準確稱取0. 2500g煙末于100mL錐形瓶中，加入0. 2mL濃度為 5000ng/mL內標溶液及19. 8mL醋酸銨溶液（0. lmol/L)，回旋振蕩器上150r/min震蕩lh后， 取萃取液過0. 22 μ m濾膜后收集至色譜瓶中，利用液質聯用儀進行分析（煙草行業標準）。
[0044] (2)LC_MS 測試條件
[0045] 質譜條件：ESI離子源，氣體溫度：350°C，流量10L/min霧化氣壓力35psi，電噴霧 電壓：4000V，正離子模式。各種化合物質譜參數見表1。
[0046] 表1 TSNAs及其內標采集參數
[0047] Table 1 TSNAs and internal standard acquisition parameters
[0048]
[0049] 液相條件：流動相A :0. 1 %醋酸水溶液，流動相B :0. 1 %醋酸甲醇溶液，流速： 0. 2mL/min，柱溫箱65°C，進樣量：5 μ L。表2為梯度洗脫的條件。
[0050] 表2 UHPLC梯度洗脫條件
[0051] Table 2 UHPLC Gradient elution conditions
[0052]
[0053] 實施例2降煙草亞硝酸鹽菌株DA9的鑒定
[0054] 1、降煙草亞硝酸鹽菌株DA9形態特點
[0055] 菌體形狀為桿狀，生長在LB (蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂20g/ L，pH7. 2~7. 4)固體培養基，菌落白色，表面粗糙，呈火山口狀，邊緣形狀不規則。
[0056] 2、菌株DA9生理生化特點
[0057] 菌株DA9的生理生化特點如表3所示。
[0058] 表3菌株DA9的生理生化特點
[0059]
[0060] 3、菌株DA9的16S rDNA序列鑒定
[0061] 將篩選得到的菌株DA9的16S rDNA進行擴增、純化、測序后，將16S rDNA序列通 過Blast序列分析，結果顯示與Bacillus amyloliquefaciens(LFB112)同源性達到99%, 通過MEGA4. 0軟件構建菌株DA9和參考菌株之間的系統發育樹，如圖3所示。根據形態特 征、生理生化特性和16S rDNA序列分析方法，將DA9菌株鑒定為解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)〇
[0062] 實施例3解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9菌液制備
[0063] 1、菌種活化：
[0064] 將保藏的解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9劃線接種到LB (蛋 白胨 l〇g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂 20g/L，pH7. 2 ~7. 4)固體斜面，37°C培養 24h， 得到活化菌種。
[0065] 2、種子液培養：
[0066] 將活化菌株接種于LB液體培養基中（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，瓊 月旨20g/L，ρΗ7· 2~7· 4)，于37°C，180r/min下培養12h得種子液。
[0067] 3、發酵培養：
[0068] 將種子液以2% (V/V)的接種量接種于發酵培養基（葡萄糖40g/L，玉米漿8g/L， 氯化銨4g/L，硫酸錳0· 01g/L，磷酸二氫鉀1. 0g/L，硫酸鎂0· 3g/L)中，37°C，180r/min，培養 24h，菌液濃度達到109CFU/mL，8000r/min離心，收集菌體，用無菌水配制成10sCFU/mL的菌 液。
[0069] 實施例4解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9在白肋煙上降亞硝 酸鹽和TSNA的應用
[0070] 1、菌液施用方法
[0071] 將無菌水配制成10sCFU/mL菌液，均勻噴灑到陳化的白肋煙上，使煙葉濕度達到 20%、30%、40%和60%，放入自封袋中，于30°C，相對濕度為80%的恒溫恒濕箱中發酵5d， 對照為噴灑與DA9菌液同體積的無菌水。
[0072] 2、取樣方法
[0073] 在發酵5d結束時取樣立即檢測生物量。將煙葉45°C烘干至恒重，檢測亞硝酸鹽和 TSNA四種成分的含量。
[0074] 3、菌數檢測
[0075] 發酵結束后立即取樣，用稀釋涂布法檢測煙葉中總菌數。為了進一步驗證解淀粉 芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9(以下簡稱DA9)在煙葉上的降低亞硝酸鹽和 TSNA的作用效果，在煙葉上噴施DA9后發酵5d。在20%、30%、40%、60%含水量條件下， DA9菌數為7. 84、7. 89、8. 00、8. 06(單位：log CFU/g)，說明在煙葉環境中DA9的生長狀態 良好，能適應煙葉環境。煙葉經過發酵后檢測煙葉上的雜菌數，結果如圖4所示，隨著含水 量的增加，菌數明顯上升，且DA9處理的煙葉雜菌數低于對照，說明DA9具有一定的抑菌作 用。
[0076] 4、亞硝酸鹽檢測
[0077] 亞硝酸鹽檢測結果如表4所示，將數據通過SPSS分析得，在20 %、30 %、40 %、60 % 含水量條件下，DA9處理的煙葉的亞硝酸鹽含量分別低于對照15. 67%、38. 86%、78. 75%、 61. 19%，除了 20%含水量處理組外，其他處理組效果均顯著。
[0078] 表4不同含水量發酵的煙葉亞硝酸鹽含量
[0079]
[0080] 注：結果為各處理的平均值土標準偏差；表中不同字母代表顯著性水平（P < 0· 05) 〇
[0081] 5、TSNA 檢測
[0082] 不同含水量發酵煙葉的TSNA檢測結果如表5所示，在20 %、30 %、40 %、60 %含水 量條件下，DA9處理的煙葉的TSNA含量分別低于對照25. 71 %、55. 70%、18. 26%、66. 49%， 效果顯著。結果說明在發酵過程中，DA9在煙葉環境中占據優勢地位，抑制其他有害菌的 生長和硝酸鹽還原作用，而DA9缺乏降解硝酸鹽的能力，能有效降解亞硝酸鹽，因此能減少 TSNA前體物質亞硝酸鹽的形成，進而減少TSNA的形成，效果明顯，有很好的應用價值。
[0083] 表5不同含水量發酵的白肋煙TSNA含量
[0084]
[0085] 注：結果為各處理的平均值土標準偏差；表中不同字母代表顯著性水平（p < 0. 05)
[0086] 實施例5解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9在白肋煙瞭曬的應 用
[0087] 1、菌液施用方法
[0088] 將菌液以30mL/株的量均勻噴灑于新鮮采收的白肋煙上，菌液濃度為10sCFU/mL， 按照行業標準晾曬45d，對照為噴灑與DA9菌液同體積的無菌水。
[0089] 2、取樣方法
[0090] 分別于變黃期，變褐期，干筋期結束時取樣立即檢測生物量。將煙葉45°C烘干至恒 重，檢測亞硝酸鹽和TSNA四種成分的含量。
[0091] 3、生物量檢測同實施例2(6)
[0092] 晾曬過程中，DA9的菌數為8. 18~8.48(單位：log CFU/g)，其他雜菌數為5. 05~ 5. 97(單位：log CFU/g)，說明DA9在煙葉上的適應能力良好，在煙葉表面微生物群落中占 絕對優勢。
[0093] 4、亞硝酸鹽檢測
[0094] 煙葉亞硝酸鹽含量檢測結果如圖5所示，晾曬過程中亞硝酸鹽含量持續上升，各 個時期DA9處理的煙葉亞硝酸鹽含量均低于對照，晾曬結束時，DA9處理煙葉的亞硝酸鹽含 量與對照相比降低了 32. 13%，差異顯著。
[0095] 5、TSNA 檢測
[0096] 晾曬過程中煙葉TSNA含量檢測結果如圖6所示，TSNA含量呈現先上升后下降的 趨勢，在各個晾曬過程中，DA9處理煙葉的TSNA含量均低于對照，晾曬結束時，DA9處理的煙 葉的TSNA比對照減少了 47. 08%，差異顯著，說明在白肋煙晾曬過程中，DA9是一種很好的 降低TSNA的微生物，具有很好的應用前景。
[0097] 實施例6解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9在白肋煙陳化中的 應用
[0098] 1、菌液施用方法
[0099] 將煙葉用噴霧器使陳化煙葉回潮，使煙葉水分達到16~18%，再以菌液體積 (mL):煙葉質量（g)為10%的比例均勻噴灑煙葉，對照為噴灑與DA9菌液同體積的無菌水， 37°C、相對濕度為80 %的條件下進行陳化。
[0100] 2、取樣方法
[0101] 陳化2d后，立即檢測生物量，將煙葉45°C烘干至恒重，檢測亞硝酸鹽和TSNA四種 成分的含量。
[0102] 3、生物量檢測
[0103] 陳化后煙葉表面DA9的菌數為7. 33 (單位：log CFU/g)，其他雜菌數目為4. 48 (單 位：log CFU/g)，表明DA9在煙葉上數目占絕對優勢。
[0104] 4、亞硝酸鹽檢測
[0105] 檢測煙葉各個成分的結果如表6所示，DA9處理的煙葉亞硝酸鹽含量比對照處理 低10. 46%，效果不顯著。
[0106] 5、TSNA 檢測
[0107] 如表6所示，DA9處理的煙葉TSNA的四個成分NNN、NNK、NAT、NAB和總的TSNA分 別比對照低47.16%、68.47%、45.59%、47.65%和 47.57%，效果顯著（？<0.05)。特別 是對于具有強致癌性的NNK的降解率達到68. 47%，在煙葉陳化過程中，運用DA9降低TSNA 有很明顯的效果，具有較好的潛在應用價值。
[0108] 表6不同陳化處理的煙葉相關成分含量
[0109]
[0110] 注：結果為各處理的平均值土標準偏差；表中不同字母代表顯著性水平（P < 0· 05) 〇
【主權項】
1. 一株能降低煙草特有亞硝胺的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens) DA9,于2014年6月12日保存于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO: M2014252。2. 權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌DA9,其特征在于能高效降解亞硝酸鹽而降解硝 酸鹽能力弱，從而降低煙草特有亞硝胺。3. -種解淀粉芽孢桿菌DA9液體培養方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 菌種活化： 將保藏的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)DA9劃線接種到LB固體斜 面（蛋白胨 l〇g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂 20g/L，ρΗ7· 2 ~L 4)，37°C培養 24h，得 到活化菌種。 (2) 種子培養： 將活化菌株接種于LB三角瓶液體種子培養基中（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl l〇g/L，瓊脂 20g/L，ρΗ7· 2 ~L 4)，于 37°C，180r/min 下培養 12h 得種子液。 (3) 發酵培養： 將種子液以2% (V/V)的接種量接種于發酵培養基，37°C，180r/min，培養24h，菌液濃 度達到I. 2 X 109CFU/mL，8000r/min離心收集菌體。發酵培養基為：葡萄糖30~40g/L，玉 米漿8~10g/L，氯化銨4~8g/L，硫酸錳0. 01~0. 015g/L，磷酸二氫鉀0. 5~1.0g/L，硫 酸鎂 0· 15 ~0· 3g/L，pH 為 7. 0 ~7. 5,115°C滅菌 30min。4. 權利要求3所述的解淀粉芽孢桿菌DA9菌液，其特征在于可用于白肋煙晾曬過程中 降低煙草特有亞硝胺含量。施用的方法為噴灑；施用時間是采收前或采收后噴灑，噴灑一 次；施用菌液濃度為IO 8~IO9CFUAiL ;施用菌液量為30~60mL/株，晾曬處理時間為45~ 55d ;晾曬結束時，噴灑DA9菌液的煙葉TSNA比對照降低了 47. 08%。5. 權利要求3所述的解淀粉芽孢桿菌DA9菌液，其特征在于可用于白肋煙陳化過程中 降低煙草特有亞硝胺含量。菌液濃度為IO8~IO 9CFlVmL ;用噴霧器使陳化煙葉回潮，使煙 葉水分達到16~18%，再以菌液體積（mL):煙葉質量（g)為10%~20%的體積均勻噴灑 煙葉；37°C相對濕度80%陳化，處理時間為2~30d ;利用DA9菌液陳化后的煙葉的TSNA比 對照低了 47. 57%。
【文檔編號】C12N1/20GK105886417SQ201410548352
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年10月14日
【發明人】陳守文, 魏雪團, 陳建剛, 鄧曉霧, 冀志霞, 馬昕, 楊歡
【申請人】湖北大學