一種生產白樺脂酸的釀酒酵母工程菌及其構建方法
【專利摘要】本發明涉及一種釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母工程菌為以釀酒酵母株系WAT11為基礎，基因組中整合了LUP基因表達框和BPLO基因的表達框，所述釀酒酵母工程菌優選被敲除了GAL80基因。本發明還涉及構建所述酵母工程菌的方法，以及使用所述酵母工程菌生產白樺脂酸的方法。通過本發明，可使用釀酒酵母，通過微生物發酵的方式來生產白樺脂酸，操作簡單，產量高，生產周期短，占地小。
【專利說明】
一種生產白樺脂酸的釀酒酵母工程菌及其構建方法
技術領域
[0001] 本發明涉及微生物的遺傳改造，更特別地，涉及一種生產白樺脂酸的釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)工程菌及其構建方法。
【背景技術】
[0002] 白樺脂酸(Betulinic acid，BA)，又稱樺木酸，是一種五環三砲類化合物。五環三 萜類化合物是一類非常重要的植物次生代謝產物，這類化合物通常具有十分廣泛的藥理作 用和生物活性。這類化合物廣泛存在于植物界中，而且包含的類型數目較多，主要的五環三 萜化合物有齊墩果烷型，烏蘇烷型，羽扇豆烷型和木栓烷型幾種類型，而白樺脂酸是羽扇豆 烷型五環類三萜化合物的典型代表。
[0003] 近年來的大量研究表明，白樺脂酸有著顯著的藥理作用和生物活性，主要體現在 抗腫瘤、抗HI V、抗炎、抗菌以及抗瘧疾等方面的作用。白樺脂酸表現出的以上生物活性(特 別是對人類黑色素瘤細胞的選擇性殺傷作用以及抗HIV-1型感染的抑制作用）加上其作用 機制特異以及較高的安全性等特點，使其成為非常具有研究價值的天然產物，具有十分廣 泛的應用開發前景。目前白樺脂酸的主要來源是從白樺樹的樹皮中直接提取與純化，存在 著資源浪費嚴重的問題。通過生物工程的方法，以微生物為生物容器來合成這類化合物具 有廣闊的前景。
[0004] 釀酒酵母是第一個基因組完成測序的真核生物，被作為真核模式生物，其表達調 控機理比較明確并且具有遺傳操作簡單、繁殖速度快、安全可靠等特點，常被用作大規模生 物發酵的真核表達菌株。釀酒酵母菌株WAT11是實驗室常用的釀酒酵母菌株，是在野生型株 系W303中整合了擬南芥還原酶基因 ATR1而來（Urban P，Mignotte C，Kazmaier M，et al.Cloning,yeast expression, and characterization of the coupling of two distantly related Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases with P450CYP73A5[J],Journal of Biological Chemistry,1997,272(31):19176-19186)〇
[0005] 白樺脂酸是通過三萜類共同前體物質2,3_氧化鯊烯烴過羽扇豆醇合酶以及C-28 位單加氧的P450分子的作用生成。WAT11自身能產生三萜類物質合成的前體物質2、3_氧化 鯊烯，而且具有P450分子作用所需的還原酶。因此，發明人期望以WAT11為基礎，通過分子生 物學手段和遺傳工程技術，構建一種生產白樺脂酸釀酒酵母工程菌。
【發明內容】
[0006] 為解決以上技術問題，本發明提供了一種釀酒酵母工程菌，所述釀酒酵母工程菌 為以釀酒酵母株系WAT 11為基礎，基因組中整合了 LUP基因表達框和BPL0基因表達框，其中 所述LUP基因表達框由LUP基因有效連接于第一可誘導啟動子而形成，所述LUP基因的序列 如SEQ ID N0:1所示，所述BPL0基因表達框由BPL0基因有效連接于第二可誘導啟動子而形 成，所述BPL0基因的序列如SEQ ID N0:2所示。這里的有效連接是指基因位于啟動子的下游 并由啟動子控制轉錄。
[0007] 優選地，所述第一可誘導啟動子為GAL1啟動子，序列如SEQ ID NO:3所示。
[0008] 優選地，所述第二可誘導啟動子為GAL10啟動子，序列如SEQ ID N0:4所示。
[0009] 優選地，所述工程菌的GAL80基因被部分或全部敲除，所述GAL80基因的序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0010] 本發明還提供了一種構建釀酒酵母工程菌的構建方法，包括以下步驟：
[0011] 1)將LUP基因順著GAL1啟動子的方向插入到PESC-Trp載體的GAL1啟動子的下游， 使所述LUP基因處于所述GAL1啟動子的控制下，并且將BPL0基因順著GAL10啟動子的方向插 入到所述PESC-Trp載體的GAL10啟動子的下游，使所述BPL0基因處于所述GAL10啟動子的控 制下，從而得到集成了 LUP基因表達框和BPL0基因表達框的質粒PESC-TRP-LUP-BPLO，其中 所述LUP基因的序列如SEQ ID N0:1所示，所述GAL1啟動子的序列如SEQ ID N0:3所示，所述 BPL0基因的序列如SEQ ID N0:2所示，所述GAL10啟動子的序列如SEQ ID N0:4所示；
[0012] 2)通過定點突變的方法將所述質粒PESC-TRP-LUP-BPLO中所述LUP基因中GATATC 中的胞嘧啶突變為胸腺嘧啶；
[0013] 3)用EcoRV酶切步驟2)中得到的突變的質粒PESC-TRP-LUP-BPLO，使其線性化，然 后將所述線性化的質粒PESC-TRP-LUP-BPLO轉入釀酒酵母WAT11中，通過酵母菌體內自動發 生的同源重組使所述LUP基缺失了因表達框和所述BPL0基因表達框整合至所述酵母菌的基 因組中；
[0014] 4)將由以5'至3'方向排列的GAL80基因 5'區序列+loxP-KanMX-loxP+GAL80基因 3' 區序列組成的GAL80基因敲除框轉化至步驟3)中得到的基因組中整合了所述LUP基因表達 框和所述BPL0基因表達框的釀酒酵母中，通過細胞內自動發生的同源重組使所述釀酒酵母 中的GAL80基因的相應位置被所述GAL80基因敲除框替換，所述GAL80基因敲除框的序列如 SEQIDN0:5**;
[0015] 5)將Cre重組酶轉化至步驟4)得到的GAL80基因被敲除的釀酒酵母中，使所述片段 再次發生重組，丟失所述loxP-KanMX-loxP片段，從而得到具有所述LUP基因表達框和所述 BPL0基因表達框并且缺失了所述Gal 80基因編碼框的釀酒酵母工程菌。
[0016] 本發明還提供了一種生產白樺脂酸的方法，包括以下步驟：
[0017] 1)培養上述釀酒酵母工程菌至對數期；
[0018] 2)誘導步驟1)所培養的所述釀酒酵母工程菌；
[0019] 3)從步驟2)中被誘導的所述釀酒酵母工程菌培養物提取白樺脂酸。
[0020]優選地，步驟1)中使用加有葡萄糖的SD-Trp-液體培養基培養所述釀酒酵母工程 菌。
[0021]優選地，步驟2)中使用加有半乳糖的SD-Trp-液體培養基培養所述釀酒酵母工程 菌以誘導所述釀酒酵母工程菌產生白樺脂酸。
[0022]優選地，所述方法包括以下步驟：
[0023] 1)將所述釀酒酵母工程菌接種于加有2%葡萄糖的SD-Trp-液體培養基中，置于30 °C，250rpm/min培養 16小時；
[0024] 2)收集菌體，用無菌水洗滌，重懸于加有2%半乳糖的SD-Trp-培養基中至起始 OD60Q值為0.8，置于30 °C，250rpm/min下誘導培養7天；
[0025] 3)用2M HC1將步驟2)中得到的酵母培養物調至PH2.0，用等體積的乙酸乙酯抽提3 次，合并這3次的乙酸乙酯相，吹干；
[0026] 4)將步驟3)中吹干后用少量乙酸乙酯復溶，轉入2ml離心管，吹干，即得到白樺脂 酸。
【附圖說明】
[0027] 圖 1為質粒 PESC-TRP-LUP-BPLO的圖譜；
[0028] 圖2為酵母整合YIPlac204-LUP-BPL0的圖譜；
[0029 ]圖3為PCR產物的電泳照片，其中泳道1和3分別是以釀酒酵母株系WAT 11 (泳道3)和 WAT 11 -LUP-BPL0 (泳道1)為模板，擴增LUP基因的PCR產物電泳照片，泳道2和4分別是以釀酒 酵母株系WAT 11 (泳道4)和WAT11-LUP-BPL0 (泳道2)為模板，擴增BPL0基因的PCR產物電泳照 片；
[0030] 圖4為PCR產物的電泳照片，該PCR以釀酒酵母株系W80(泳道1)和WAT 11-LUP-BPL0 (泳道2)的基因組為模板，使用引物P7/P10進行；
[0031] 圖5為釀酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0所生產的白樺脂酸的質譜分析圖，其中箭頭 標出的峰為白樺脂酸。
[0032]圖6為顯示使用釀酒酵母株系W80和釀酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0的白樺脂酸產 量的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0033]以下結合實施例對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明， 并非用于限定本發明的范圍。
[0034]實施例1生產白樺脂酸的釀酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0的構建
[0035] 1、酵母整合載體YIPlac204-LUP_BPL0的構建
[0036] 將擬南芥（Arab idops i s tha 1 iana )的LUP基因以及來自白樺木（Be tu 1 a platyphylla)的BPLO基因分別連接在同一 PESC-Trp載體的GAL1以及GAL10啟動子下，得到 質粒PESC-TRP-LUP-BPLO(圖1)。因酶切位點的需要，對LUP基因中的EcoRV酶切位點的一個 堿基進行點突變(將GATATC中的胞嘧啶突變為胸腺嘧啶）。具體方法如下：以質粒PESC-TRP-LUP-BPL0為模板，分別使用兩對引物P1/P4和P2/P3進行第一輪PCR。然后將第一輪的兩組 PCR的產物等量混合作為模板，用引物對P3/P4進行第二輪PCR。將第二輪產物進行瓊脂糖凝 膠電泳回收目的條帶大小的片段，連接至T載進行測序。將測序正確的克隆用PstI以及Xbal 酶切，將包含LUP基因表達盒和BPL0基因表達盒的片段連接至酵母整合載體YIplac204,得 到 YIPlac204-LUP-BPL0(圖 2)。
[0037]所用引物序列分別為：
[0041 ] 2、YIplac204-LUP-BPL0 轉化釀酒酵母 WAT11
[0042] 將YIplac204-LUP-BPL0用EcoRV線性化，經瓊脂糖凝膠電泳回收后，用醋酸鋰轉化 法轉化WAT 11菌株，通過SD-Trp-缺陷型平板篩選轉化子，將平板置于30°C生長，將生長良好 的單克隆接入SD-Trp-缺陷型液體培養基進行擴大培養，提基因組DNA進行PCR鑒定陽性轉 化子。所得的轉化子即為能夠生產白樺脂酸的釀酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0。經PCR鑒定 (圖3)，釀酒酵母株系WAT 11中沒有LUP基因和BPLO基因，而本發明構建的釀酒酵母株系 WAT 11-LUP-BPLO中存在LUP基因和BPLO基因，這兩個基因表達盒成功地整合至基因組中，并 隨基因組的復制而復制。
[0043]實施例2高產白樺脂酸的釀酒酵母株系W80的構建
[0044]實施例1中構建的釀酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0已經能夠生產白樺脂酸，發明人 在此基礎上繼續研究，意外地發現當調控因子GAL 80基因發生突變后，產物白樺脂酸的含 量得到大大提高。根據該發現，發明人對釀酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0進行了進一步的改 進，通過同源重組的方法敲除了釀酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0基因組中的GAL 80基因。具 體方法如下：
[0045] 1.同源敲除片段的構建
[0046] 由口1166質粒化111'〇8〇3奸）為模板，使用引物？5/?6擴增1(??-1^11]\1?(-1(??篩選標記 片段（1724bp)，以釀酒酵母WAT11基因組DNA為模板，使用引物P7/P8擴增GAL80基因的5 '區 片段(393bp)，使用引物P9/P10擴增GAL80基因的3 '區片段(393bp)。
[0047]擴增用到的引物：
[0054] 50μ1 PCR反應體系為：10 X Buffer 5μ1，引物各lyl(lOpmol)，10mM dNTP ΙμL， cDNA模板ΙμL，DNA聚合酶0.5μ1，加入ddH20至終體積50μ1;反應條件為：95 °C預變性3min，95 。(:變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，進行30個循環，最后72°C延伸lOmin。
[0055] 將以上得到的三個片段分別回收純化，并將該三片段的混合物作為模板，使用引 物P5/P10進行擴增，得到由以5'至3'方向排列的GAL80基因的5'區片段+loxP-KanMX-loxP 的篩選標記片段+GAL80基因的3'區片段組成的GAL80基因敲除框。將GAL80基因敲除框插入 到載體PMD-19T的BamHI與EcoRI多克隆位點之間，用得到的質粒轉化大腸桿菌E.coli DH5 α，挑取含該質粒的單克隆，進行測序。提取測序正確的質粒，用內切酶BamHI與EcoRI雙酶 切，回收GAL80基因敲除框片段。
[0056] 2.GAL80基因的敲除
[0057]通過醋酸鋰轉化法，將以上得到的GAL80基因敲除框片段轉化至實施例1得到的釀 酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0中。使轉化產物在包含200mg/L遺傳霉素的SD-Trp-營養缺陷培 養基平板上于30°C下生長以篩選轉化子，將生長良好的單克隆接種于含遺傳霉素的液體培 養基進行擴大培養，提取基因組DNA進行PCR鑒定陽性轉化子。通過醋酸鋰轉化法向陽性轉 化子轉入Cre重組酶，轉化子中自動發生第二次同源重組，丟失loxP-KanMX-loxP表達框。將 發生二次同源重組的轉化子接種于不含抗生素的YPDA培養基繼代進行丟失Cre重組酶。將 丟失loxP-KanMX-loxP表達框和Cre重組酶的轉化子提基因組DNA進行PCR鑒定。使用的鑒定 引物為P7和P10。
[0058] 經PCR鑒定（圖4)，成功構建了正確缺失了 1308bp GAL80基因編碼框的基因工程改 造菌株，命名為W80。
[0059] 實施例3使用本發明的釀酒酵母菌株生產和提取白樺脂酸
[0060] 1.白樺脂酸的生產和提取
[0061 ]將實施例1或2中得到的釀酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0或W80接種于以2%葡萄糖 為碳源的SD-Trp-液體培養基中，置于30°C，250rpm/min培養16小時，然后收集菌體并且用 無菌水洗滌后重懸于以2%半乳糖為碳源的5〇-1'印-培養基中至起始0〇6〇()值為0.8，置于30 °C，250rpm/min進行誘導培養7天。將上述所得酵母培養液進行酸化(2M HC1調PH至2.0)，用 等體積的乙酸乙酯抽提3次。合并3次的乙酸乙酯相，吹干。吹干后用少量乙酸乙酯復溶，轉 入2ml離心管，吹干。由此得到白樺脂酸 [0062] 2.白樺脂酸的鑒定和定量
[0063] 將以上得到的白樺脂酸用50μ1硅烷化試劑BSTFA進行衍生化，80 °C，放置30min。反 應過后待離心管冷卻至室溫，離心，吸上清層轉入干凈無水的內襯管，進行GC-MS檢測。GC-MS檢測采用安捷倫7890GC和5975C質譜檢測器，以及毛細管色譜柱HP-5MS。載氣為氦，流速 1.2ml/min，通過不分流模式進樣ΙμL，溫度為250 °C，升溫程序為80 °C起始，以20 °C/min升至 310°C，保持15min。質譜條件：電離源EI，電子能量70eV，離子源溫度為230°C，全掃描模式和 選擇離子模式，全掃描模式掃描范圍m/z為50-600 AC-MS檢測結果證實這兩個菌株能夠生 產白樺脂酸（圖5)，其產量如圖6所示。結合圖5和圖6可看出，釀酒酵母株系WAT11-LUP-BPL0 和W80都能產生白樺脂酸，并且W80的白樺脂酸產量是前者的2-3倍。
[0064]以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母工程菌為以釀酒酵母株系WATl 1為 基礎，基因組中整合了 LUP基因表達框和BPLO基因表達框，其中所述LUP基因表達框由LUP基 因有效連接于第一可誘導啟動子而形成，所述LUP基因的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述 BPLO基因表達框由BPLO基因有效連接于第二可誘導啟動子而形成，所述BPLO基因的序列如 SEQ ID NO:2所示。2. 根據權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述第一可誘導啟動子為GALl 啟動子，序列如SEQ ID NO:3所示。3. 根據權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述第二可誘導啟動子為 GALlO啟動子，序列如SEQ ID N0:4所示。4. 根據權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述工程菌的GAL80基因被部 分或全部敲除，所述GAL80基因的序列如SEQ ID NO: 16所示。5. -種構建釀酒酵母工程菌的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將LUP基因順著GALl啟動子的方向插入到PESC-Trp載體的GALl啟動子的下游，使所 述LUP基因處于所述GALl啟動子的控制下，并且將BPLO基因順著GALlO啟動子的方向插入到 所述PESC-Trp載體的GALlO啟動子的下游，使所述BPLO基因處于所述GALlO啟動子的控制 下，從而得到集成了 LUP基因表達框和BPLO基因表達框的質粒PESC-TRP-LUP-BPLO，其中所 述LUP基因的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述GALl啟動子的序列如SEQ ID N0:3所示，所述 BPLO基因的序列如SEQ ID N0:2所示，所述GAL10啟動子的序列如SEQ ID N0:4所示； 2) 通過定點突變的方法將所述質粒PESC-TRP-LUP-BPLO中所述LUP基因中GATATC中的 胞嘧啶突變為胸腺嘧啶； 3) 用EcoRV酶切步驟2)中得到的突變的質粒PESC-TRP-LUP-BPLO，使其線性化，然后將 所述線性化的質粒PESC-TRP-LUP-BPLO轉入釀酒酵母WATl 1中，通過酵母菌體內自動發生的 同源重組使所述LUP基因表達框和所述BPLO基因表達框整合至所述酵母菌的基因組中。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟： 4) 將由以5 '至3 '方向排列的GAL80基因5 '區序列+1 〇xP-KanMX-1 〇XP+GAL80基因3 '區序 列組成的GAL80基因敲除框轉化至步驟3)中得到的基因組中整合了所述LUP基因表達框和 所述BPLO基因表達框的釀酒酵母中，通過細胞內自動發生的同源重組使所述釀酒酵母中的 GAL80基因的相應位置被所述GAL80基因敲除框替換，所述GAL80基因敲除框的序列如SEQ ID NO:5所示； 5) 將Cre重組酶轉化至步驟4)得到的GAL80基因被敲除的釀酒酵母中，使所述GALSOS 因敲除框再次發生重組，丟失所述loxP-KanMX-loxP片段，從而得到具有所述LUP基因表達 框和所述BPLO基因表達框并且缺失了所述GAL80基因編碼框的釀酒酵母工程菌。7. -種生產白樺脂酸的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 培養權利要求1-4中任一項所述的釀酒酵母工程菌至對數期； 2) 誘導步驟1)所培養的所述釀酒酵母工程菌； 3) 從步驟2)中被誘導的所述釀酒酵母工程菌培養物提取白樺脂酸。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟1)中使用加有葡萄糖的SD-Trp-液體 培養基培養所述釀酒酵母工程菌。9. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟2)中使用加有半乳糖的SD-Trp-液體 培養基培養所述釀酒酵母工程菌以誘導所述釀酒酵母工程菌產生白樺脂酸。10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將所述釀酒酵母工程菌接種于加有2%葡萄糖的SD-Trp-液體培養基中，置于30°C， 250rpm/min培養至對數期； 2) 收集菌體，用無菌水洗滌，重懸于加有2 %半乳糖的SD-Trp-培養基中至起始OD600值 為0.8，置于30°C，250rpm/min下誘導培養； 3) 用2M HCl將步驟2)中得到的酵母培養物調至PH 2.0,用等體積的乙酸乙酯抽提3次， 合并這3次的乙酸乙酯相，吹干。
【文檔編號】C12N15/81GK105886415SQ201610318425
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月13日
【發明人】陳國平, 陳斌, 章焰生, 周晨
【申請人】湖北仁悅藥業股份有限公司, 中國科學院武漢植物園