一種冬蟲夏草菌的液體發酵培養基的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種冬蟲夏草菌的液體發酵培養基，該培養基除了含有常規培養基中的碳源、氮源、金屬鹽等物質之外，添加磷酸膽堿、磷酸乙醇胺以及膽固醇、脂肪酸等物質作為生長促進劑，可有效促進冬蟲夏草菌形成芽生孢子或菌絲段，經本發明培養基發酵獲得的菌懸液富含芽生孢子或菌絲段生長點，可繼續發酵或作為種子液用于后續液體或固體發酵，有助于冬蟲夏草菌的發酵生產效率提高。
【專利說明】
一種冬蟲夏草菌的液體發酵培養基
技術領域
[0001]本發明涉及一種微生物的培養基，特別是涉及一種冬蟲夏草菌的液體發酵培養基。
【背景技術】
[0002]冬蟲夏草(Oph1cordyceps sinensis)是我國青藏高原的一種特色名貴藥材，分布于青藏高原高海拔區域，其生長范圍局限，產量也極為有限，具有重要的藥用和經濟價值。其性味甘平，具有保肺益腎、止血化痰、已嘮嗽之功效。現代醫學研究過程發現，冬蟲夏草還具有抑制腫瘤、抗癌和顯著提高人體免疫功能等獨特功效。
[0003]作為一種蟲生子囊真菌，冬蟲夏草的生活史包括有性階段和無性階段兩個部分。形態學研究和分子鑒定均證實中國被毛孢(Hirsutella sinensis)是冬蟲夏草的無性型，冬蟲夏草菌專性寄生于棲息在青藏高原高寒草甸土壤中的鉤蝠蛾屬Thitarodes昆蟲的幼蟲內完成有性階段。
[0004]近年來，青藏高原的冬蟲夏草已無法滿足國內外迅猛增長的市場需求，資源面臨枯竭的風險。通過發酵培養冬蟲夏草菌的無性型中國被毛孢菌絲可以作為一種冬蟲夏草的替代物作為保健食品或藥品。目前已公開的冬蟲夏草菌發酵技術存在著發酵效率不高，產物收率低等特點。根據現有公知的微生物液體發酵特點，在培養基中的冬蟲夏草菌的生長點越多，發酵的生長效率就越高。冬蟲夏草菌是一種蟲生真菌，在液體發酵培養基中可形成單細胞的芽生孢子，又稱菌絲段，芽生孢子或菌絲段以酵母狀出芽生殖的方式增殖，可指數級增加冬蟲夏草菌發酵菌懸液中的生長點。冬蟲夏草現有的冬蟲夏草菌發酵技術方案“冬蟲夏草菌的一種仿生學培養方法”(專利號:ZL200510104832.9)中提到，利用機械外力破碎可以增加冬蟲夏草菌的生長點，從而提高發酵的效率，但機械外力的破碎方案往往會損傷大量細胞，且破碎效果有限，需要在發酵裝置中增加破碎裝備，從而增加了潛在的污染源，因此工藝流程繁瑣；另一技術方案“冬蟲夏草菌的固體發酵法”(專利號:ZL200910197957.9)提到液體培養的種子液具有生長點較多的特點，但未提到如何促進發酵培養基中的生長點數量的提高。因此，提供一種能促進冬蟲夏草菌中國被毛孢增加芽生孢子(或稱菌絲段)生長點的培養基配方，將有利于冬蟲夏草發酵產業效率的提高，促進冬蟲夏草資源的可持續利用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種能有效促進冬蟲夏草菌中國被毛孢形成芽生孢子或菌絲段生長點液體發酵培養基配方，該配方為:在常規含有碳源、氮源和微量元素的培養基中，加入磷酸膽堿或磷酸乙醇胺中的一種或兩種，可以有效促進冬蟲夏草菌中國被毛孢形成芽生孢子出芽生殖。
[0006]同時，在上述培養基中加入膽固醇、軟脂酸、油酸、亞油酸可以更有效地促進中國被毛孢形成芽生孢子出芽生殖。其中，軟脂酸、油酸、亞油酸可以由花生油單獨替代或由玉米油與橄欖油的混合油替代。
[0007]在配制冬蟲夏草液體發酵培養基時，在基礎培養基中添加的磷酸膽堿含量為10?30mmol/L，磷酸乙醇胺的含量為12?35mmol/L。加入的膽固醇含量為15?32mmol/L、軟脂酸的含量為I?4mmol/L，油酸的含量2?8mmol/L，亞油酸的含量為2?8mmol/L。其中加入的“軟脂酸、油酸、亞油酸”三種化合物整體可以由I?6g/L的花生油，或I?6g/L體積比為2?10:1?2的玉米油:橄欖油來代替。
[0008]本發明所述的菌株是冬蟲夏草菌的無性型中國被毛孢，可以從新鮮冬蟲夏草常規微生物方法分離獲得或從市售獲得。
[0009]通常地，冬蟲夏草菌的液體發酵培養基中含有15?35g的糖和15?45g的蛋白。其中糖可以由蔗糖、海藻糖或葡萄糖中的一種或多種組成，優化地由質量比為4?6:0?2的海藻糖:葡萄糖組成;所述的蛋白可以由蛋白胨、水解乳蛋白、酵母提取物、牛肉膏等常規蛋白氮源中的一種或多種組成，優化地由蛋白胨或水解乳蛋白:酵母提取物質量體積比為I?3:1?2組成。通常地，培養基中含有Ig/L的磷酸二氫鉀和0.5g/L的硫酸鎂，調節pH值為6.5?I。
[0010]在本發明的培養基中接種中國被毛孢菌種，在15?18°C的環境中搖瓶或發酵罐中通氣培養15?30天，既得富含芽生孢子及菌絲段的菌懸液。菌懸液可以在原培養基中繼續發酵或作為發酵種子液用于后續液體或固體培養基發酵。
【附圖說明】
圖1是本發明培養基所制備的冬蟲夏草菌中國被毛孢芽生孢子的低倍鏡檢圖；
圖2是本發明培養基所制備的冬蟲夏草菌中國被毛孢芽生孢子出芽生殖的鏡檢高倍圖。
【具體實施方式】
[0011]實施例一
[0012]陰性對照液體發酵培養基由10g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，15g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加18mmol/L的磷酸膽堿。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床15°C培養20天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為
1.2-1.5X 13個/mL，而陰性對照培養基中只有0.3-0.5 X 13個/mL。
[0013]實施例二
[0014]陰性對照液體發酵培養基由20g/L海藻糖，0.5g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加25mmol/L的磷酸乙醇胺。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床18°C培養15天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為
1.3-1.4X 13個/mL，而陰性對照培養基中只有0.2?0.4 X 103f/mL。
[0015]實施例三
[0016]陰性對照液體發酵培養基由25g/L海藻糖，10g/L葡萄糖，35g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加lOmmol/L的磷酸膽堿和35mmol/L的磷酸乙醇胺。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床16°C培養30天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為2.8-3.0X 13個/mL，而陰性對照培養基中只有0.7-0.8X 13個/mL。
[0017]實施例四
[0018]陰性對照液體發酵培養基由15g//L蔗糖，25g/L蛋白胨，0.5g//L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成；本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加30mmol/L的磷酸膽堿和12mmo 1/L的磷酸乙醇胺。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床18°C培養15天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為1.2-1.4 X13個/mL，而陰性對照培養基中只有0.1-0.2 X 103f/mL。
[0019]實施例五
[0020]陰性對照液體發酵培養基由10g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加101111]101凡的磷酸膽堿，121]11]101凡的磷酸乙醇胺，151111]101凡的膽固醇，11]11]101凡的軟脂酸，2mmol/L的油酸和2mmol/L的亞油酸。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床17°C培養20天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為3.2-3.8 X 13個/mL，而陰性對照培養基中只有0.5-0.7 X 13個/mL。
[0021 ]實施例六
[0022]陰性對照液體發酵培養基由30g//L海藻糖，5g/L葡萄糖，30g//L蛋白胨、15g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加32mmol/L的磷酸膽堿，35mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的膽固醇，4mmol/L的軟脂酸，8mmol/L的油酸和8mmol/L的亞油酸。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床16°C培養30天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為6.8-7.2 X 13個/mL，而陰性對照培養基中只有0.6-0.8 X 13個/mL。
[0023]實施例七
[0024]陰性對照液體發酵培養基由25g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加22mmol/L的磷酸膽堿，20mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的膽固醇，2mmol/L的軟脂酸，4mmo I /L的油酸和4mmo 1/L的亞油酸。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床17.5 V培養30天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為8.2-9.3X 13個/mL，而陰性對照培養基中只有0.8-1.0X 10^/mL。
[0025]實施例八
[0026]陰性對照液體發酵培養基由10g/L海藻糖，5g葡萄糖，10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加10mmol/L的磷酸膽堿，12mmol/L的磷酸乙醇胺，15mmol/L的膽固醇，lg/L花生油。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床17°C培養30天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為2.8-3.2 X 1MVmL，而陰性對照培養基中只有0.5-0.7 X 13個/mL。
[0027]實施例九
[0028]陰性對照液體發酵培養基由30g//L海藻糖，5g/L葡萄糖，30g//L蛋白胨、15g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加32mmol/L的磷酸膽堿，35mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的膽固醇，6g/L的花生油。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床16°C培養30天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為4.8-5.0X 1MVmL，而陰性對照培養基中只有0.8-1.0X 13個/mL。
[0029]實施例十
[0030]陰性對照液體發酵培養基由25g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加22mmol/L的磷酸膽堿，20mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的膽固醇，2.5g/L的花生油。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床17°C培養30天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為6.2-6.5 X 1MVmL，而陰性對照培養基中只有0.6-0.8X103個/mL。
[0031]實施例^^一
[0032]陰性對照液體發酵培養基由10g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加10mmol/L的磷酸膽堿，12mmol/L的磷酸乙醇胺，15mmol/L的膽固醇，0.5g/L玉米油和
0.5g/L的橄欖油。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床17°C培養30天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為3.0-3.3 X 13個/mL，而陰性對照培養基中只有0.5-0.7 X 13個/mL。
[0033]實施例十二
[0034]陰性對照液體發酵培養基由30g//L海藻糖，5g/L葡萄糖，30g//L蛋白胨、15g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加32mmol/L的磷酸膽堿，35mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的膽固醇，5.45g/L玉米油和0.545g/L的橄欖油。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床15°C培養30天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為4.6-4.9X13個/mL，而陰性對照培養基中只有0.8-1.0 X 13個/mL。
[0035]實施例十三
[0036]陰性對照液體發酵培養基由25g/L海藻糖，5g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物，0.5g/L硫酸鎂和lg/L磷酸二氫鉀組成;本發明的液體發酵培養基在上述配方的基礎上添加22mmol/L的磷酸膽堿，20mmol/L的磷酸乙醇胺，32mmol/L的膽固醇，2g/L玉米油和
0.66g/L的橄欖油。分別在兩組培養基中接種冬蟲夏草菌種(中國被毛孢)，120rpm搖床15°C培養30天后，取出發酵液鏡檢，用細胞計數法進行統計，鏡檢可見液體培養液中的芽生孢子(或稱菌絲段)，統計結果本發明的液體發酵培養基中的芽生孢子濃度為6.1-6.3 X 13個/mL，而陰性對照培養基中只有0.6-0.8 X 13個/mL。
【主權項】
1.一種冬蟲夏草菌的液體發酵培養基，其特征在于培養基含有磷酸膽堿、磷酸乙醇胺中的一種或兩種。2.如權利要求1所述的液體發酵培養基，其特征是培養基中還含有膽固醇、軟脂酸、油酸和亞油酸。3.如權利要求2所述的液體發酵培養基，其特征是所述的“軟脂酸、油酸和亞油酸”三種化合物整體由花生油單獨替代，或由玉米油與橄欖油的混合油替代。4.如權利要求1或2或3所述的液體發酵培養基，其特征是所述的磷酸膽堿含量為10?30mmol/L，磷酸乙醇胺的含量為12?35mmol/L。5.如權利要求2所述的液體發酵培養基，其特征是所述的膽固醇含量為15?32mmol/L，軟脂酸的含量為I?4mmol/L，油酸的含量為2?8mmol/L，亞油酸的含量為2?8mmol/L。6.如權利要求3所述的液體發酵培養基，其特征是所述的花生油的含量為I?6g/L，所述的玉米油與橄欖油的混合油的含量為I?6g/L，混合油中的玉米油:橄欖油的體積比為2?10:1?2ο7.如權利要求1或2或3或5或6所述的液體發酵培養基，其特征是培養基中還含有15?35g/L的質量比為4?6:0?2的海藻糖:葡萄糖和15?45g/L的蛋白胨或水解乳蛋白:酵母提取物質量比為I?3:1?2。
【文檔編號】C12R1/645GK105886412SQ201610329007
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月12日
【發明人】鐘欣, 劉昕, 張古忍, 沈冬秀, 闞緒甜, 李少松, 王海貞, 古勵
【申請人】中山大學