一種再生蠶絲蛋白膜的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種再生蠶絲蛋白膜的制備方法。該方法是將泰蠶繭剪碎后放入碳酸氫鈉溶液中進行脫膠處理，再將脫膠后的泰蠶絲進行水洗、烘干；將脫膠干燥后的泰絲放入氯化鈣?甲酸溶液中，泰絲可以被快速溶解形成絲素蛋白溶液；將過濾后的絲素蛋白溶液進行干燥處理，便可得到再生蠶絲蛋白膜。本發明方法可避免傳統方法制膜的繁瑣過程；降低生產后所形成有機廢水處理的難度，朝著環境友好型方向發展；通過調節氯化鈣的濃度，可制得光滑、難溶于水和熱穩定性高的蠶絲膜。這種再生蠶絲蛋白膜不僅具有良好的生物相容性，還可以擁有不同透明度、光滑平整度和水溶性以及熱穩定性，根據其產品所需的性能靈活調控，可以更好的應用于化工、醫藥和食品行業。
【專利說明】
一種再生蠶絲蛋白膜的制備方法
技術領域
[0001 ]本發明屬于高分子領域，涉及一種再生蠶絲蛋白膜的加工處理方法，尤其是在蠶絲蛋白膜制作方法上，展示出了簡單高效的特點，同時該方法可以調控膜的結構與熱穩定性。本發明可為蠶絲蛋白在化工、醫藥、食品等領域的研究與應用提供了一定的實驗和理論依據。
【背景技術】
[0002]蠶絲蛋白，又名絲素蛋白，是由蠶繭脫膠提取而得的纖維蛋白質，它是由18種氨基酸組成，主要是甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸，這些都與人體皮膚的角質蛋白中的氨基酸很接近。此外，這18種氨基酸中含有8種人體所必需的氨基酸。蠶絲蛋白具有良好的生物特性，如無毒、無刺激性，生物相容性，最小的炎性反應，促進傷口愈合的能力等。蠶絲蛋白這些獨特的生物特性，正不斷激發專家學者們的研究興趣。為此，近年來國內外學者對蠶絲的研究熱度是在逐年攀升。
[0003]泰國家蠶絲，顧名思義，它也是家蠶絲的一種，產自于泰國Nakornratchasima皇后養蠶中心。其顏色呈黃色，玻璃化轉變溫度較低，有較好的韌性([J] Journal of ThermalAnalysis and Calorimetry.2015,122(3): 1069-1076)，現如今泰絲雖主要是用來做高檔服飾，但隨著對蠶絲生物特性研究熱度的攀升，近些年已有部分專家學者將泰絲與明膠共混制作骨支架，并將其應用于臨床醫療上。本項發明我們選用泰絲做研究，期待可以為泰絲在該領域的研究提供一定的幫助。
[0004]蠶絲蛋白在稀溶液中主要以無規則線團結構為主，但在一定的外界條件下(溫度、濃度、PH值、金屬離子和溶劑等)可以使蠶絲蛋白的主要兩種結構發生相互轉變，從而改變蠶絲的化學穩定性和力學性能，其中絲蛋白的主要兩種結構分別為:silkl結構(無規線團和α-螺旋結構)，si IkII結構(β-折疊結構)。對于蠶絲蛋白溶液，我們可以制成薄膜、凝膠和海綿狀等各種形狀，作為傷口敷料、生物傳感器和藥物控釋載體等材料，在生物醫藥領域有巨大的應用前景。
[0005]關于金屬離子(鈣離子)對絲素結構的影響，根據文獻([J]光譜法研究鈣離子對絲素蛋白溶解過程中結構的影響.2014,33(12):1410-1415和[J]氯化鈣對尼龍6無定型轉變過程的在位紅外研究.2004.24(3): 295-298)總結得出:氯化鈣在蠶絲蛋白溶液中，一方面鈣離子與絲素蛋白分子鏈上的酪氨酸和絲氨酸的側鏈羥基發生配位螯合作用，破壞了絲素蛋白分子鏈上的氫鍵;另一方面鈣離子對羰基具有強的誘導作用，有利于共振式的碳氮雙鍵結構的形成。因此改變了絲素蛋白的構象，進而可能改變其熱穩定性。依據此原理，我們可以制備出結構與熱穩定性可控的蠶絲膜。
[0006]在傳統的制備蠶絲膜過程中:絲素需要在沸騰的氯化鈣溶液中才能快速溶解形成再生絲素蛋白溶液([J]蠶絲不同溶解方法的研究.2011，52( 11): 665-668.)，而且這種方法會使絲素蛋白的活性幾乎全部喪失；用氯化鈣\乙醇\水三元溶液或者溴化鋰溶液來溶解絲素(CN 104448844A)，發現其溶解過程是很緩慢的；另外，絲素蛋白溶液的透析不但是一個緩慢的過程，而且還是一個浪費水資源的過程。例如:中國發明專利“絲素蛋白水凝膠的制備方法”(CN 104045841A)中濾液需經過自來水透析8-10小時，再用蒸餾水透析8-10小時；中國發明專利“一種難溶于水的柔韌絲素膜的制備方法” (CN 104448844A)需要將絲素蛋白溶液透析3天，期間每隔2小時換一次去離子水。
[0007]以上制備膜或水凝膠的方法不僅耗時還浪費資源，還不適合工業化生產。因此，需尋找一種簡單高效，環境友好的方法來解決膜制作過程中的繁瑣及浪費資源問題。
【發明內容】
[0008]本發明針對目前已有的絲素蛋白膜制備方法中需經過二次處理才制得難溶于水或者其他特性的絲素膜，以及操作步驟多，使用有機溶劑多，部分生物特性會被破壞，環境不友好等缺陷，做了簡化和改進處理。本申請將提供一種再生蠶絲蛋白膜及其制備方法。該方法簡單高效，方便靈活;根據氯化鈣濃度的高低，可以靈活地調控絲素膜的形態、結構和絲素膜水溶性、熱穩定性。
[0009]在本發明的實施例中，所用的材料為泰蠶絲。泰蠶絲是家蠶絲的一種，屬于天然的高分子材料，具有良好的生物相容性、生物降解性。現逐漸為人們所關注，大多是源于蠶絲所含的氨基酸與人體內的相同及獨特的晶型結構，有著良好的理化性能。現在蠶絲的應用領域正積極向食品、化工和生物醫學等領域延伸，如用蠶絲蛋白來制造藥物緩釋劑、生物傳感器、角膜及傷口敷料等。本發明可為天然高分子材料在食品、化工和生物醫學等領域提供新方法和途徑，為泰國蠶絲產品的研發和應用打下基礎。
[0010]本發明所采用的技術方案是:
[0011 ] —種再生蠶絲蛋白膜的制備方法，包括以下步驟:
[0012](I)將剪碎的泰蠶繭放置在濃度為0.21wt%的碳酸氫鈉沸水溶液中進行30-60min的脫膠處理，再用去離子水洗滌2-3次;最后將洗好的脫膠泰蠶絲自然風干；
[0013](2)將步驟(I)中風干好的脫膠泰蠶絲放入氯化鈣-甲酸溶液，在室溫下即可被快速溶解，形成蠶絲蛋白溶液；
[0014](3)將步驟(2)中的蠶絲蛋白溶液用微孔濾膜過濾，再將濾液澆鑄在聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具上，烘干，從而制得泰蠶絲蛋白膜。
[0015]所述步驟(2)中脫膠泰蠶絲與氯化鈣-甲酸溶液中的溶解比例范圍是1.0Og:100.0Og-1.00g:6.00g。
[0016]所述步驟(2)中氯化鈣最高濃度可達到35wt%。當氯化鈣溶液濃度小于2.0wt%時，再生蠶絲蛋白膜中蠶絲蛋白分子的構象主要是Silkn結構(β-折疊結構)，其宏觀現象表現為膜難溶于水；當氯化鈣濃度大于等于2.0?〖％時，蠶絲蛋白的構象主要是SilkI結構(無規線團和螺旋結構)，膜表現出易溶于水的特性。同時還發現:隨著氯化鈣濃度的增大，再生絲素蛋白膜表面變的更加平整光滑，膜的熱穩定性也在逐漸增大。
[0017]所述步驟(3)中微孔濾膜為孔徑0.45-2.ΟΟμπι。
[0018]所述步驟(3)中干燥溫度控制在35-70°C范圍內，干燥時間為3-24小時。
[0019]作為上述技術方案的優選，步驟(I)中脫膠處理的工藝條件:碳酸氫鈉的濃度為
0.21wt%，蠶苗與碳酸氫鈉的浴比1.0Og:400ml，脫膠30min。
[0020]作為上述技術方案的優選，步驟(2)中將脫膠后的泰蠶絲素按0.17g泰蠶絲素:1.90g氯化鈣溶液的比例加入到氯化鈣溶液中溶解，得到8.2wt %的泰絲蛋白溶液。
[0021]作為上述技術方案的優選，步驟(3)中泰蠶絲蛋白溶液用孔徑0.45μπι的聚四氟乙烯(PTFE)濾膜過濾，將濾液澆鑄在PDMS上，再將其放置在45 V烘箱內干燥5小時。
[0022]本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果:本發明通過高純度的甲酸為溶劑(88 %的分析純度、98 %的色譜純度、85 %、90 %或95 %工業級純度)，以氯化鈣(96 %的分析純度)為溶質配置成氯化鈣-甲酸溶液。在常溫下使用該溶液便可快速溶解泰絲素，其操作過程簡單方便，生產成本低，生產周期短；降低了生產后所形成的有機廢水處理的難度，朝著環境友好方向發展。此外，還可以通過氯化鈣的含量來調控再生蠶絲膜的形貌、結構、水溶性和熱穩定性，以滿足不同領域對材料性能的需求。
[0023]本發明制備的膜可作為面膜、傷口敷料、眼角膜、支架材料和食品包裝等材料分別應用于化工、醫藥、食品等不同領域。
【附圖說明】
[0024]圖1不同氯化鈣濃度下制備的泰蠶絲蛋白膜的電鏡圖(圖中Α、Β和C分別對應實施例1、實施例2和實施例3中的制備的蠶絲蛋白膜)。
[0025]圖2不同氯化鈣濃度下制備的泰蠶絲蛋白膜的紅外吸收光譜(圖中Α、Β和C分別對應實施例1、實施例2和實施例3中的制備的蠶絲蛋白膜)。
[0026]圖3不同氯化鈣濃度下制備的泰蠶絲蛋白膜的熱重分析圖譜(圖中Α、Β和C分別對應實施例1、實施例2和實施例3中的制備的蠶絲蛋白膜)。
【具體實施方式】
[0027]實施例1:
[0028]稱取5.0Og剪碎的泰蠶絲繭殼，放入到2000ml濃度為0.21wt%的碳酸氫鈉沸水溶液中進行30min的脫膠處理。再用去離子水反復洗滌2-3次后，移至通風處自然風干，便可得到脫膠泰蠶絲。
[0029]配置濃度為1.5wt%的氯化鈣-甲酸溶液并稱取該溶液1.90g，將其放置在規格2ml離心管中，再將0.17g脫膠泰蠶絲放置溶液中進行溶解，發現泰蠶絲2分鐘就可以被溶解完全，便可得到泰蠶絲蛋白溶液。
[0030]用孔徑為0.45μπι的PTFE微孔濾膜過濾泰絲蛋白溶液，將濾液澆鑄在PDMS上，再將其放置在45°C烘箱內干燥5小時便可制得泰蠶絲蛋白膜。
[0031]實施例2:
[0032]稱取5.0Og剪碎的泰蠶絲繭殼，放入到2000ml濃度為0.21wt%的碳酸氫鈉沸水溶液中進行30min的脫膠。再用去離子水反復洗滌2-3次后，移至通風處自然風干，便可得到脫膠泰蠶絲。
[0033]配置濃度為2.0wt%的氯化鈣-甲酸溶液并稱取1.90g，將其放在規格2ml離心管中，再將0.17g脫膠后的泰蠶絲放置溶液中進行溶解，發現泰蠶絲Imin就可以被溶解完全，便可得到泰蠶絲蛋白溶液。
[0034]用孔徑為0.45μπι的PTFE微孔濾膜過濾泰蠶絲蛋白溶液，將濾液澆鑄在PDMS上，再將放置在45°C烘箱內干燥5小時便可制得泰蠶絲蛋白膜。
[0035]實施例3:
[0036]稱取5.0Og剪碎的泰蠶絲繭殼，放入到濃度為0.21wt %的碳酸氫鈉沸水溶液中進行30min的脫膠。再用去離子水反復洗滌2-3次后，移至通風處自然風干，便可得到脫膠泰蠶絲。
[0037]配置濃度為6.0wt %的氯化鈣-甲酸溶液并稱取該溶液1.90g，將其放置在規格2ml離心管中，再將0.17g脫膠后的泰蠶絲放置溶液中進行溶解，發現泰蠶絲30s就可以被溶解完全，便可得到泰蠶絲蛋白溶液。
[0038]用孔徑為0.45μπι的PTFE微孔濾膜過濾泰絲蛋白溶液，將濾液澆鑄在PDMS上，再將其放置在45°C烘箱內干燥5小時便可制得泰蠶絲蛋白膜。
[0039](I)蠶絲蛋白膜表面形貌結構的比較
[0040]圖1為上述實施例中泰蠶絲蛋白膜的電鏡圖，圖1A是在1.5wt%的氯化鈣濃度下制得的泰蠶絲蛋白膜，可以看到有絲素纖維結構；當氯化鈣濃度達到2.0wt% (圖1B)時，膜表面纖維結構膨潤到一定程度后出現了溶解現象；圖1C是6.0wt%濃度下制得的蠶絲蛋白膜表面纖維溶解更完全。由此推出:隨著溶液中氯化鈣含量的增加，蠶絲蛋白膜表面的纖維結構逐漸逐漸膨潤，膜表面逐漸變得均勻和平整。
[0041](2)蠶絲蛋白膜的分子結構的比較
[0042]圖2是1800cm—?ΗδΟαιΓ1范圍內泰蠶絲蛋白膜的傅里葉變換紅外曲線。圖2中曲線A是氯化I丐濃度為1.5*1:%制作的蠶絲蛋白膜的紅外特征峰分別出現在1623cm—1和1516cm一、表明蠶絲蛋白結構在此波數下主要是silkn結構(β-折疊結構)，在水中表現出難溶于水的性質；當溶液中氯化鈣濃度達到2.0wt% (圖2中的曲線B)時，酰胺I區出現兩個弱吸收峰，分別在1623cm—1和1645cm—S酰胺Π區出現兩個吸收峰，分別在1516cm—1和1535cm—S然而在1645cm—1和1535cm—1是si IkI結構(無規線團和α-螺旋結構)為主;可以看出2.0wt %濃度下制備的蠶絲蛋白膜的分子結構是同時含有β-折疊結構、α-螺旋結構和無規線團結構。說明2.0wt%氯化I丐是蠶絲蛋白的結構由silkn向silkl轉變的過渡濃度。當溶液的濃度達到
6.0wt % (圖2中曲線C)時，蠶絲蛋白膜的分子構象以si Ikl結構(α-螺旋結構和無規線團結構)為主，宏觀現象表現為膜會極易溶于水的特性。
[0043 ] (3)蠶絲蛋白膜的熱穩定性的比較
[0044]圖3中曲線Α、Β和C分別對應于上述實施例1，實施例2和實施例3的泰蠶絲蛋白膜的熱重分析譜圖，從圖3看出由曲線A的起始分解溫度Tcinset為272°C ;曲線B的T_et達到283°C ；對于曲線C可達297°C，通過比較得出蠶絲蛋白膜的起始分解溫度隨著溶液中氯化鈣濃度的增大而增大，且殘余量也是在增加的，進一步說明蠶絲膜的熱穩定是隨著氯化鈣的濃度增大而增大的。
[0045]由此可見，本發明是可以獲得結構與性能可控的蠶絲膜，且制做過程簡單方便，無毒，環境友好。
【主權項】
1.一種再生蠶絲蛋白膜的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將剪碎的泰蠶繭放置在濃度為0.21wt%的碳酸氫鈉沸水溶液中進行30-60min的脫膠處理，再用去離子水洗滌2-3次;最后將洗好的脫膠泰蠶絲自然風干； (2)將步驟(I)中風干好的脫膠泰蠶絲放入氯化鈣-甲酸溶液，在室溫下即可被快速溶解，形成蠶絲蛋白溶液； (3)將步驟(2)中的蠶絲蛋白溶液用微孔濾膜過濾，再將濾液澆鑄在聚二甲基硅氧烷模具上，烘干。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中的脫膠處理，泰蠶繭與碳酸氫鈉沸水溶液浴比為1.0Og: 400ml。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中的氯化鈣-甲酸溶液，以氯化鈣為溶質，甲酸為溶劑，所配置的氯化鈣-甲酸溶液濃度不超過35wt%。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，氯化鈣的純度為96%，甲酸的純度是:88%的分析純、98 %的色譜純、85 %、90 %或95 %工業級純度。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中的微孔濾膜的孔徑0.45-2.00μmD6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中將脫膠后的泰蠶絲素，按0.17g泰蠶絲素:1.90g氯化鈣溶液的比例加入到氯化鈣溶液中進行溶解，得到8.2wt%的泰絲蛋白溶液;步驟(3)中泰蠶絲蛋白溶液用孔徑0.45μπι的聚四氟乙烯濾膜過濾，將濾液澆鑄在聚二甲基硅氧烷模具上，再將其放置在45 °C烘箱內干燥5小時。7.根據權利要求1所述的一種再生蠶絲蛋白膜的制備方法，其特征在于:利用氯化鈣濃度來調節膜中絲素蛋白的結構，以及膜表面的形貌和熱穩定性。8.根據權利要求7所述的一種再生蠶絲蛋白膜的制備方法，其特征在于:當氯化鈣溶液濃度小于2.0wt %時，再生蠶絲蛋白膜中蠶絲蛋白分子的構象主要是SiIk Π結構，其宏觀現象表現為膜難溶于水；當氯化鈣濃度大于等于2.0?〖％時，蠶絲蛋白的構象主要是SilkI結構，膜表現為易溶于水的特性。
【文檔編號】C08J5/18GK105885070SQ201610289639
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月4日
【發明人】王昉, 于海洋, 顧正桂
【申請人】南京師范大學