一種基于金納米粒子的人工抗體構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種全新的基于金納米粒子通用的人工抗體構建方法。該方法是在金納米粒子表面重建抗體決定簇互補區的多肽環區，重建天然抗體與抗原的特異性識別，并制備出比天然抗體穩定性更好、結合力更強的人工抗體。通過將選定的本身沒有特定構象和功能的多肽與金納米溶液混合，多肽兩端同時固定到金納米粒子表面，并且通過調節多肽在金納米粒子表面的密度及金納米粒子的粒徑進而調節多肽兩端在納米粒子表面的跨度實現對多肽環區構象的精確控制，從而賦予合成的功能化納米粒子與抗原特異性識別的功能。該方法在納米載藥、靶向治療及抗體藥物等領域中具有廣闊的應用前景。
【專利說明】
一種基于金納米粒子的人工抗體構建方法
技術領域
[0001]本發明屬于納米醫學領域，具體涉及一種基于金納米粒子表面重建天然蛋白質抗體的決定簇互補區的方法，從而構建出能夠同抗原特異性識別、且比天然抗體結合力更強、穩定性更好的人工抗體。
【背景技術】
[0002]抗體作為機體應答的效應分子，能夠識別、中和或清除誘發疾病的抗原。另外針對相應的抗原，抗體具有高特異性和強結合力的特征，使得抗體在疾病治療和診斷的應用中表現出其他藥物無可比擬的優勢。但是抗體的結構復雜，價格昂貴，穩定性差的缺點阻礙了抗體在醫學領域的廣泛應用。針對這些問題，開發人工抗體成為一個重要前沿研究方向。
[0003]由于納米粒子具有粒徑小、比表面積大、分散性良好等優異潛質，納米粒子的功能化在生物醫學方面具有廣泛的應用前景。金納米粒子作為一種特殊的納米顆粒，不僅具備普通納米顆粒的性質特征，還具有良好的生物相容性、穩定的化學性質、獨特的光學特性等優勢，并且易于表面修飾、合成方法簡單可控，使其在生物分子的診斷和檢測、生物醫學成像以及治療方面得到非常廣泛的研究。
[0004]我們開發了一種在金納米粒子表面重建抗體決定簇互補區的方法，我們通過調節金納米粒子表面的多肽環區的構象實現對人工抗體活性的精確調控，構建出具有天然抗體功能的人工抗體。本發明方法可用于制備針對不同抗原的人工抗體和抗體藥物，在生物醫學方面具有廣泛的應用價值。
【發明內容】
[0005]當前，基于納米粒子表面功能化賦予納米粒子生物功能的研究越來越廣泛，但是實現這些功能最常用的方法就是簡單地將功能基團通過共價鍵、吸附等方式修飾到納米粒子上，如抗體、核酸適配體及葉酸等功能基團。這種方法的局限在于用于修飾納米粒子的功能基團本身必須也具有功能，修飾到納米粒子表面后依靠多價性提高功能基團的作用。這些研究都不能對功能基團的構象進行調控，也沒有實現對功能化納米粒子活性的調控。
[0006]本發明的目的是在金納米粒子表面重構天然抗體決定簇互補區的多肽環區，構建出具有與天然抗體相同的特異性，并具有更強結合能力和更高穩定性的人工抗體。單獨的來源于天然抗體決定簇互補區的多肽環區本身并沒有結構和功能，我們通過調節多肽環區兩端在金納米粒子表面的跨度，實現了對多肽環區在納米粒子表面構象的調控，從而實現對人工抗體活性的精確調控。
[0007]該方法的具體思路如下:
首先從天然抗體的決定簇互補區選取多肽環區，然后在多肽環區的兩端添加半胱氨酸，然后通過S-Au共價鍵嫁接到金納米粒子上，通過調控多肽環區兩端在金納米粒子表面的跨度實現對多肽環區構象的調控，進而實現對人工抗體活性的精確調控，制備出具有同天然抗體相同的特異性，并具有更強結合能力和更高穩定性的人工抗體，原理如圖1所示。
[0008]—種的基于金納米粒子的人工抗體構建方法，該方法是將天然蛋白質抗體的決定簇互補區的CDR多肽環區嫁接到金納米粒子表面，從而重建天然抗體與抗原的特異性識別，并制備出比天然抗體穩定性更好、結合力更強的人工抗體。該方法的主要特征包括:通過將設計的多肽兩端同時固定到金納米粒子表面，并且利用金納米粒子表面上金原子的可移動特性，通過調節多肽兩端在納米粒子表面的跨度實現對多肽環區構象的精確控制，從而賦予納米粒子與抗原之間誘導切合的特異性識別功能。
[0009]CDR多肽按如下設計:從天然抗體CDR區選取與抗體特異性結合的關鍵多肽環區序列，并且在序列兩端各添加一個半胱氨酸，以便通過S-Au鍵將多肽兩端固定在金納米粒子上;為調節環區在金納米粒子上的構象，在半胱氨酸前添加0-5個中性氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等，如果原環區中間本身含有半胱氨酸，則將其突變為丙氨酸或絲氨酸等，以避免環區中間和金納米粒子結合;設計的多肽通過固相合成方法合成。
[0010]所述的人工抗體按如下合成:將設計的多肽與粒徑范圍在2-100nm之間的金納米粒子溶液混合反應，得到最終人工抗體;基本步驟如下:將按權利要求1設計合成的多肽，根據金納米粒子的表面積計算，按照I nm2金納米粒子表面積上嫁接0.1-3個多肽的比例，在常溫下混合反應1-180 min，使多肽兩端同時固定到金納米粒子表面形成⑶R，從而制備得到具有特異性識別抗原功能的人工抗體。
【附圖說明】
[0011]圖1為本發明基于金納米粒子制備人工抗體的原理示意圖。
[0012]圖2為實施例一制備的抗溶菌酶人工抗體AuNP-Pepl和AuNP_Pep2的活性比較圖。
[0013]圖3為實施例一制備的抗溶菌酶人工抗體AuNP-Pepl特異性結合溶菌酶圖。
[0014]圖4為實施例一通過調整金納米粒子表面的多肽密度來調控抗溶菌酶人工抗體AuNP-P印I的活性圖。
[0015]圖5為實施例一通過改變金納米粒子的粒徑來調控抗溶菌酶人工抗體AuNP—Pepl的活性圖。
【具體實施方式】
[0016]下面給出實施例，對本發明作進一步說明。有必要在此指出的是以下實施例不能理解為對本發明保護范圍的限制，如果該領域的技術熟練人員根據上述本
【發明內容】
對本發明做出一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明保護范圍。
[0017]實施例一:基于金納米粒子表面重建天然抗體CDR多肽環區制備抗溶菌酶人工抗體
1、多肽環區的設計
根據來源于駱駝的抗溶菌酶抗體(cAb-Lys 3)的抗體決定簇互補區的多肽環區(CDR3)，我們首先設計合成了兩種多肽，分別為Pepl、Pep2，其中Pepl與Pep2兩端均添加了半胱氨酸。兩種多肽可以通過S-Au鍵方便地將兩端接到金納米粒子上，其中Pepl是根據cAb-Lys3的CDR 3的多肽片段稍作修改，而Pep2的序列是將Pepl中間的氨基酸序列隨機排列作為對照。
[0018]2、抗溶菌酶人工抗體的制備將金納米粒子粒徑約為3.6nm的納米金溶液(pH調至7.4)，按金納米粒子表面積Inm2嫁接1.5個多肽比例在常溫下混合反應lh。制備出具有同天然抗溶菌酶抗體相同功能的人工抗體AuNP-Pepl和沒有特異性功能對照組AuNP-Pep2。人工抗體AuNP-Pepl可以特異性抑制溶菌酶的活性，而對照組AuNP-Pep2沒有此功能。對人工抗體AuNP-Pepl、功能化的AuNP-Pep2及自由的多肽環區Pepl作為對照分別進行溶菌酶活性的測試實驗，如附圖2所示，曲線斜率越大反映出對溶菌酶活性的抑制越強。從圖中可以看出，抗溶菌酶人工抗體AuNP-Pepl幾乎完全抑制了溶菌酶的活性；自由的多肽Pepl完全沒有抑制活性，功能化的AuNP-Pep2由于納米粒子的非特異性吸附表現出微弱的抑制活性。為了進一步驗證人工抗體AuNP-Pepl與溶菌酶結合的特異性，將各項性質與溶菌酶類似的RNase A(核糖核酸酶)以RNase A與HEWU溶菌酶)5:1的比例按不同加入順序作為對照。如附圖3所示，對于沒有功能化的裸露的金納米粒子AuNPs來說，僅具備非特異性吸附而沒有特異性的功能，所以先加入RNase A會影響AuNPs對HEWL的吸附。而對于人工抗體AuNP-Pep I來說，無論加入順序如何，RNase A不會影響其發揮特異性抑制溶菌酶的功能，所以人工抗體AuNP-PepI始終表現出對溶菌酶的高抑制率。而對于對照組功能化的AuNP-Pep2表現出不具備同HEWL特異性結合的功能。綜上所述，我們通過在金納米粒子表面重建來源于天然抗體cAb-Lys 3的CDR 3多肽環區，制備出一種穩定的具有特異性抑制溶菌酶功能的人工抗體。
[0019]3、抗溶菌酶人工抗體活性的調控
因為多肽環區的構象決定人工抗體的活性，所以可以通過改變多肽環區兩端在金納米粒子表面的跨度實現對多肽環區的構象進行調控，進而實現對人工抗體活性的調控。這種構象的調控通過兩種方式實現。一種是通過改變多肽在金納米粒子表面的密度來調節跨度的大小(如附圖4所示)，另一種方式是通過調節金納米粒子粒徑的不同來調節跨度的大小(如附圖5所示)。在附圖4中，每個金納米粒子表面固定20個多肽Pepl，通過添加不同數目的Pep2來改變金納米粒子表面多肽環區的密度，斜率反映人工抗體的活性，斜率越小抗體活性越高，斜率的變化反映了抗溶菌酶人工抗體活性的變化，說明通過改變密度可以實現對人工抗體活性的調控。在附圖5中，我們制備了粒徑分別約為3.6nm、7.0nm、15.0nm的金納米粒子，按三者的同一表面積計算(保持多肽在金納米粒子表面密度相同)將Pepl、Pep2以及Pepl和Pep2的混合物嫁接在合成的金納米粒子表面。由于金納米粒子尺寸的不同，PepI及Pep2兩端接到納米粒子表面的跨度不同，從而造成多肽環區在納米粒子表面的構象不同，表現出對溶菌酶抑制率的不同，從而實現對人工抗體活性的調控，可以看出改變粒徑的大小可以調控人工抗體的活性。綜上所述，我們通過調控多肽環區兩端在金納米粒子表面的跨度，可以精確調控多肽環區的構象，從而得到出比天然抗體結合能力更強穩定性更好的人工抗體。
【主權項】
1.一種基于金納米粒子的人工抗體構建方法，該方法是將天然蛋白質抗體的決定簇互補區的CDR多肽環區嫁接到金納米粒子表面，從而重建天然抗體與抗原的特異性識別，并制備出比天然抗體穩定性更好、結合力更強的人工抗體;該方法的主要特征包括:通過將設計的多肽兩端同時固定到金納米粒子表面，并且利用金納米粒子表面上金原子的可移動特性，通過調節多肽兩端在納米粒子表面的跨度實現對多肽環區構象的精確控制，從而賦予納米粒子與抗原之間誘導切合的特異性識別功能。2.按權利要求1所述的人工抗體構建方法，其特征在于所述的CDR多肽按如下設計:從天然抗體CDR區選取與抗體特異性結合的關鍵多肽環區序列，并且在序列兩端各添加一個半胱氨酸，以便通過S-Au鍵將多肽兩端固定在金納米粒子上;為調節環區在金納米粒子上的構象，在半胱氨酸前添加0-5個中性氨基酸，該氨基酸為甘氨酸或丙氨酸或絲氨酸或蘇氨酸或亮氨酸或纈氨酸，如果原環區中間本身含有半胱氨酸，則將其突變為丙氨酸或絲氨酸，以避免環區中間和金納米粒子結合;設計的多肽通過固相合成方法合成。3.按權利要求1所述的人工抗體構建方法，其特征在于所述的人工抗體按如下合成:將設計的多肽與粒徑范圍在2 -10 O n m之間的金納米粒子溶液混合反應，得到最終人工抗體;基本步驟如下:將按權利要求1設計合成的多肽，根據金納米粒子的表面積計算，按照Inm2金納米粒子表面積上嫁接0.1-3個多肽的比例，在常溫下混合反應1-180 min，使多肽兩端同時固定到金納米粒子表面形成CDR，從而制備得到具有特異性識別抗原功能的人工抗體。
【文檔編號】C07K16/00GK105884888SQ201610230732
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月14日
【發明人】曹傲能, 邵珠學, 王海芳
【申請人】上海大學