檢測重組蛋白提取物中殘留雜蛋白的特異性抗體及檢測試劑的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種特異性抗體，其可專一結合重組蛋白提取物中的殘留雜蛋白。本發明還提供一種免疫檢測試劑，該試劑用于檢測重組蛋白提取物中的殘留雜蛋白，將本發明制備的特異性抗體作為所述免疫檢測試劑中的捕獲抗體和檢測抗體，用雙抗體夾心法進行檢測。
【專利說明】
檢測重組蛋白提取物中殘留雜蛋白的特異性抗體及檢測試 劑
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及鑒定蛋白制品中殘留雜蛋白的抗體和檢測方 法。
【背景技術】
[0002] 宿主蛋白（HCPs)(殘留雜蛋白）是重組蛋白質藥物的一個主要雜質成分，是生物 制品的重要安全隱患，過多的HCPs可能會引起免疫等一系列不良反應，但即使在最嚴格的 純化工藝和質量控制下進行生產，微量的HCPs殘留也不可避免。有時即使痕量的殘留宿主 雜蛋白就有可能引起劇烈的免疫反應，而且其潛在的"佐劑效應"也可能會引起機體對藥物 產生抗體，進而影響藥物的療效。對殘留雜蛋白的質量控制是生物安全性評估的重中之重。 因此，在工藝開發中，應盡量去除這些宿主殘留蛋白，同時建立快速、準確且靈敏的HCPs檢 測方法。
[0003] 宿主殘留雜蛋白的鑒定與檢測一直是重組蛋白藥物發展過程中的一個重大難題， 特別是對于極高純度的樣品，以往的研究大部分都是針對前期工藝的研究，為工藝發展提 供必要的幫助，而對最終樣品的檢測分析往往顯得無力，往往只能鑒定一個或幾個高濃度 的宿主殘留雜蛋白。在殘留雜蛋白鑒定的過程中，首先要考慮的就是如何有效減少目的蛋 白的干擾，達到濃縮這些痕跡量的宿主殘留蛋白，以達到質譜的檢測范圍內。同時，在宿主 殘留雜蛋白檢測技術中，痕跡量的目的蛋白會嚴重干擾和影響檢測的精度，因此如何從基 因工程的蛋白制品制備具有專一性的抗體是建立稿精度檢測宿主殘留雜蛋白的關鍵。
[0004] 在制備重組蛋白的質量控制中，如何從表達重組蛋白的提取液中分離制備沒有與 目的蛋白交叉反應的宿主殘留雜蛋白是建立檢測重組蛋白提取物的殘留雜蛋白檢測方法 的關鍵，尤其是如何徹底地去除目的蛋白是一個非常棘手的技術難題，也是建立高精度的 宿主殘留雜蛋白檢測方法的關鍵因素；目前國際上采用宿主殘留雜蛋白的檢測方法由于宿 主細胞高效表達重組蛋白后，宿主蛋白的成分和種類均發生了較大變化，利用非基因工程 宿主蛋白來建立重組蛋白的宿主雜蛋白檢測方法具有極高的風險，也是目前還沒很好地解 決的技術難題。
[0005] 用于HCPs分析的主要技術包括十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)、高效液相色譜法和免疫印跡法，但是通常最終產品中HCPs含量都在ppm級，而 上述方法的檢測靈敏度和準確性明顯不夠，無法對高純度的樣品進行有效的HCPs定量分 析。因此，酶聯免疫吸附（ELISA)技術由于其高靈敏度和準確性被認為是行業內的黃金標 準檢測方法。到目前為止，絕大多數通過FDA批準認可的重組蛋白藥物殘留HCPs含量定量 都是通過ELISA進行測定，檢測含量一般在1 - lOOppm之間。因而建立高精度的ELISA方 法來檢測宿主殘留雜蛋白的關鍵在于具有專一性識別抗原（宿主殘留雜蛋白）的特異性抗 體。
[0006] 檢測殘留雜蛋白的ELISA方法主要有兩種，一種是利用商業化的試劑盒，但需要 有成熟的商業化抗體，另一種是通過制備特異性抗體進行檢測。
【發明內容】
[0007] 本發明的一個目的在于提供一種特異性抗體，其可專一結合重組蛋白提取物中的 殘留雜蛋白。
[0008] 本發明的另一個目的在于提供一種免疫檢測試劑，該試劑用于檢測重組蛋白提取 物中的殘留雜蛋白，將本發明制備的特異性抗體作為所述免疫檢測試劑中的捕獲抗體和檢 測抗體，用雙抗體夾心法進行檢測。
[0009] 根據本發明的一方面，一種特異性抗體，用于專一結合重組蛋白中的殘留雜蛋白， 所述重組蛋白為將外源基因通過基因工程技術重組并在宿主中表達的蛋白質產物，其中含 有目的蛋白和殘留雜蛋白，其特征在于，通過下述方法制備所述抗體：
[0010] 1)用第一種蛋白免疫動物，制備抗第一蛋白抗體，所述第一種蛋白為天然存在于 生物體的蛋白，所述目的蛋白與第一種蛋白具有相同的蛋白質結構和性質；
[0011] 2)將步驟1)獲得的抗第一蛋白抗體與親和層析介質偶聯，制備抗第一蛋白抗 體-免疫親和層析柱；
[0012] 3)用步驟2)制備的抗第一蛋白抗體-親和層析柱去除重組蛋白中的目的蛋白，獲 得總宿主殘留雜蛋白；
[0013] 4)用步驟3)獲得的總宿主殘留雜蛋白作為第二種蛋白免疫動物，制備抗第二蛋 白抗體；
[0014] 5)將第一種蛋白與親和層析介質偶聯，制備第一種蛋白-親和層析柱；
[0015] 6)用步驟5)制備的第一種蛋白-親和層析柱去除步驟4)制備的抗第二蛋白抗 體中的痕跡量的抗第一種蛋白的抗體，獲得能專一結合重組蛋白提取物中殘留雜蛋白的抗 體。
[0016] 優選地，在步驟1)和步驟4)之后可以進一步包括純化免疫動物獲得的抗第一蛋 白抗體和抗第二蛋白抗體的步驟。并且必要時可以重復步驟3)和步驟6)，以獲得更好的去 除目的蛋白和抗第一蛋白的抗體的效果。
[0017] 在上述步驟中，術語"天然存在于生物體的蛋白"是指直接從生物體中分離的具有 生物活性的蛋白質。
[0018] 術語"重組蛋白"是指應用基因重組技術，獲得連接有可以翻譯成目的蛋白的基因 片段的重組載體，之后將其轉入可以表達目的蛋白的宿主細胞從而表達特定的重組蛋白分 子。
[0019] 術語"殘留雜蛋白"或者"宿主殘留雜蛋白"是指在重組蛋白表達和分離純化過程 中來源于宿主細胞的非目的蛋白的蛋白質。
[0020] 用于表達重組蛋白的表達載體包括原核細胞如大腸桿菌、真核細胞如酵母、昆蟲 細胞以及CH0細胞等，重組蛋白也可利用動物表達系統或植物表達體系產生，例如轉基因 動物的乳腺或者轉基因植物的胚乳或葉片。本發明的一個代表性示例即通過水稻胚乳表達 的人血清白蛋白。
[0021] 根據本發明的另一方面，提供一種酶聯免疫檢測試劑，用于定量檢測基因工程重 組蛋白提取物中的殘留雜蛋白，其使用本發明的特異性抗體作為捕獲抗體包被固相載體， 并用本發明的特異性抗體作為檢測抗體與標記物結合制備酶結合物；優選的檢測試劑為使 用雙抗體夾心法的ELISA檢測試劑。
[0022] 更具體的，本發明以轉基因水稻胚乳表達的重組人血清白蛋白的制備為典型示 例，提供一種酶聯免疫檢測試劑，其中所述能專一結合重組蛋白提取物中殘留雜蛋白的特 性抗體通過下述方法制備：
[0023] i)用人源血清白蛋白作為抗原免疫兔子，制備兔抗人血清白蛋白多克隆抗體并純 化；
[0024] ii)將步驟i)制備的純化的兔抗人血清白蛋白多克隆抗體與親和層析介質偶聯， 制備免疫親和層析柱A ;
[0025] iii)用步驟ii)的免疫親和層析柱A從表達重組人血清白蛋白的基因工程水稻種 子提取物中去除目的蛋白，進而制備水稻種子總殘留雜蛋白，通過3次的親和層析，徹底去 除目的蛋白的目的，收集含水稻種子總殘留雜蛋白的流出液；
[0026] iv)用步驟iii)獲得的含水稻種子總殘留雜蛋白的流出液免疫兔子，獲得抗基因 工程水稻水稻種子總雜蛋白的多克隆抗體并純化；
[0027] V)以血楽:來源人血清白蛋白與親和層析介質偶聯，制備親和層析柱B ;
[0028] vi)用步驟V)的親和層析柱B對步驟iv)的獲得的抗基因工程水稻水稻種子總雜 蛋白多克隆抗體進行親和層析，通過3次的親和層析，去除痕跡的抗重組人血清白蛋白的 抗體，收集流出物為專一結合表達重組人血清白蛋白的基因工程水稻種子總提取物中殘留 雜蛋白的特異性抗體。
[0029] 優選地，其中步驟ii)和步驟v)所述的親和層析介質為CNBr-activatived SepharoseTM 4Fast Flow。
[0030] 優選地，其中步驟i)所述的純化包括下述步驟：
[0031] ia)硫酸銨沉淀粗純化制備的兔抗人血清白蛋白多克隆抗體得到粗純液；以及
[0032] ib)用proteinA親和層析純化粗純液獲得純化的多克隆抗體。
[0033] 其中步驟iv)所述的純化包括用IgG層析柱純化獲得的抗體基因工程水稻宿主雜 蛋白的多克隆抗體。
[0034] 所述的免疫檢測試劑中，優選的捕獲抗體包被濃度可以在為5~40 μ g/ml，更優 選捕獲抗體濃度為20 μ g/ml，檢測抗體濃度優選為0. 2~1. 6 μ g/ml，更優選的檢測抗體濃 度為〇. 8 μ g/ml，以辣根過氧化物酶標記檢測抗體。
[0035] 也可以將生物素與辣根過氧化物酶結合，其中優選的捕獲抗體包被濃度為2~ 16 μ g/ml，檢測抗體濃度為0. 5 μ g/ml，更優選的捕獲抗體濃度為2 μ g/ml，以生物素標記 檢測抗體后再與辣根過氧化物酶結合。
[0036] 本發明的免疫檢測試劑，其檢測的重組蛋白提取物中殘留雜蛋白含量優選為 2.5ng/ml - 25ng/ml〇
[0037] 本發明的特異性抗體可專一結合重組蛋白提取物中的宿主殘留雜蛋白，利用本發 明特異性抗體的ELISA檢測實踐可對重組蛋白提取物中的殘留雜蛋白進行定量鑒定，對于 重組蛋白產物的質量控制有重要的用途和意義。
[0038] 附圖簡沐
[0039] 圖1為檢測水稻宿主殘留雜蛋白的ELISA方法建立的技術路線圖；
[0040] 圖2為抗人血清白蛋白血清的滴度與覆蓋度的Western Blotting檢驗；其中：1: 商業購買兔抗人血清白蛋白，2 :自制兔抗人血清白蛋白，M:Marker ;
[0041] 圖3為水稻種子抗總雜質兔血清的粗純化路線圖；
[0042] 圖4為純化后抗體的Native PAGE圖；其中為白蛋白抗體，Μ為蛋白marker.純 化后抗體的Native PAGE圖，1為白蛋白抗體，Μ為蛋白marker。
[0043] 圖5為抗體偶聯填料載量的測定；其中：左向箭頭：洗脫溶液（即結合的人血清白 蛋白），右向箭頭：穿透溶液（即未結合雜質蛋白）；
[0044] 圖6為水稻種子雜蛋白標準品樣品的SDS-PAGE與專一性抗體的Western Blotting 圖；
[0045] 圖7為水稻種子總雜質抗血清的初步純化路線圖；
[0046] 圖8為抗體的抗原覆蓋度及專屬性分析；其中：抗雜質抗體對各層析步驟的雜質 的SDS-PAGE(左）和Western blot圖（右）；泳道1-9為不同純化步驟的樣品。Μ為蛋白 Marker ；
[0047] 圖9為ELISA檢測試劑的標準曲線的線性驗證結果。
【具體實施方式】
[0048] 下面通過對優選實施例的描述，詳細說明但不限制本發明。
[0049] 描述本發明的特異性抗體和ELISA檢測試劑的一個示范性實施方式是用基因工 程水稻胚乳細胞表達的重組人血清白蛋白（OsrHSA)。在重組人血清白蛋白的提取物中除目 的蛋白（重組人血清白蛋白）外，包含來自植物源（水稻）宿主的殘留雜蛋白，天然蛋白為 人源血清白蛋白。
[0050] 利用水稻胚乳細胞作為生物反應器表達重組的人血清白蛋白的方法，可以參見如 中國專利申請No. 200510019084,其涉及利用水稻胚乳細胞作為生物反應器生產OsrHSA 的方法，或者如No. 201010597544. 2,其涉及從水稻種子中提取重組人血清白蛋白的方法， No. 201010606635. 8涉及從水稻種子中分離純化重組人血清白蛋白的方法。
[0051] 以下實施例所使用的材料和設備如無特別說明均為市售商業購買。
[0052] 人血清白蛋白（human serum Albumin) Sigma ;
[0053] 弗氏完全佐劑（Freund' s complete adjuvant, FCA) Sigma F-5881 ;
[0054] 弗氏不完全佐劑（Freund' s incomplete adjuvant, FIA) Sigma F-5506 ;
[0055] 新西蘭兔（New Zealand rabbits)中科院武漢病毒所；
[0056] 植物源重組人血白蛋白粗提液由武漢禾元生物科技有限公司提供；（制備方法參 考上述引用的專利申請）
[0057] 抗人血清白蛋白抗體（Anti-Human Serum Albumin antibody)abeam ab2406 ;
[0058] 用于多克隆抗體的純化與偶聯的試劑：
[0059] 層析填料：CNBr-activatived SepharoseTM 4：Fast Flow ;
[0060] 層析儀：AKATA Purifier 100UPC, Bio-rad Duoflow ;
[0061] 載量測定：BCA法測定提取溶液蛋白含量（ThermoScientific);
[0062] Equlibration buffer:20yM Na2HP04 · 12H20+4 μ MNaH2P04 · 2H20+0. 5MNaCl pH7. 6 ；
[0063] Elution buffer:20 μ M Na2HP04 · 12H20+0. 15M NaCl pH2. 8
[0064] 飽和硫酸銨：50 %飽和硫酸銨。
[0065] 用于免疫親和層析與NanoLC-ESI-MS/MS的設備：
[0066] 膜包：U650599PelliconXL5KD Millipore PXC005C50,100% TCA，丙酮；
[0067] Agilent 1200 系列快速高分辨液相色譜儀（Rapid Resolution Liquid Chromatography, Agilent Technologies, ffaldbronn, Germany),
[0068] 真空濃縮離心機（SpeedVac device，Thermo)，膜蛋白酶（modified, sequencing grade), Promega(Madison, WI)
[0069] 四級離子陷講質譜分析儀Thermo (Palo Alto, CA);
[0070] 非冗余蛋白數據庫下載于NCBI' s GenBank ;
[0071] 所有在蛋白酶解和HPLC用到的化學試劑均來自Sigma (St. Louis, M0, USA)。
[0072] 【實施例1】特異性抗體制備
[0073] 1、技術路線
[0074] 由于目前還沒有可用于檢測水稻宿主殘留雜蛋白的ELISA商業試劑盒。為了開發 適用水稻表達體系制備的重組人血清白蛋白提取物的檢測方法，在重組蛋白水稻胚乳細胞 過量表達時，產生內質網脅迫，而從導致一些內源蛋白的組分發生一些改變，為了更準確地 檢測宿主蛋白，本檢測方法利用基因工程水稻種子全雜質，建立了具有靈敏度高、重復性好 的檢測方法，用于水稻種子生物反應器系列產品的檢測和質量控制。
[0075] 本檢測方法應用基因工程水稻的提取工藝的粗提取物的全雜質成分，采用雙抗體 夾心法測定植物源重組人血清白蛋白中的水稻種子宿主蛋白殘留量水平；檢測抗體分別采 用HRP標記和生物素標記。
[0076] 實驗技術路線如圖1所示，實驗制備抗人血清白蛋白（天然蛋白，第一種蛋白）的 免疫層析柱，用于去除基因工程全提取物中的重組人血清白蛋白（目的蛋白），剩余的全蛋 白作為總殘留雜蛋白（第二種蛋白）抗原，免疫兔子獲得抗宿主總雜蛋白的多克隆抗體，純 化后的抗宿主總雜蛋白的多克隆抗體作為包被和檢測抗體，并以免疫抗原作為標樣，建立 夾心ELISA定量方法。
[0077] 2、抗人血清白蛋白多克隆抗體制備
[0078] 取20只成年新西蘭兔，每4周注射一次人源的人血清白蛋白，共注射3次，在最后 一次注射后的7-10天后放血采集血液。將收集血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘，在4°C 放置過夜。將血凝塊從管壁上撥落，轉移至塑料離心管中，在4°C下10, 000g離心10分鐘， 收集上清液即為血清，血清樣品隨即用抗IgG的免疫親和層析對血清中的抗體進行進一步 純化，獲得高純度抗人血清白蛋白抗體，純化后的抗體在-20°C冰箱保存以備用。
[0079] 表1抗人血清白蛋白多克隆抗體制備流程
[0080]
[0081] 在第三次免疫后一個星期，制備血清經過Western檢測，同樣在1:10000稀釋 度的條件下，實驗制備的抗人血清白蛋白的血清與市場銷售的抗人血清白蛋白抗體（US Biological，A1327-30A)進行比較，Western Blotting結果如圖2所示，制備的抗人血清白 蛋白的血清效價跟市場經過純化后的效價接近，制備多克隆抗體還能有效地與人血清白蛋 白的降解片段反應，表明制備的抗體不僅能有效地去除完整重組人血清白蛋白分子，而且 能有效地去除人血清白蛋白的降解片段，因而可以提高對殘留雜蛋白鑒定的精確度。
[0082] 3、抗人血清白蛋白多克隆抗體的純化
[0083] 為了消除任何血清不純物對檢測結果的影響，先對抗血清進行粗純化，具體純化 的過程見圖3。經二級硫酸銨沉淀的粗純化抗體用25mM PBS復溶，經過透析去除硫酸銨用 HC1調節pH值至7. 6,用于免疫親和層析的制備樣品。
[0084] 抗人血清白蛋白抗體經粗純化后，用于抗原免疫親和層析。人血清白蛋白抗 原首先偶聯至CNBr-activatived Sepharose? 4Fast Flow。偶聯方法具體流程參照廠 家說明書為：先用0-4°C的HC1 (pH 2-3)溶液去除填料的保護劑，以人血清白蛋白溶液 (pH8. 0):填料按照1:2的比例進行混合偶聯，混合后搖床里室溫放置3小時，隨后加入0. 1M Tris-HCl (pH 8. 0)緩沖液放置2小時，對未偶聯殘基進行封閉。封閉結束后用緩沖液（0. 5M 恥(：1，0.1]\13。6七&七6邛!13-4)和緩沖液（0.51恥(：1，0.1]\11^8-!1(：1，口!18-9)反復清洗 人血清白蛋白偶聯的填料，最后制備的填料裝入層析柱，上樣前采用3倍柱體積的平衡液 (20μΜ Na2HP04,0. 5MNaCl pH7.6)對免疫親和層析柱進行平衡，上樣后用洗脫液（20μΜ Na2HP04,0. 5Μ NaCl pH 2. 1)對結合在免疫親和層析填料的抗人血清白蛋白抗體進行洗脫 收集，洗脫后的層析柱經過再平衡進行下一次的純化收集。
[0085] 本試驗共利用700mg人血清白蛋白偶聯了 6. 5g CNBr-activatived Sepharose? 4Fast Flow填料，獲得層析柱載量約為100mg。對抗原免疫親和層析后的抗體通過12%的 Native PAGE分析，結果顯示純化的抗體具有較高純度（圖4)，純化后的抗體經過BCA蛋 白定量試劑盒（BCA Protein assay kits, Bio Rad, Pierce, CA USA)測定，總抗體量約為 1. 5g〇
[0086] 4、抗人血清白蛋白抗體偶聯親和層析填料的載量測定
[0087] 純化后的抗體按照同樣偶聯方法偶聯至CNBr-activatived Sepharose? 4Fast Flow，偶聯的流程跟抗原人血清白蛋白的偶聯流程相同。偶聯完后對層析柱進行載量的確 定，在增加上樣量的情況下，非吸附蛋白（穿透液）增加，吸附的人血清白蛋白保持不變， 即柱子已飽和，在飽和狀態下最低上樣量即為柱子的載量。以含植物源重組人血清白蛋白 (8mg/ml)上樣，上樣體積從4ml逐步增加，隨著上樣體積增加，當洗脫體積逐漸平穩，當只 有析出體積增加時，即可確定此上樣量即為柱子載量。
[0088] 從圖5可以看出，植物源重組人血清白蛋白（8mg/ml)上樣體積從4ml逐步增加到 24ml。結果顯示：在上樣量4ml至12ml之間結合的人血清白蛋白和穿透的雜蛋白具有量效 關系，即隨著上樣量增加，結合蛋白峰和穿透蛋白峰隨著上樣量的增加而增加，當上樣量達 到12ml時，基本達到飽和，即增加上樣量并沒有增加結合蛋白的峰值，表明12ml的上樣量 已經達到飽和，在該免疫層析樹脂的裝柱體積下，捕獲人血清白蛋白的總載量為96mg。
[0089] 5、宿主總殘留雜蛋白抗原的制備
[0090] 重組人血清白蛋白基因工程水稻原料大米經過研磨，稱取米粉0. lg，加入提取緩 沖液25mM PBS, pH7. 5,（1:5)。用旋轉儀混勻60min，12, 000g離心，收集上清液后，以每次 100mg的量進行anti-HSA免疫親和層析，去除重組人血清白蛋白，分離宿主雜蛋白。
[0091] 上樣前先對偶聯好的anti-HSA免疫親和層析柱進行三倍體積的平衡液（20 μ Μ Na2HP04,0. 5Μ NaCl，pH7.6)進行平衡，流速為5ml/min，收集穿透液，然后用洗脫液（20μΜ Na2HP0 4,0. 5Μ NaCl，pH2. 7)進行洗脫。上樣過程中，收集的宿主總殘留雜蛋白溶液，一次上 樣量為100mg，穿透液重復過柱兩次，以徹底地去除宿主總殘留雜蛋白中的人血清白蛋白， 經過三次免疫層析收集的宿主總殘留雜蛋白經過5kD膜包的超濾濃縮。收集的宿主總殘留 雜蛋白樣品經濃縮后分別經12%的SDS-PAGE跑膠確定雜質組成。（參照《分子克隆》第三 版）。
[0092] 從圖6結果可看出，所制備的宿主總殘留雜蛋白抗原條帶清晰，分子量范圍廣泛， 用BCA法測純化出來的抗原標準品，其蛋白濃度不低于1. 5mg/ml。
[0093] 6、抗總宿主雜蛋白多克隆抗體的制備過程
[0094] 以基因工程水稻提取物的經純化后的總殘留雜蛋白為抗原，取4-6個月齡的純種 雄性新西蘭大白兔作為免疫動物，初次免疫部位在淋巴結和背部多點注射，加強免疫部位 在腳底和背部多點注射；初次免疫劑量為1. 5mg/ml總殘留雜蛋白抗原，初次免疫時加入等 體積弗氏完全佐劑，以提高抗原的免疫原性，初次免疫后2周后進行加強免疫，加強免疫為 lmg/ml總殘留雜蛋白抗原，共3次，每次間隔2周。最后一次加強免疫后7-10天內采血，裝 于試管中，于37°C靜置30min，使血球凝固，再置于4°C冰箱過夜，第二天離心收集上清液， 并對上清液中的抗體進行純化制得。具體純化方法參見上述抗人血清白蛋白多克隆抗體的 純化。
[0095] 抗水稻總殘留雜蛋白的血清按照圖7進行粗純化，再經過protein A親和層析， 獲得抗水稻總殘留雜蛋白的多克隆抗體混合液，再用血漿來源的人血清白蛋白偶聯的親和 層析，去除可以識別重組人血清白蛋白的抗體成分，獲得專一識別水稻宿主殘留雜蛋白的 特異性抗體。粗純化的過程同上，純化后的抗殘留雜蛋白的血清沉淀用25mM PBS復溶，經 過透析去除硫酸銨，然后用HC1調節pH至7. 6,用作protein A親和層析的上樣品。選用 protein A對粗純化后的樣品進一步的純化，層析條件為平衡緩沖液20mM PBS pH 7. 4,洗 脫緩沖液〇. ImM甘氨酸一鹽酸緩沖液pH 2. 7,流速2ml/min。再經重復三次的人源血清白 蛋白偶聯的親和層析，以徹底地去除特異性抗體中的anti-HSA抗體，具體方法同上，唯一 區別為收集穿透液為目標特異性抗體溶液。
[0096] 【實施例2】ELISA檢測試劑制備
[0097] 1、特異性抗體的HRP的偶聯
[0098] 采用過碘酸鈉法對實施例1制備的特異性抗體進行HRP標記，即在低PH下使NalO 4氧化HRP，HRP經NalO 4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏堿， 后者可進一步用NaBH 4(或乙醇胺）還原生成穩定的酶標記抗體。具體步驟如下：標記步 驟：
[0099] (1)稱取 20mgHRP 溶解于 4ml 0· 3M 碳酸氫鹽（ρΗ8· 1);
[0100] (2)于上述溶液中加入0. 4ml新配的0. 1 %的FDNP溶液，室溫下攪拌1小時；
[0101] (3)加4ml 0· 5M NalO 4,室溫攪拌30min，待溶液變為黃綠色；
[0102] (4)加 4ml乙二醇，室溫攪拌1小時；
[0103] (5)將上述溶液裝入透析袋中，用0. 01M pH9. 5的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜；
[0104] (6)加入20mg抗體到15ml HRP溶液，室溫攪拌2-3小時；
[0105] (7)加入 20mg ，再置 4°C 2 小時；
[0106] (8)裝入透析袋中，對0· 15M PH7.4PBS透析，4°C過夜。
[0107] 偶聯后的抗體需要去除未被偶聯的多余酶，采用硫酸銨沉淀法去除未被偶聯上的 酶（硫酸銨沉淀方法同上面的抗體的預處理），偶聯完后的抗體經過〇D208nm和0D403nm檢 測計算最終獲得的偶聯的抗體總量。計算公式如下：
[0108] 酶量（mg/ml) = 0D403nmX0. 4
[0109] IgG 量（mg/ml) = (0D280nm-0D403nmX0. 3) Χ0· 62
[0110] 2、Biotin與特異性抗體的偶聯
[0111] 3. 5mg由實施例1制備的抗體溶液移入透析袋中，用碳酸鹽緩沖液（0. 1M碳酸，pH 9. 4)透析過夜，加入1. 5mg的Biotin于抗體溶液中。混勻后常溫攪拌反應2小時。過G-25 柱進行標記產物的純化，去除游離生物素。蛋白含量用紫外分光光度計進行測定。
[0112] 3、鑒定宿主殘留雜蛋白ELISA方法的二抗制備過程
[0113] 待標記的抗體為宿主殘留雜蛋白ELISA捕獲一抗，將3. 5mg待標記的抗體溶液移 入透析袋中，用碳酸鹽緩沖液（0. 1M碳酸，pH 9. 4)透析過夜。加入1. 5mg的生物素于抗體 溶液中，混勻后常溫攪拌反應2小時。過G-25柱進行標記產物的純化，去除游離生物素后 制得ELISA檢測二抗。用BCA法檢測宿主蛋白ELISA檢測二抗蛋白濃度，檢測結果應不低 于 lmg/ml〇
[0114] 【實施例3】ELISA檢測影響因素的確定：
[0115] 為了檢測由本發明制備的抗體在檢測宿主殘留雜蛋白的可行性，對影響宿主雜蛋 白殘留量檢測的影響因素進行了研究，分別對1)雜質的濃度與純度；2)捕獲一抗與檢測二 抗的抗原覆蓋度與特異性；3)檢測抗體HRP標記與生物素標記的選擇及捕獲抗體與檢測抗 體最佳配比；4)樣品的測定范圍。
[0116] 我們對各檢測影響因素進行實驗確定后得出結果，雜質的濃度為2. 5mg/ml，且在 Western Blotting中用檢測二抗檢出單一條帶；捕獲一抗和檢測二抗均對抗原具有很好 的覆蓋度且與目的蛋白OsrHSA(水稻胚乳表達的重組人血清白蛋白）間無交叉反應；最終 確定的生物素體系中，捕獲抗體包被濃度為2 μ g/ml，檢測抗體濃度為0. 5 μ g/ml，最低檢 測限可降低至1. 25ng/ml ;將酶標板包被抗體且封閉制成干板后本底值更低；稀釋液使用 PBS+0. 1% BSA，檢測結果更加準確；產品稀釋比例為128倍時，結果最為可信。
[0117] 【實施例4】特異性抗體的抗原覆蓋度：
[0118] 用Western Blotting法對獲得的特異性抗體用抗原雜質檢測，不管是標樣抗原雜 質還是部分純化后的雜質，絕大部分都能有效地被特異性抗體檢測，結果表明所制備的特 異性抗體對前期產品和后期產品都具備很好的覆蓋度。
[0119] 交叉反應：在SDS-PAGE上，人血清白蛋白的帶非常的明顯（66. 5kD)，但Western Blotting結果顯示，所有的層析樣品包括最終樣品沒有重組人血清白蛋白對應的條帶顯 示，表明所制備的特異性抗體不存在重組人血清白蛋白的交叉反應，圖8。
[0120] 【實施例5】檢測抗體標記HRP或生物素的影響
[0121] 為了比較HRP標記抗體與生物素標記抗體在本檢測中的適用性，比較了兩種標記 抗體在靈敏度，檢測限及本底上的區別。
[0122] 基于HRP標記的檢測抗體ELISA抗體濃度優化
[0123] 實驗首先建立了基于HRP標記抗體的ELISA方法，從
[0124] 表2可以看出，在抗原濃度為250、50、10ng/ml條件下，HRP捕獲抗體量在 20-40 μ g/ml之間沒有明顯差異，而在20 μ g/ml時，0D值明顯高于10 μ g/ml和5 μ g/ml， 同樣檢測抗體在1. 6與0. 8 μ g/ml之間沒有明顯差異，而0. 8 μ g/ml與0. 4、0. 2 μ g/ml則 出現明顯不同。在抗原濃度為2ng/ml時，0D檢測值在各個濃度的捕獲和檢測抗體濃度下 都很低，沒有規律可循，可能是由于本身的檢測限度所限。基于以上實驗結果，我們最終選 擇捕獲抗體濃度為20 μ g/ml，檢測抗體濃度為0. 8 μ g/ml (1:5000)。
[0125] 表2不同抗原濃度在不同捕獲抗體及檢測抗體組合下0D45。吸光值比較
[0126]
[0127] 基于生物素標記的檢測抗體ELISA抗體濃度優化
[0128] 在建立基于HRP標記抗體的ELISA方法時，比較50ng/ml、12. 5ng/ml、2. 5ng/ml、 1. 25ng/ml抗原濃度在不同捕獲抗體及檢測抗體組合下0D45。吸光值，由表3結果可看出，抗 原濃度為1. 25ng/ml仍有陽性信號，且所使用的捕獲抗體濃度也較低，但在捕獲抗體濃度 高于2本底值μ g/ml時，檢測本底值大于0. 2過高。因而需找到最佳的檢測抗體與捕獲抗 體濃度組合，由表4不同抗原濃度50ng/ml、12. 5ng/ml、2. 5ng/ml、1. 25ng/ml在2 μ g/ml捕 獲抗體+〇. 5 μ g/ml檢測抗體組合及4 μ g/ml捕獲抗體+0. 5 μ g/ml檢測抗體組合0D450吸 光值比較可看出，當用2 μ g/ml捕獲抗體進行包被，用0. 5 μ g/ml檢測抗體進行檢測時，本 底最低，且重復性較好。
[0129] 表3不同抗原濃度在不同捕獲抗體及檢測抗體組合下0D45。吸光值比較
[0130]
[0131] 生物素偶聯檢測抗體濃度為0. 5 μ g/ml，Blank行為實驗中陰性對照吸光值。
[0132] 表4檢測抗體與捕獲抗體組合試驗
[0133]
[0134] 生物素偶聯檢測抗體濃度為0. 5 μ g/ml，每組實驗獨立重復3次。抗原吸光值為減 去陰性對照后吸光值，Blank行為實驗中陰性對照吸光值。
[0135] 通過比較基于HRP標記與生物素標記的檢測抗體ELISA方法數據，發現，由于生物 素標記體系中，檢測抗體孵育完成后，需辣根酶標記鏈親和素進一步進行交叉反應從而顯 色，因此生物素標記體系中，檢測信號進一步放大，靈敏度提高，HRP標記體系中，2ng/ml抗 原無陽性檢測信號；而生物素體系中，捕獲抗體及檢測抗體濃度降低的情況下，1. 25ng/ml 抗原有穩定的陽性檢測信號，靈敏度較HRP體系的5ng/ml提高到1. 25ng/ml。
[0136] 生物素標記檢測抗體ELISA方法中，捕獲抗體濃度為4 μ g/ml以上時，抗原檢測 吸光值趨于穩定，捕獲抗體包被濃度在4 μ g/ml即可滿足檢測，但本底值稍高，高于0. 2,不 利于低濃度抗原檢測數據的穩定；當捕獲抗體濃度降低為2 μ g/ml時，除高濃度抗原吸光 值稍有下降外，低濃度抗原吸光值較為穩定，且顯著高于空白對照+3 XSD，OsrHSA中雜質 含量較低，低本底值及更穩定的低濃度樣品檢測對于方法的穩定性更為重要，故最終選擇 2 μ g/ml的捕獲抗體進行包被，0. 5 μ g/ml的檢測抗體進行檢測。
[0137] 【實施例6】樣品測定范圍
[0138] 為了確定樣品的測定范圍，將OsrHSA原液（濃度為200mg/ml)進行倍比稀釋后進 行測定，結果如表所示。OsrHSA產品中OsrHSA濃度較高，在ELISA中對雜質含量測定可能 存在一定影響。由表中結果可以看出，當其稀釋比例為64-256梯度范圍內時，雜質含量測 定值基本呈同等倍比關系，稀釋倍數過大，導致雜質含量接近定量限時，數值偏差會較大。 故稀釋梯度為128倍時，測定結果最為可信，即OsrHSA濃度最好為3mg/ml以下時，產品中 雜質含量測定值較為準確可信。
[0139] 表5樣品倍比稀釋測定值
[0140]
[0141] 【實施例7】ELISA方法驗證
[0142] 1、專屬性
[0143] 陽性樣品：1. 25ng/ml標準品
[0144] 陰性樣品：人血白蛋白，用稀釋液稀釋128倍
[0145] 空白：樣品稀釋液
[0146] 點樣序列：陽性樣品、陰性樣品、空白每塊ELISA干板上各點樣6個復孔，獨立重復 3次
[0147] 專屬性驗證結果：
[0148] 可接受標準：陽性樣品有信號，0D值大于空白0D平均值+5XSD ;陰性樣品無信 號，0D值與空白接近
[0149] 結果：3次獨立重復實驗均顯示，陽性樣品0D450大于空白0D+5XSD ;陰性樣品無 陽性信號，0D值與空白值接近，符合標準規定
[0150] 表6宿主蛋白殘留量測定方法專屬性驗證結果
[0151]
[0152] 2、線性
[0153] 方法：以吸收值（0D)對抗原標準品的濃度（Concentration)做4-parameter模式 的標準曲線。標準曲線的R 2應不得小于0. 99,結果如圖9.
[0154] 點樣序列：
[0155] 表7線性驗證點樣序列
[0156]
[0157] 表8宿主蛋白殘留量測定方法線性驗證結果
[0158]
[0159] 3、定量限
[0160] 方法：將抗原標準品溶液稀釋至最低可準確定量的濃度，點樣測試。
[0161] 點樣序列：定量限溶液點樣6個復孔，試驗獨立重復3次
[0162] 定量限度樣品：1. 25ng/ml標準品抗原，點樣6個復孔，獨立重復3次（η = 18)
[0163] 定量限驗證結果：
[0164] 可接受標準：實際定量限為1. 25ng/ml，測定結果的回收率在75% -125%之間，測 得值的RSD不得大于25%
[0165] 定量限為1.25即/1111，測定結果的回收率為96.5%，且測得值的1^(11=18)= 16. 7%，符合標準規定
[0166] 表9宿主蛋白殘留量測定方法定量限度驗證結果
[0167]
[0168] 4、重復性
[0169] 方法：將同一樣品稀釋后重復點樣，計算結果間的RSD。
[0170] 點樣序列：標準品點樣序列同2。
[0171] 供試品批號：201310035、201310036、201310037。
[0172] 供試品點樣序列：各批次供試品稀釋后點樣9個復孔（3個復孔為一組，板內重復 性，η = 9)，獨立重復3次（板間重復性，η = 9)。
[0173] 重復性驗證結果：
[0174] 可接受標準：
[0175] 各批次樣品板內測定結果（η = 9)與板間測定結果（η = 9)的RSD值不大于20%
[0176] 結果：各批次樣品板內測定結果（η = 9)及板間測定結果（η = 9)的RSD值均小 于20%，符合標準規定
[0177] 表10宿主蛋白殘留量測定方法重復性驗證結果
[0178]
[0179] 5、準確度
[0180] 方法：樣品溶液中添加濃度為25ng/ml、10ng/ml和2. 5ng/ml的標準品溶液，計算 加標回收率。
[0181] 點樣序列：標準品抗原點樣序列同2。
[0182] 加標樣品：加標25ng/ml、加標10ng/ml、加標2. 5ng/ml、加標Ong/ml (陰性對照）。
[0183] 加標樣品點樣序列：各濃度加標樣品每塊板各點樣3個復孔，獨立重復3次。
[0184] 回收率計算公式：
[0185] 回收率％ =(加標樣品測定值-未加標樣品測定值）/標準品理論添加 量X 100%。準確度驗證結果
[0186] 可接受標準：回收率在75% -125%之間，回收率間的RSD不得超過20%
[0187] 結果：
[0188] 標準品添加回收率均在75% -125%之間，回收率間的RSD值均小于20%，符合標 準規定
[0189] 表11宿主蛋白殘留量測定方法準確度驗證結果
[0190]
[0191] 6、精密度
[0192] 方法：準確度項下各回收率間的RSD來確定方法的精密度。
[0193] 點樣序列：同2
[0194] 精密度計算方法：各濃度加標樣品回收率間RSD值（η = 9)。
[0195] 精密度驗證結果：可接受標準：各濃度回收率間的RSD值不得超過20% (η = 27)。
[0196] 結果：各濃度回收率間的RSD值為8. 3% (η = 27)，小于20%，符合標準規定
[0197] 表12宿主蛋白殘留量測定方法精密度驗證結果
[0198]
[0199] 7、范圍
[0200] 線性、精密度和準確度都符合可接受標準的樣品測定范圍為：2. 5ng/ml - 25ng/ ml 〇
【主權項】
1. 一種特異性抗體，用于專一結合基因工程重組蛋白提取物中的殘留雜蛋白，所述重 組蛋白提取物中含有目的蛋白和殘留雜蛋白，其特征在于，通過下述方法制備所述特異性 抗體： 1) 用第一種蛋白免疫動物，制備抗第一蛋白抗體，所述第一種蛋白為天然存在于生物 體的目的蛋白，所述目的蛋白與第一種蛋白具有相同的蛋白質結構和性質； 2) 將步驟1)獲得的抗第一蛋白抗體與親和層析介質偶聯，制備抗第一蛋白抗體-免疫 親和層析柱； 3) 用步驟2)制備的抗第一蛋白抗體-親和層析柱去除重組蛋白提取物中的目的蛋白， 獲得總宿主殘留雜蛋白； 4) 用步驟3)獲得的總宿主殘留雜蛋白作為第二種蛋白免疫動物，制備抗第二蛋白抗 體； 5) 將目的蛋白與親和層析介質偶聯，制備目的蛋白-親和層析柱； 6) 用步驟5)制備的目的蛋白-親和層析柱去除步驟4)制備的抗第二蛋白抗體中的抗 第一種蛋白的抗體，獲得能專一結合重組蛋白提取物中殘留雜蛋白的抗體。2. 權利要求1所述的特異性抗體，其特征在于在步驟1)和步驟4)之后進一步包括純 化免疫動物獲得的抗第一蛋白抗體和抗第二蛋白抗體的步驟。3. 權利要求1所述的特異性抗體，其特征在于必要時重復步驟3)和步驟6)。4. 權利要求1所述的特異性抗體，其特征在于所述重組蛋白通過植物表達系統表達。5. 權利要求4所述的特異性抗體，其特征在于所述重組蛋白為通過水稻胚乳細胞表達 的人血清白蛋白，所述第一種蛋白為人血清白蛋白，所述目的蛋白為基因工程重組人血清 白蛋白。6. 權利要求1~5任一項所述的特異性抗體在制備免疫檢測試劑中的應用，其中所述 免疫檢測試劑用于檢測基因工程重組蛋白提取物中的殘留雜蛋白。7. -種酶聯免疫檢測試劑，用于定量檢測基因工程重組蛋白提取物中的殘留雜蛋白， 其特征在于用專一結合重組蛋白提取物中的殘留雜蛋白的特異性抗體作為捕獲抗體包被 固相載體，以及用專一結合重組蛋白提取物中的殘留雜蛋白的特異性抗體作為檢測抗體 與標記物結合制備酶結合物； 其中所述重組蛋白提取物中含有目的蛋白和殘留雜蛋白，通過下述方法制備所述特異 性抗體： 1) 用第一種蛋白免疫動物，制備抗第一蛋白抗體，所述第一種蛋白為天然存在于生物 體的蛋白，所述目的蛋白與第一種蛋白具有相同的蛋白質結構和性質； 2) 將步驟1)獲得的抗第一蛋白抗體與親和層析介質偶聯，制備抗第一蛋白抗體-免疫 親和層析柱； 3) 用步驟2)制備的抗第一蛋白抗體-親和層析柱去除重組蛋白提取物中的目的蛋白， 獲得總宿主殘留雜蛋白； 4) 用步驟3)獲得的總宿主殘留雜蛋白作為第二種蛋白免疫動物，制備抗第二蛋白抗 體； 5) 將目的蛋白與親和層析介質偶聯，制備目的蛋白-免疫親和層析柱； 6) 用步驟5)制備的目的蛋白-免疫親和層析柱去除步驟4)制備的抗第二蛋白抗體中 的抗第一種蛋白的抗體，獲得能專一結合重組蛋白中殘留雜蛋白的特異性抗體。8. 權利要求7所述的酶聯免疫檢測試劑，其特征在于所述標記物選自辣根過氧化物酶 和/或生物素。9. 權利要求7所述的酶聯免疫檢測試劑，其特征在于所述重組蛋白為通過水稻胚乳細 胞表達的人血清白蛋白，所述第一種蛋白為人血清白蛋白，所述目的蛋白為基因工程重組 人血清白蛋白。10. 權利要求9所述的酶聯免疫檢測試劑，其特征在于所述能專一結合重組蛋白提取 物中殘留雜蛋白的特性抗體通過下述方法制備： i) 用人源血清白蛋白作為抗原免疫兔子，制備兔抗人血清白蛋白多克隆抗體并純化； ii) 將步驟i)制備的純化的兔抗人血清白蛋白多克隆抗體與親和層析介質偶聯，制備 免疫親和層析柱A ; iii) 用步驟ii)的免疫親和層析柱A從表達重組人血清白蛋白的基因工程水稻種子提 取物中分離和制備水稻種子總雜蛋白，通過親和層析去除重組人血清白蛋白，收集含總水 稻種子總雜蛋白的流出液； iv) 用步驟iii)獲得的含總雜蛋白的流出液免疫兔子，獲得抗基因工程水稻種子總雜 蛋白的多克隆抗體并純化； V)以重組人血清白蛋白與親和層析介質偶聯，制備親和層析柱B ; vi)用步驟V)的親和層析柱B對步驟iv)的獲得的抗基因工程水稻的種子總雜蛋白多 克隆抗體進行親和層析，去除痕跡的抗重組人血清白蛋白的抗體，收集流出物為專一結合 表達重組人血清白蛋白的基因工程水稻種子總提取物中總雜蛋白的特異性抗體。11. 權利要求9所述的酶聯免疫檢測試劑，其中步驟ii)和步驟V)所述的親和層析介 質為 CNBr-activatived SepharoseTM 4Fast Flow。12. 權利要求9所述的酶聯免疫檢測試劑，其中步驟i)所述的純化包括下述步驟： ia) 硫酸銨沉淀粗純化制備的兔抗人血清白蛋白多克隆抗體得到粗純液；以及 ib) 用proteinA親和層析純化粗純液獲得純化的多克隆抗體。13. 權利要求9所述的酶聯免疫檢測試劑，其中步驟iv)所述的純化包括用IgG層析柱 純化獲得的抗體基因工程水稻宿主蛋白的多克隆抗體。14. 權利要求9所述的免疫檢測試劑，其中所述捕獲抗體包被濃度為5~40 μ g/ml，檢 測抗體濃度為〇. 2~1. 6 μ g/ml，以辣根過氧化物酶標記檢測抗體。15. 權利要求14所述的免疫檢測試劑，其中所述捕獲抗體濃度為20 μ g/ml，檢測抗體 濃度為 〇. 8 μ g/ml.。16. 權利要求9所述的免疫檢測試劑，其中所述捕獲抗體包被濃度為2~16 μ g/ml，檢 測抗體濃度為0. 5 μ g/ml，以生物素標記檢測抗體后再與辣根過氧化物酶結合。17. 權利要求9所述的免疫檢測試劑，其中所述重組蛋白提取物中殘留雜蛋白含量為 2.5ng/ml - 25ng/ml〇
【文檔編號】G01N33/543GK105884886SQ201510037859
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年1月26日
【發明人】楊代常, 陳鎮, 劉靜茹
【申請人】武漢大學, 武漢禾元生物科技股份有限公司