一種胰島素類似物的化學合成方法
【專利摘要】本發明公開一種胰島素類似物的化學合成方法，包括片段合成、片段縮合、還原復性和純化四個步驟，將胰島素類似物的A鏈和B鏈分片段合成，第一個二硫鍵氧化時，將A鏈中Cys-Asn和B鏈先氧化在一起，由于Cys-Asn二肽價格低廉，分子間氧化時，二肽可大大過量，以提高分子間氧化效率，而在過量的氧化二肽，由于沒有其他活性基團，可用強還原途徑回收二肽，從而解決分子間二硫鍵氧化得率低的問題，通過片段縮合方法得到的AB鏈已經在一起的胰島素前體，其結構與C鏈在的情況下的胰島素類似，通過一定條件下的谷胱甘肽氧化-還原體系進行復性，得到得率很高的胰島素。
【專利說明】
一種胰島素類似物的化學合成方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種胰島素類似物的化學合成方法。
【背景技術】
[0002]糖尿病是一種常見的多發性代謝疾病，胰島素為重要的內分泌激素，是治療糖尿病的特效多肽激素化合物。而人胰島素容易出現血糖波動、注射時間不靈活等問題，為了解決這些問題，科學家通過改變人胰島素的分子局部結構，研發出了獲得更佳作用時間和作用效果的胰島素類似物。
[0003]現有胰島素類似物的合成方法以發酵法和合成法為主，發酵法是通過發酵合成胰島素原，再經還原復性，變成胰島素前體，用蛋白酶切除C鏈，變成胰島素，用化學合成的方法，加入修飾基團；缺點:由于胰島素上有3個反應活性氨基，所以在加入修飾基團的時候，很容易把3個活性反應氨基同時修飾，導致產品的得率低、純度低。
[0004]合成法:(I)胰島素合成的最早方法是中科院合成的結晶牛胰島素，常規的方法都是通過分別合成胰島素的A鏈和B鏈，然后通過還原復性的方法形成胰島素，但由于胰島素的復性過程需要C鏈參與；缺點:在缺少C鏈參與的反應情況下，復性的產率極低，無生產價值；(2)后續改進了合成工藝，通過分別采用不同的保護基團保護胰島素的6個半胱氨酸，然后采用一次脫保護的方法，形成3個二硫鍵；缺點:該方法合成胰島素得率太低，沒有實際生產價值，主要是因為3個二硫鍵通過化學方法氧化時需引入3種脫保護機制完全不同的保護基團，保護基團的價格昂貴，生產出來的產品成本高，另一方面，氧化過程需3次才完成，尤其在A鏈和B鏈二硫鍵環化的時候，由于是分子間環化，形成AA鏈、BB鏈、AB鏈的概率基本一致，造成得率偏低，雖然可以將AA鏈、BB鏈重新打開后再環化，但由于AA鏈和BB鏈都是大分子，在打開二硫鍵的同時會引入其它活性及軟的修飾，導致最后的合成失效。
【發明內容】
[0005]為了克服現有技術的缺陷，本發明的目的在于提供一種得率高、純度高、便于產業化生產的胰島素類似物的化學合成方法。
[0006]本發明的技術方案為:
一種胰島素類似物的化學合成方法，胰島素類似物包括A鏈和B鏈，其中A鏈序列為GIVEQCCTSICSLYQLENYCN, B 鏈序列為 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R) T，其合成步驟包括片段合成、片段縮合、還原復性和純化四個步驟:
(O片段合成:將A鏈序列分成CN片段、GIVEQCCTSICSLYQLENY片段分別合成，B鏈序列分成SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T片段、FVNQHLCG片段分別合成，CN片段采用液相合成二肽Cys-Asn，GIVEQCCTSICSLYQLENY片段采用Fmoc固相合成法合成保護多肽Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH, SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T 片段采用固相合成法合成N端保護側鏈游離的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T，FVNQHLCG片段采用Fomc固相合成法合成全保護多肽片段Boc-FVNQHLCG-COOH ；
(2)片段縮合:步驟(I)中Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T 游離的-SH和二肽Cys-Asn中游離的巰基通過二硫鍵氧化縮合成中間體1，中間體I和Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH通過酰胺鍵縮合成中間體2，中間體2通過脫保護劑脫去Fmoc之后再與Boc-FVNQHLCG-COOH縮合成中間體3，中間體3通過TFA脫去所有的保護基團得到膜島素前體；
(3)還原復性:將步驟(2)中胰島素類似物前體溶于谷胱甘肽的復性液中，復性1-5天，得到胰島素類似物粗品；
(4)純化:將步驟(3)得到的胰島素粗品再經過HPLC純化，得到高純度胰島素類似物。
[0007]優選的，其步驟(I)由以下步驟組成:
(al)用 Boc-Cys (Trt) -OH 和 Asn 液相合成二肽 Cys-Asn ；
(bl)提供一樹脂作為固相支持物，用Fmoc固相合成方法合成全保護的FmocSHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T，并用TFA裂解得到氨基端為Fmoc，側鏈游離的FmocSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T ；
(Cl)提供一樹脂作為固相支持物，用Fmoc固相合成方法合成全保護的Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH 片段；
(dl)提供一樹脂作為固相支持物，用FMOC固相合成方法合成全保護的Boc-FVNQHLCG-COOH 片段。
[0008]優選的，其步驟(2)由以下步驟組成:
(a2) N 端保護側鏈游離的 Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T 中游離的-SH 和 Cys-Asn中游離的巰基通過氧化劑氧化成二硫鍵，氧化縮合后的中間體I在反應液中析出，干燥后待用；
(b2)中間體I溶于DMF中，加入經步驟(cl)活化好的氨基端為保護基團Fmoc或Boc的GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH，反應12小時，加水析出中間體2，經硅膠柱一次純化，再加入一脫保護劑脫去保護基團Fmoc或Boc，經硅膠柱二次純化；
(c2)中間體2溶于DMF中，加入經步驟(dl)活化好的氨基端為保護基團Fmoc或Boc的FVNQHLCG-C00H，反應12小時，加水析出中間體3，經硅膠柱進行純化，再加入TFA脫去中間體3的所有保護基團，得到胰島素前體。
[0009]優選的，步驟(2)氧化縮合過程中Cys-Asn與N端保護側鏈游離的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T 的摩爾比介于 5:1 與 500:1 之間。
[0010]本發明的有益效果:采用過量的二肽方法，將A鏈中Cys-Asn和B鏈先氧化在一起，由于Cys-Asn 二肽價格低廉，分子間氧化時，二肽可大大過量，以提高環化效率，而在過量的環化二肽，由于沒有其他活性基團，可用強還原途徑回收二肽，從而解決分子間環化得率低的問題。
[0011]通過片段縮合方法得到的AB鏈已經在一起的胰島素前體，其結構與C鏈在的情況下的胰島素類似，通過用生物合成是相似的谷胱甘肽還原復性方法，得到得率很高的胰島素。
[0012]【具體實施方式】:
下面結合實施例對本發明作進一步說明: 當R= Myr時，表示該胰島素類似物為地特胰島素，其合成步驟包括片段合成、片段縮合、還原復性和純化四個步驟:
(一)片段合成
(1)A鏈序列CN片段合成:
取46.4克BOC-Cys (trt)溶于I升DMF中，加入11.5克H0SU，攪拌5分鐘，加入21克DCC,反應24個小時，過濾除去沉淀，加入10升冷水，析出產物，過濾干燥后，溶于I升DMF中；
取25克Asn，加入200ml水溶液，加入三乙胺調節PH=9，把ASN水溶液加入上述的I升DMF中，反應24個小時，加水析出沉淀，用硅膠柱純化，得到44.5克的BOC-Cys (trt)-Asn，將44.5克BOC-Cys (trt)-Asn加入I升50%TFA 二氯甲烷溶液，反應2個小時，用乙醚沉淀得到20克二肽Cys-Asn ；
(2)A 鏈序列 BOC-GIVEQCCTSICSLYQLENY 片段合成:
取100克2-cl Trt樹脂，用二氯甲烷溶脹后，加入溶于I升DMF中的Fmoc-Tyr(tbu)-0H138克，反應12個小時，用I升20%的哌啶DMF溶液，脫去Fmoc，取300克FMOC-Asn(trt) -0H,68克H0BTU61克TBTU，溶于I升DMF中，加入樹脂，反應4個小時，用I升20%的呢啶 DMF 溶液，脫去 fmoc ;依次將 Fmoc-Glu (otbu) -0H、Fmoc-Leu-0H、Fmoc-Gln (trt) -0H、Fmoc-Tyr (tbu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser (tbu)-OH、Fmoc-Cys (trt)-OH、Fmoc-1le-0H、Fmoc-Ser (tbu)-OH、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Gln (trt) _0H、Fmoc-Glu (otbu) -OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-1le-OH 和 Fmoc-Gly-OH 縮合的樹脂上，脫去Fmoc后，用110克B0C20溶于I升DMF中，加入樹脂，反應24個小時；將樹脂干燥后用5升3%TFA的二氯甲烷溶液，反應I個小時，得到143克全保護的多肽片段BOC-GIVEQCCTSICSLYQLENY ；
(3)B 鏈序列 SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(Myr)T 片段合成:
取100克wang樹脂，用二氯甲烷溶脹后，加入溶于I升DMF中的Fmoc-Thr (tbu)-OH200克、TBTU161克，反應12個小時，用I升20%的哌啶DMF溶液，脫去Fmoc ;取243克Fmoc-Lys (Myr)-OH^68克H0BTU61克TBTU,溶于I升DMF中，加入樹脂，反應4個小時后用I升20%的哌啶DMF溶液，脫去Fmoc ;依次將Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr (tbu)-OH、Fmoc-Tyr (tbu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Glu (otbu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys (trt) -OHn Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr (tbu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu (otbu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (trt)-OH 和 Fmoc-Ser (tbu)-OH 縮合的樹脂上，保留 Fmoc 基團；將樹脂干燥后用5升TFA裂解溶液，反應2個小時，乙醚沉淀后，用HPLC純化，得到側鏈游離的的多肽片段 FMOC-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (Myr) T47 克；
(4)B鏈序列BOC-FVNQHLCG片段合成:
取100克2-cl Trt樹脂，用二氯甲烷溶脹后，加入溶于I升DMF中的FM0C_Gly-0H89克，反應12個小時，用I升20%的哌啶DMF溶液，脫去Fmoc ;取293克Fmoc-Cys (trt)_0H、68克H0BT、161克TBTU，溶于I升DMF中，加入樹脂，反應4個小時后用I升20%的哌啶DMF溶液，脫去 Fmoc ;依次將 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His (trt)-OH、Fmoc- Gln(trt)-OH、Fmoc-Asn(trt )-0H、Fmoc-Val-OH 和 Fmoc-Phe-OH 縮合的樹脂上，脫去 Fmoc 后，用 110 克 B0C20 溶于I升DMF中，加入樹脂，反應24個小時；將樹脂干燥后用5升3%TFA的二氯甲烷溶液，反應I個小時，得到53克全保護的多肽片段BOC-FVNQHLCG ；
(二)片段縮合
(I )CN 與 FMOC-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (Myr) T 分子間二硫鍵氧化，稱取 20 克二肽 CN、10 克 FMOC-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (Myr) T，溶于 10mlDMF 中，加入 30mlDMS0，反應至無游離的FMOC-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(Myr)T為止，過濾沉淀，干燥后得到11.6克中間體I ;
(2)取全保護片段BOC-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH 9 克，溶于 500ml DMF 中，加入 DCCl克，H0SU0.9克，反應2個小時，過濾除去沉淀，將上清用水沉淀后干燥得到活化的全保護片段，將10克中間體I溶于200mlDMF中，加入三乙胺調節PH=9，加入活化好的全保護片段，反應24個小時，加水沉淀后干燥，用20%的哌啶脫去FM0C，用HPLC純化，得到15克中間體2 ；
(3)取全保護片段BOC-FVNQHLCG-C00H 6克，溶于500ml DMF中，加入I克DCC、0.9克H0SU，反應2個小時候，過濾除去沉淀，將上清用水沉淀后干燥得到活化的全保護片段，將15克中間體2溶于200mlDMF中，加入三乙胺調節PH=9，加入活化好的全保護片段，反應24個小時，加水沉淀后干燥，用TFA剪切液裂解，用HPLC純化，得到5.8克胰島素類似物前體；
(三)還原復性
將5.8克胰島素類似物前體溶于I升的谷胱甘肽復性液中，每隔12小時檢測復性完成情況，直至復性完成；
(四)純化
將復性完成的胰島素類似物，用高效液相色譜，進行純化，得到3.6克高純度的胰島素類似物-地特胰島素，純度為98.3%。
【主權項】
1.一種胰島素類似物的化學合成方法，所述胰島素類似物包括A鏈和B鏈，其中A鏈序列為 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN, B 鏈序列為 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T，R 為脂肪酸及其類似物包括但不限于(C8，C1, C12，C14，C16，C18)，Rl-Glu (OH)-OH，其特征在于:合成步驟包括片段合成、片段縮合、還原復性和純化四個步驟: (O片段合成:將A鏈序列分成CN片段、GIVEQCCTSICSLYQLENY片段分別合成，B鏈序列分成SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T片段、FVNQHLCG片段分別合成，所述CN片段采用液相合成二肽Cys-Asn，所述GIVEQCCTSICSLYQLENY片段采用Fmoc固相合成法合成全保護多肽 Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH，所述 SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T 片段采用固相合成法合成N端Fmoc保護側鏈游離的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T，所述FVNQHLCG片段采用Fomc固相合成法合成全保護多肽片段Boc-FVNQHLCG-COOH ; (2)片段縮合:步驟(I)中Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T 游離的-SH 和二肽Cys-Asn中游離的巰基通過二硫鍵氧化縮合成中間體I，所述中間體I和Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH通過酰胺鍵縮合成中間體2，所述中間體2通過脫保護劑脫去Fmoc之后再與Boc-FVNQHLCG-COOH縮合成中間體3，所述中間體3通過TFA脫去所有的保護基團得到胰島素類似物前體； (3)還原復性:將步驟(2)中胰島素類似物前體溶于谷胱甘肽的復性液中，復性1-5天，得到胰島素類似物粗品； (4)純化:將步驟(3)得到的胰島素粗品再經過HPLC純化，得到高純度胰島素類似物。2.根據權利要求1所述的一種胰島素類似物的化學合成方法，其特征在于:步驟(I)由以下步驟組成: (al)用 Boc-Cys (Trt) -OH 和 Asn 液相合成二肽 Cys-Asn ； (bl)提供一樹脂作為固相支持物，用Fmoc固相合成方法合成全保護的FmocSHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T，并用TFA裂解得到氨基端為Fmoc，側鏈游離的FmocSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T ； (Cl)提供一樹脂作為固相支持物，用Fmoc固相合成方法合成全保護的Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH 片段； (dl)提供一樹脂作為固相支持物，用FMOC固相合成方法合成全保護的Boc-FVNQHLCG-COOH 片段。3.根據權利要求1或2所述的一種胰島素類似物的化學合成方法，其特征在于:步驟(2)由以下步驟組成: (a2) N 端保護側鏈游離的 Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T 中游離的-SH 和 Cys-Asn中游離的巰基通過氧化劑氧化成二硫鍵，氧化縮合后的中間體I在反應液中析出，干燥后待用； (b2)將步驟(a2)得到的中間體I溶于DMF中，加入經步驟(cl)活化好的氨基端為保護基團Fmoc或Boc的GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH，反應12小時，加水析出中間體2，經硅膠柱一次純化，再加入一脫保護劑脫去保護基團Fmoc或Boc，經硅膠柱二次純化； (c2)將步驟(b2)得到中間體2溶于DMF中，加入經步驟(dl)活化好的氨基端為保護基團Fmoc或Boc的FVNQHLCG-C00H，反應12小時，加水析出中間體3，經硅膠柱進行純化，再加入TFA脫去所述中間體3的所有保護基團，得到胰島素前體。4.根據權利要求3所述的一種胰島素類似物的化學合成方法，其特征在于:所述步驟(2)氧化縮合過程中Cys-Asn與N端保護側鏈游離的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK (R) T的摩爾比介于5:1與500:1之間。
【文檔編號】C07K1/04GK105884879SQ201510037398
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年1月26日
【發明人】王宇
【申請人】漳州博欣生物技術有限公司