一種多肽在制備Nav1.5鈉通道工具試劑中的應用
【專利摘要】本發明公開了一種生物活性多肽在制備電壓門控鈉通道工具試劑?Nav1.5型鈉通道抑制劑中的應用方法，所述的生物活性多肽為蜘蛛抑鈉肽?IX（SPNP?IX），試驗驗證該活性多肽對Nav1.5型電壓門控鈉通道具有明顯的抑制作用。在制備電壓門控鈉通道亞型工具分子時，配制細胞外給藥的濃度為1 μmol/L。SPNP?IX的半數有效作用劑量IC50為450 nmol/L。SPNP?IX對Nav1.5型鈉通道的抑制呈現時間依從性，是一種較好的Nav1.5型鈉通道工具試劑。
【專利說明】
一種多肽在制備Na v1.5鈉通道工具試劑中的應用
技術領域
[0001]發明涉及一種活性多肽在制備離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1x(簡寫為SPNP-1X)在制備電壓門控鈉通道工具試劑-Navl.5型鈉通道抑制劑中的用途。
【背景技術】
[0002]電壓門控鈉通道廣泛分布于神經元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結構蛋白，其參與調節神經遞質的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程，同時也是治療藥物作用的重要靶標之一。鈉通道在動作電位的產生和傳播過程中的關鍵性作用，電壓門控鈉通道成為很多動植物毒素的作用靶標。鈉離子通道的結構與功能關系研究已經成為國際上的研究熱點。電壓門控鈉通道很可能成為神經性和心血管等疾病的重要治療靶點。自然界的動物毒素是一類具有很高實用價值和應用前景的工具試劑或藥物導向物質，不僅是有毒動物抵御天敵的有力武器，也是從事神經生物學和生理學研究、天然創新藥物開發以及蛋白質基礎研究的寶貴材料，同時也是研究離子通道的獨特“分子探針和解密器”。迄今為止，從多種動物(如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動物等)的毒液中鑒定到了很多作用于鈉通道的活性成分。它們通過與鈉通道的不同位置相結合從而引起通道的動力學特征發生相應的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過闡述這些特異性調制劑作用于鈉通道的分子機制，除了在理論上可深入推測鈉通道亞型之間的功能活動區別和門控活動機制外，還可以為將它們開發成治療人類相關疾病的新藥提供充分的理論基礎和廣闊的應用前景。
[0003]
【發明內容】
[0004]本發明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X在制備電壓門控鈉通道工具試劑-Navl.5型鈉通道抑制劑的應用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽_IX(簡寫為SPNP-1X)，其氨基酸序列為:
NH2~G1u Cys Thr Lys Leu Leu Gly Gly Cys Thr Lys Asp Ser Glu Cys Cys ProHis Leu Gly Cys Arg Lys Lys Trp Pro Tyr His Cys Gly Trp Asp Gly Thr Phe-
NH2,
其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組份用于制備Navl.5型鈉通道抑制劑。
[0005]所述的蜘蛛抑鈉肽-1X的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。
[0006]該蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組分用于制備Navl.5型鈉通道抑制劑，以細胞外給藥的方式制備成Navl.5型鈉通道工具試劑。
[0007]蜘蛛抑鈉肽-1X在制備Navl.5型鈉通道工具試劑或抑制劑時，配制細胞外給藥的劑量為I ymol/L。
[0008]蜘蛛抑鈉肽-1X抑制Navl.5型鈉通道的半數有效作用劑量IC5q為450 nmol/L0
[0009]蜘蛛抑鈉肽-1X對Navl.5型鈉通道的抑制呈現時間依從性，是一種較好的Navl.5型鈉通道工具試劑。
【附圖說明】
[0010]圖1是I μπιοΙ/L SPNP-1X對大鼠DRG神經元上Navl.5型鈉通道的影響。
[0011]圖2是SPNP-1X作用于大鼠DRG細胞Nav1.5鈉通道的時間-效應關系曲線。
[0012]圖3是SPNP-1X作用于大鼠DRG細胞Navl.5鈉通道的濃度-效應關系曲線。
[0013]圖4是SPNP-1X對大鼠DRG細胞Navl.5鈉通道電流-電壓關系的影響。
[0014]圖5是SPNP-1X對大鼠DRG細胞Navl.5鈉通道的穩態失活動力學的影響。
【具體實施方式】
[0015]為了更好的理解和更充分公開本發明，下面將通過細胞外給藥途徑，采用轉染HEK293T細胞模型來說明蜘蛛抑鈉肽-1X的Navl.5型鈉通道抑制作用。
[0016]
1、實驗材料和方法
1.1人胚腎細胞(HEK293T)的培養及轉染
HEK293T細胞適應酸性環境，pH值在6.9?7.1時，可順利貼壁生長，換液時動作要輕。一般用高糖的DMEM培養基。
[0017]1.1.1細胞的傳代培養
(I) HEK293細胞傳代時機為達80-90%匯合，待細胞在60mm培養皿中長滿后，吸掉培養液。
[0018](2)加適量PBS漂洗兩次，吸掉。
[0019](3)加0.5mL 0.25%胰酶，搖勻。37°C培養箱中胰酶處理2_3min。于顯微鏡下觀察細胞是否全部脫壁。加入適量10%新生牛血清DMEM培養液終止胰酶反應。
[0020](4)用移液管將細胞團輕輕吸打成單個細胞。將細胞按1:3平均分入裝有預熱培養液的培養皿中，于37°C、5% C02、15%相對濕度培養箱中培養。
[0021 ] 1.1.2陽離子性的脂質體法轉染方法:
(I)在轉染前一天，對于35mm培養皿，每皿用2mL不含抗生素的培養液培養。
[0022](2)轉染的當天，細胞密度最好達到80-90%，吸掉舊培養液，PBS漂洗一次，換成2mL無血清op t 1-MEM培養液。
[0023](3)每皿DNA用量為4ug，用無血清無血清opt1-MEM培養液分別稀釋到250UL，輕輕混勻，室溫靜置5min。
[0024](4)同時將1yL脂質體加入250HL無血清opt1-MEM培養液中，輕輕混勻，室溫靜置5min0
[0025](5)將稀釋的脂質體加入等體積DNA混勻，室溫靜置20min。
[0026](6)將0.5mLDNA/脂質體復合物輕輕混勻，滴加入細胞中，輕輕混勻，常規條件培養。
[0027](7)讓DNA/脂質體復合物與細胞接觸4-6h后，換成10%新生牛血清DMEM培養液培養。24-72h內可以進行膜片鉗實驗。
[0028]1.2膜片鉗電生理活性實驗
膜片鉗實驗均在室溫(25±1°C)進行，采用全細胞膜片鉗技術。挑選質膜光滑可見、胞質均勻的有綠色熒光的HEK293T細胞作為實驗細胞。電流記錄通過全細胞膜片鉗技術利用EPC9放大器(HEKA公司，German)在電腦上進行。計算機記錄和分析系統采用Pulse+Pulsefit 8.0軟件。玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細管(南京泉水教學實驗器材廠)。玻璃電極兩步拉制而成，經拋光儀(Narishige,Japan)拋光后電極尖端直徑約為3 μπι，充灌電極液后電極電阻為1-3ΜΩ。膜片鉗實驗要在室溫條件下進行，整個實驗過程中溫度的變動最多上下不超過2°C。采用SigmaPlot 9.0軟件分析實驗結果。
[0029]
2、實驗結果與分析
2.1 SPNP-1X對Navl.5型電壓門控鈉通道的影響
運用全細胞膜片鉗技術，我們研究了SPNP-1X對瞬時表達于HEK293T細胞的鈉通道亞型Navl.5的抑制作用。鈉通道亞型電流以同一種去極化方式誘導:將細胞膜電位鉗制在-80mV，以50 ms的時程給予一測試電壓_10mV，每隔5 s重復一次。
[0030]如圖1所示，I μΜ SPNP-1X對Navl.5通道有一定的抑制作用，其抑制程度分別為79.6 ± 3.5%(η=5 )。SPNP-1X對Nav1.5通道的抑制作用呈現明顯的時間依從性，當毒素濃度為I μΜ時，約在I min左右的時間達到最大抑制。I μΜ SPNP-1X抑制Navl.5通道的時間常數為14 s (圖2 )。如圖3所示，SPNP-1X對Nav1.5通道的抑制作用呈現明顯的濃度依從性，半數有效抑制濃度(IC5q)是450 ηΜ。當劑量曲線用Hill公式擬合時，可得出SPNP-1X抑制Navl.5通道的濃度效應曲線的Hill常數，它的大小為1.21。
[0031]2.2 SPNP-1X對Navl.5型電壓門控鈉通道激活狀態的影響
在全細胞電壓鉗模式下，將細胞鉗制在-100 mV時，分別給予一系列測試電壓，其變化范圍為-80?+60 mV，持續時間為50 ms，步幅為+10 mV，我們進一步檢測了 SPNP-1X對Navl.5通道1-V曲線的影響，探究其對鈉通道亞型激活過程的影響，結果如圖4所示。空白對照條件下，當細胞膜電位鉗制在-100 mV時，Navl.5通道的起始激活電壓為-70 mV，最大電流峰值激活電壓為-40 mV。在細胞周圍加入SPNP-1X，毒素與細胞作用3 min后，再以相同的去極化脈沖誘導1-V曲線，結果發現SPNP-1X能使Navl.5鈉通道的起始激活電位和峰值電流激活電壓向去極化方向漂移約+10 mV，但反轉電位變化不明顯，說明毒素與通道的相互作用沒有改變通道對離子通透的選擇性。
[0032]2.3 SPNP-1X對Navl.5型電壓門控鈉通道穩態失活的影響
我們運用一標準雙脈沖刺激方式，進一步觀察了 SPNP-1X對Navl.5通道穩態失活特征的影響。結果如圖5，對于Navl.5通道，對照條件下，V1/2為-88.1 ±0.9 mV(n=6)，加SPNP-1X后，V1/2變為-93.5 ±0.8 mV(n=7)。結果表明SPNP-1X能導致Navl.5的穩態失活曲線往超極化漂移約5 mV，而且沒有明顯改變Navl.5通道對照曲線的斜率。
【主權項】
1.一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X在制備電壓門控鈉通道工具試劑-Navl.5型鈉通道抑制劑中的應用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X(簡寫為SPNP-1X)，其氨基酸序列為: Mfe-Glu Cys Thr Lys Leu Leu Gly Gly Cys Thr Lys Asp Ser Glu Cys Cys Pro His Leu Gly Cys Arg Lys Lys Trp Pro Tyr His Cys Gly Trp Asp Gly Thr Phe-NH2, 其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組份用于制備Navl.5型鈉通道抑制劑。2.根據權利要求1所述的一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-1X在制備電壓門控鈉通道工具試劑-Navl.5型鈉通道抑制劑中的應用，其特征在于，所述的蜘蛛抑鈉肽-1X的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，N端第15位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。3.根據權利要求1或2所述的應用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X作為單一有效活性組分用于制備Navl.5型鈉通道抑制劑。4.根據權利要求1或2所述的應用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X制備成細胞外給藥的Navl.5型鈉通道工具試劑。5.根據權利要求1或2所述的應用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X在制備Navl.5型鈉通道工具試劑或抑制劑時，配制細胞外給藥的劑量為I ymol/L。6.根據權利要求1或2所述的應用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X的半數有效作用劑量IC5Q為450 nmol/Lο7.根據權利要求1或2所述的應用方法，其特征在于，蜘蛛抑鈉肽-1X的作用是時間依賴的。
【文檔編號】C07K14/435GK105884877SQ201610249787
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月20日
【發明人】鄧梅春, 羅旋
【申請人】長沙沁才生物科技有限公司