LPNISKP修飾的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸,其制備,納米結構,活性及應用

LPNISKP修飾的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸,其制備,納米結構,活性及應用
【專利摘要】本發明公開了下面結構的LPNISKP修飾的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸，LPNISKP是結構中Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro，Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的正規縮寫，公開了它的制備方法，公開了它的納米結構，公開了它抗腫瘤細胞粘附的作用，公開了它抗腫瘤細胞侵襲的作用，公開了它抗腫瘤細胞遷移的作用，公開了它的抗腫瘤作用，進一步公開了它抑制腫瘤向肺轉移的作用。因而本發明公開了它在醫學中的應用。
【專利說明】
LPNISKP修飾的1 -乙酰基-β -咔啉酰-色氨酸，其制備， 納米結構，活性及應用
技術領域
[0001] 本發明涉及1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro。涉 及它的制備方法，涉及它的納米結構，涉及它的抗腫瘤作用，涉及它抗腫瘤轉移作用，涉及 它的抗腫瘤細胞粘附侵襲和迀移作用。因而本發明涉及它在制備抗腫瘤藥物，制備抗腫瘤 轉移藥物，及抗腫瘤細胞迀移粘附和侵襲藥物中的應用。本發明屬于生物醫藥領域。
【背景技術】
[0002] 人們從天然的植物中提取了 β -咔啉類化合物，這是一類吲哚類生物堿。其具有 多種生物學活性，具有明確的抗腫瘤活性。用于肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌、乳腺癌等多種癌 癥的治療。然而咔啉類化合物作為傳統的細胞毒性化合物，其對于腫瘤細胞的選擇性 較差。隨著基因學和分子生物學的研究深入在分子水平篩選對腫瘤細胞選擇性高，特異性 強的低毒藥物成為了抗腫瘤藥物發展的新方向。近年來人們對咔啉類化合物做了大量 的修飾工作，合成了許多β-咔啉類化合的衍生物。然而這些修飾效果都不顯著。其中1位 引入乙酰基，3位引入色氨酸芐酯得到的化合物，其體內抗腫瘤活性和體外細胞毒活性顯著 優于單純平面環的β-咔啉類化合物。然而，該類化合物對正常細胞毒性較大，水溶性差， 對腫瘤細胞的特異性殺傷能力有限。因此，這種修飾的局限性仍是十分明顯的。
[0003] RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素 α ν β 3的阻斷劑，具有抗血栓和抗細胞 粘附活性。ΚΕ二肽，LDV三肽以及LPNISKP七肽也通過阻斷整合素家族的其他受體對腫瘤 細胞的粘附轉移起到明顯的抑制作用。盡管發明人付出了大量研究精力，篩選了數百種化 合物，一直沒有得到同時具有抗腫瘤和抗腫瘤粘附浸潤和迀移作用的化合物。
[0004] 發明人在分析數百種化合物的結構及活性變化的基礎上，認識到將 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro與1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酸偶聯，形成的1-乙酰 基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro會同時具有抗腫瘤，抗腫瘤轉移 和抗腫瘤細胞粘附浸潤和迀移作用。基于如此認識，發明人提出本發明。

【發明內容】

[0005] 本發明的第一個內容是提供下面結構的1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酉先-Leu-Pr〇-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro〇
[0006]
[0007] 本發明的第二個內容是提供1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的制備方法，該方法由以下步驟構成：
[0008] (1)室溫下L-Trp-〇Me與1，3-二羥基丙酮在稀鹽酸中反應48h，過濾得到濾餅。 濾餅溶解于二氧六環溶液。在冰鹽浴下用2NNa0H調節pH = 12,反應10h，得到1-乙酰 基-β -咔啉酰-3-羧酸；
[0009] (2) 1-乙酰基-β -咔啉酰-3-羧酸與L-Trp-OBz 1偶聯并皂化制備1-乙酰 基-β-咔啉酰-3-色氨酸；
[0010] (3)將 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl 與 1-乙酰基-β - 啉 酰-3-色氨酸偶聯，制備1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc )-Pr〇-〇Bzl；
[0011] (4)將 1-乙酰基-β - 啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) -Pr〇-〇 Bzl脫保護，制備1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pr〇-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro〇
[0012] 本發明的第三個內容是評價1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro 抗細胞增殖的活性。
[0013] 本發明的第四個內容是評價1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro對S180小鼠腫瘤增長的抑制作用。
[0014] 本發明的第五個內容是評價1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro抗腫瘤細胞粘附，侵襲和迀移的作用。
[0015] 本發明的第六個內容是評價1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨 酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro 抗腫瘤轉移的作用。
【附圖說明】
[0016] 圖1. 1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的合成路 線· i)CH30H，S0C12, ii)DHA，HC1 ;iii)2N NaOH，二氧六環；iv)Trp-〇Bzl，DCC，HOBt，NMM ; v)2N NaOH，THF ;vi)DCC，HOBt，NMM ;TFA/TFSA。
[0017] 圖2. 1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro在水溶液 中1 X 10 9M濃度下的透射電鏡照片。
【具體實施方式】
[0018] 為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。
[0019] 實施例1制備1-乙酰基-β -咔啉-3-羧酸甲酯
[0020] 稱取5g L-Trp-〇Me于100ml茄瓶中，加入10ml 37°C溫水攪拌溶解，加入3. 3g 1， 3-二羥基丙酮。室溫反應36h，離心，棄去水層，沉淀晾干，得到lg(收率20% )標題化合 物，為棕色固體，待用。ESI-MS(m/e) :257[M+H]+。
[0021] 實施例2制備1 -乙酰基-β -咔啉-3-羧酸
[0022] 稱取5g 1-乙酰基-β -咔啉-3-羧酸甲酯于250ml茄瓶中，加入二氧六環溶解，冰 浴緩慢加入2N NaOH水溶液調節pHl2，反應13h。反應液用飽和KHS04水溶液調節pH8，減壓 濃縮。殘留物用飽和KHS0 4調節pH2,有機層用乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得到4g (80% ) 標題化合物，為棕黃色固體。ESI-MS(m/e) :241[M-H]。
[0023] 實施例3制備1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨酸芐酯
[0024] 稱取2g 1-乙酰基-β -咔啉-3-羧酸，用10ml無水THF溶解，冰浴下加入2g DCC， 1. 2g HOBt，攪拌30min，得溶液A。3. 2g Trp-OBzl溶于15ml無水THF，緩慢加入N-甲基嗎 啉調節溶液PH9,得溶液B。冰浴下將B液緩慢加入A液當中，用N-甲基嗎啉調節pH9,反 應12h，TLC顯示原料消失（石油醚：丙酮=4 : 1)。反應混合物過濾，濾液減壓濃縮，殘留 物用乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得到的4. 38g糖漿狀產物用石油醚/丙酮體系干柱層析 純化（石油醚/丙酮=4/1)得到2g(46% )標題化合物，為黃色固體產率。ESI-MS(m/e): 531[M+H]+〇
[0025] 實施例4制備1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨酸
[0026] 稱取2g 1-乙酰基-β -咔啉-3-酰基-Trp-OBzl，無水THF溶解。冰浴下加入2Ν NaOH水溶液，調節pH12,反應1. 5h。TLC顯示原料點消失（石油醚/丙酮=2/1)，反應液用 飽和KHS04水溶液調節pH8,減壓濃縮，殘留物用飽和KHS0 4調節pH2,有機層用乙酸乙酯萃 取3次，減壓濃縮，得到1. 5g(90% ) 1化合物，為黃色固體。ESI-MS(m/e) :529[M-H]。
[0027] 實施例 5 制備 Boc-Leu-Pro-OBzl
[0028] 按照實施例 3 的方法由 2. 5g (10. 82mmol) Boc-Leu 和 2. 5g (10. 35mmol) HC1 · Pro-OBzl 得到 3. lg(73% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e) :418[M+H]+。
[0029] 實施例 6 制備 Boc-Leu-Pro
[0030] 按照實施例 4 的方法由 5. 00g(11. %mmol)Boc-Leu-Pro-OBzl 得到 2· 9〇g(74% ) 標題化合物。ESI-MS(m/e) :328 [Μ-Η]。
[0031] 實施例 7 制備 Boc-Asn-Ile-〇Bzl
[0032] 按照實施例 3 的方法由 4. 00g (17. 24mmol) Boc-Asn 和 6. 50g (16. 54mmol) TosH · Ile-〇Bzl 得到 5. 58g(80% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e) :436[M+H]+。
[0033] 實施例 8 制備 HC1 · Asn-Ile-〇Bzl
[0034] 將 6. 00g(13. 79mmol)Boc-Asn-Ile-0Bzl 溶解在 75mL 氯化氫-乙酸乙酯（4N)溶 液中，冰鹽浴攪拌2小時，TLC監測（二氯甲烷：甲醇=25 : 1)顯示原料點消失，減壓濃縮 除去乙酸乙酯，殘留物少量乙醚進行磨洗并減壓濃縮，此操作重復3次。得到4. 8g(94% ) 標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e) :336 [M+H]+。
[0035] 實施例 9 制備 Boc-Leu_Pr〇-Asn-Ile-〇Bzl
[0036] 按照實施例 3 的方法由 4. 70g (14. 33mmol) Boc-Leu-Pro 和 4. 7g (12. 63mmol) HCl.Asn-Ile-〇Bzl 反應得到 5.23g(64%)目標物，為無色固體。ESI-MS(m/e) :646[M+H] +。
[0037] 實施例 10 制備 Boc-Leu-Pro-Asn-Ile
[0038] 按照實施例 4 的方法由 5. 23g(8. llmmol)Boc-Leu-Pr〇-Asn-Ile-〇Bzl 得至丨J 4. 15g(92% )標題化合物。ESI-MS(m/e) :554[M-H]。
[0039] 實施例 11 制備 Boc-Lys (Fmoc)-Pro-OBzl
[0040] 按照實施例 3 的方法由 5. 00g(10. 68mmol)Boc-Lys (Fmoc)和 2. 7g(13. 08mmol) HC1 · P-〇Bzl 得到 4. 5g(63% )標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e) :654. 8[M+H]+。
[0041] 實施例 12 制備 HC1 · Lys (Fmoc) -Pro-OBzl
[0042] 按照實施例 8 的方法由 10.0 Og (14. 84mmol) Boc-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl 得到 8. 3g(92%)標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e) :554[M+H]+。
[0043] 實施例 13 制備 Boc-Ser-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl
[0044] 按照實施例 3 的方法由 9. 05g (14. 83mmol) HC1 · Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl 和 2. 90g(14. 16mmol)Boc-Ser 得到 4. 21g(40% )標題化合物，為無色油狀物。ESI-MS(m/e): 758[M+H]+。
[0045] 實施例 14 制備 HC1 · Ser-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl
[0046] 按照實施例 8 的方法由 2. OOg (2. 63mmol) Boc-Ser-Lys (Fmoc) -Pr〇-〇Bzl 得到 1.5g(83%)標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e) :658[M-H]。
[0047] 實施例 15 制備 Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl
[0048] 按照實施例 3 的方法由 1. 5g (2. 70mmol) Boc-Leu-Pro-Asn-Ile 和 1. 97g(2. 82mmol)HCl ·3θγ-Ι^8(Ρπιο〇)-Ρ;γ〇-〇Βζ1 得到 810mg(26% )標題化合物，為無色油 狀物。ESI-MS (m/e) :1179 [M+H]+。
[0049] 實施例 16 制備 HC1 · Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc)-Pr〇-〇Bzl
[0050] 按照實施例 8 的方法由 450mg (0· 38mmol) Boc-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc)-Pro-OBzl 得到 400mg(934%)標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e) :1117[M+H]+。
[0051] 實施例 17 制備 1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc )-Pr〇-〇Bzl
[0052] 按照實施例3的方法由160mg (0· 364mmol) 1-乙酰基-β -咔啉-3-酰基-Trp和 426mg HC1 · Leu-Pr〇-Asn-Ile-Ser_Lys(Fmoc)-Pr〇-〇Bzl 得 150mg (產率 22% )標題化合 物，為淡黃色固體。ESI-MS(m/e) :1503[M+H]+。
[0053] 實施例18制備1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-P ro (2)
[0054] 稱取 200mg 1-乙酰基-β -味啉酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) -P ro-OBzl于250ml茄瓶中，冰浴攪拌下依次加入4ml三氟甲磺酸和lml三氟乙酸，冰浴攪拌 1小時，反應結束。冰浴攪拌下加入50ml無水乙醚，析出黃色絮狀固體，離心，乙醚洗3次， 得黃色固體，冰浴下將其溶于2ml蒸餾水，滴加1 %氨水調至pH = 5,減壓過濾除去不溶物， 濾液減壓濃縮，殘留物經C18柱層析純化（甲醇：水=8 : 1)，得到31mg(20% )標題化 合物，為淡黃色固體。ESI-MS(m/e) :1189[M-H]-.Mp :195. 2-196. 7°C;[a ]D25= -25. l(c = 0· 08, CH30H). 4 NMR(300MHz，DMS0-d6) : δ /ppm = 10. 94(s，1H)，9· 05(s，1H)，8· 53(d，J = 9Hz，3H)，8. 44(d，J = 9. 0Hz，1H)，8. 23(d，J = 9. 0Hz，1H)，8. 08(d，J = 9. 0Hz，1H)，7. 95(s， 1H)，7. 82(d，J = 9. 0Hz，1H)，7. 75(d，J = 9Hz，1H)，7. 64(m，3H)，7. 48(s，1H)，7. 32(m，2H)， 7. 24 (s，1H)，7. 02 (m，2H)，6. 87 (m，1H)，4. 92 (m，1H)，4. 72 (m，1H)，4. 54 (m，2H)，4. 30 (m，1H)， 4· 23 (m，1H)，4· 12 (m，1H)，3· 80 (m，2H)，3· 61 (m，5H)，3· 50 (m，4H)，2· 89 (s，3H)，2· 72 (s，2H)， 2. 68 (s，2H)，1. 98 (m，2H)，1. 94 (m，3H)，1. 86 (m，4H)，1. 61 (m，8H)，1. 39 (m，2H)，1. 24 (m，1H)， 1.08〇11，1!1)，0.91(111，6!1)，0.80(111，6!1);冊1^：純度為95.0%，乙腈：水=1:1.5。波長 280nm，流速 0· 8ml/min。
[0055] 實驗例1測定化合物2的透射電鏡照片
[0056] 將化合物2按照1 X 10 9M的濃度配置化合物的水溶液，均勻的鋪在銅網上，在透射 電鏡（TEM，JEM-1230, JE0L)下觀察化合物的自組裝性質。得到的照片如圖2。結果表明， 化合物2在水中均可形成納米顆粒，直徑為47-58nm。
[0057] 實驗例2測定化合物2的細胞毒作用
[0058] 1)本發明的化合物2用含0. 1 % DMS0的培養基配制成所需濃度；
[0059] 2)實驗用的腫瘤細胞為SH-SY5Y (人神經母細胞瘤細胞），HL60 (人早幼粒細胞白 血病細胞），HeLa (人宮頸癌細胞），S180 (鼠腹水瘤細胞），HeCaT (人永生化表皮細胞）；
[0060] 3)HL60 和 S180 細胞株采用 RPMI-1640 培養基進行培養。HeLa、SH-SY5Y、HeCaT 三 株細胞采用DMEM培養基進行培養。培養基中均含10 %經滅活的胎牛血清和1 X 105U/L青 霉素和100mg/L鏈霉素。
[0061] 4)貼壁細胞的培養方法：分別將處于對數生長期且生長狀態良好的HeLa、 3^￥5￥、他031'細胞以5\10 4個/11^的密度接種于96孔板，每孔10(^1^37.5°(：、5%〇)2 培養箱中培養8-10h，按預設的濃度梯度加入受試樣品（受試樣品經過預先滅菌），對照組 加入等體積的溶解樣品的溶劑。繼續培養48h (24h觀察細胞狀態），每孔加25 μ L濃度為 5mg/mL的ΜΤΤ溶液，置于37。。孵育四個小時，排槍小心吸去上清液后每孔加入100 μ L的二 甲基亞砜（DMS0)，振蕩約15min溶解沉淀。立即于酶標儀上檢測0. D.(吸光度）值，波長 490nm〇
[0062] 5)懸浮細胞的培養方法：分別將處于對數生長期且生長狀態良好的HL60和S180 細胞以5 X 104個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μ L，37. 5 °C、5 % C0 2培養箱中培養 8-10h，按預設的濃度梯度加入受試樣品（受試樣品經過預先滅菌），對照組加入等體積的 溶解樣品的溶劑。繼續培養48h (24h觀察細胞狀態），每孔加25 μ L濃度為5mg/mL的MTT 溶液，置于37°C孵育4h，離心，3000rpm，5min，排槍小心吸去上清液后每孔加入100 μ L的二 甲基亞砜（DMS0)，振蕩約15min溶解沉淀。立即于酶標儀上檢測0. D.(吸光度）值，波長 490nm〇
[0063] 6)按照以下計算公式求出每個樣品濃度下的樣品對腫瘤細胞的抑制率：
[0064] 生長抑制率=[(空白組平均O.D.值-樣品組平均O.D.值）/空白組平均 O.D.值]X 100%，每個濃度下實驗重復三次，取平均值。平均抑制率對藥物濃度作圖，并求 出IC5。值（半數抑制濃度），結果列入表1。化合物2抑制5種腫瘤細胞增殖的1C 5。大于 100 μ M，沒有細胞毒作用。
[0065] 表1化合物2的抗腫瘤細胞增殖活性IC5。（ i ± SD μΜ)
[0066]
[0067] 實驗例3評價化合物2的抗腫瘤活性
[0068] 受試化合物：1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨酸芐酯，化合物2 ;
[0069] 陽性對照藥：阿霉素；
[0070] 實驗動物：ICR小鼠，雄性，體重20±2g(x土SD);北京維通利華動物實驗技術有限 公司提供。給藥組每組12只小鼠，空白及陽性對照組每組各15只小鼠。
[0071] 瘤源：小鼠 S180肉瘤，北京大學醫學部動物實驗中心提供，自行傳代維持。
[0072] 溶劑：受試化合物懸浮于0. 5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa)溶液。阿霉素溶于生理 鹽水。
[0073] 化合物2組的S180小鼠口服給藥，每天給藥一次，劑量為0. 1 μ mol/kg，連續給藥 10天。陰性對照組的S180小鼠口服生理鹽水，每次0.2mL/只，連續給10天。陽性對照組 的S180小鼠腹腔注射阿霉素，每天給藥一次，劑量為2 μ mol/kg，連續給藥10天。
[0074] 采用自行傳代的S180腹水瘤模型小鼠，取小鼠腹水S180瘤液，離心、去除雜質 后，接種于健康小鼠腋下，構建S180實體瘤模型：在無菌條件下，處死腹水瘤小鼠，于75% 酒精中浸泡l〇min消毒，取出小鼠于表面皿中晾干酒精，打開腹腔，抽取接種7天后生長旺 盛S180腹水瘤瘤液，用生理鹽水稀釋成（瘤液：生理鹽水=1 : 2)的液體，混合，離心 5min (1000轉），去除細胞碎片，取細胞液于生理鹽水中，用新鮮配制的0. 2%臺盼藍染色， 混勻后按細胞計數方法計數，染藍色者為死細胞，不染色者為活細胞，按如下公式計算細胞 濃度和細胞存活率；
[0075] 細胞濃度=4大方格內活細胞數/4X 104X稀釋倍數=細胞數/mL ;
[0076] 細胞存活率=活細胞數八活細胞數+死細胞數）X 100% ;
[0077] 將存活率大于90%的瘤液用勻漿法制備成IX 107個/mL的細胞懸液，于健康小鼠 腋皮下接種〇. 2mL/只，小鼠體重為20±2g。
[0078] 每天觀察各給藥組動物的反應：小鼠的自主活動能力、精神狀態、毛發顏色、呼吸 狀態、飲食情況、糞便性狀。
[0079] 每組連續給藥7天后，于第8天稱取小鼠體重，乙醚麻醉并脫頸椎處死，然后用鑷 子固定小鼠右腋腫瘤生長部位，剪開皮膚使腫瘤完全暴露，鈍性剝離，稱瘤重，以7 ±SD g 表示，結果列入表2。數據統計均采用t檢驗和方差分析。
[0080] 可以看出，在阿霉素的給藥劑量為2 μ mol/kg，化合物2的給藥劑量為0. 1 μ mol/ kg時對治療小鼠的瘤重有等同的影響。可見，化合物2的抗腫瘤作用比阿霉素強20倍。
[0081] 表2化合物2對S180荷瘤小鼠瘤重的影響
[0082]
[0083] η = 12 ;a)與生理鹽水組比 P < 0.01，與阿霉素（2ymol/kg)比 P > 0.05.
[0084] 實驗例4化合物2抗腫瘤細胞粘附的活性
[0085] 1)受試樣品
[0086] 化合物2用含0· 1 % DMS0的DMEM培養基配制成100 μ Μ濃度。
[0087] 2)細胞株
[0088] 高轉移的HCC-LM3細胞。
[0089] 3)主要試劑
[0090] DMEM培養基干粉：購自Gibco公司；
[0091] PBS 緩沖液：每 1L 溶液中含有 NaCl 8. 2g、KC1 0· 2g、Na2HP04 · H20 1. 56g、 KH2P040 . 2g，PH 值 7. 4 ;
[0092] 胎牛血清：購自Hyclone公司；
[0093] 0· 25%胰酶溶液：購自Hyclone公司；
[0094] 青霉素、鏈霉素：購自石藥集團中諾藥業（石家莊）有限公司；
[0095] MTT (四噻唑藍）：購自solarbio公司，溶于PBS溶液中，制成5mg/mL的溶液，過濾 除菌后使用，避光保存；
[0096] DMS0(二甲基亞諷）：購自Hyclone公司；
[0097] Fn (人纖維連接蛋白）：購自Sigma公司。
[0098] 4)實驗方法
[0099] 用PBS配制100 μ g/mL的Fn溶液，按100 μ L/孔加入96孔培養板中，將培養板置 于4°C冰箱過夜。次日，吸除未包被的Fn溶液，用PBS洗一次，每孔加入含2% FBS的PBS溶 液30 μ L封板，在37°C和5% 0)2的培養箱中孵育3小時，棄去各孔溶液。將生長狀態良好、 處于對數生長期的HCC-LM3細胞以5 X 104個/mL的密度接種于包被Fn的96孔板中，每孔 100 μ L，同時加入25 μ L化合物的溶液2,使其終濃度為20nM，在37°C、5% C02培養箱中培 養2小時，用PBS洗去未粘附的細胞，棄去PBS后每孔加25 μ L濃度為5mg/mL的MTT溶液， 置于37°C、5% C02培養箱中孵育4個小時，小心除去上清液后每孔加入100 μ L的DMS0,振 蕩約10min溶解沉淀，立即于酶標儀570nm波長下檢測0. D.(吸光度）值。粘附抑制率的 計算公式如下：粘附抑制率（％ ) = [l-(2a-c組細胞0D值/空白組細胞0D值）]X 100%; 實驗數據統計均采用t檢驗和方差分析，粘附抑制率以& ±SD)表示。
[0100] 6)實驗結果
[0101] 化合物2的抗細胞粘附實驗結果列入表3。從結果中可以看出，化合物2在2 μΜ 時有較弱的抗HCC-LM3細胞與FN粘附的作用，當濃度增大到20 μ Μ時，化合物2抗HCC-LM3 細胞與FN粘附的作用明顯增強。
[0102] 表3化合物2的體外抗腫瘤細胞粘附評價
[0103]
[0104] 實驗例5化合物2抗腫瘤細胞侵襲的活性
[0105] 1)化合物2用含0. 1 % DMS0的DMEM培養基配制成濃度為100 μ Μ的溶液。
[0106] 2)細胞為高轉移HCC-LM3。
[0107] 3)基質膠為 matrigelo
[0108] 4)實驗方法
[0109] 將凍存于-20°C冰箱的基質膠matrigel 4°C過夜，變成液態；取720 yL無血 清DMEM培養基，加入180 μ LMatrigel，混勾，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室， 100 μ L/個，放入37°C和5% C02培養箱中孵育5h。吸除小室中殘留液體，每孔加入50 μ L DMEM培養基，37°C和5% C02培養箱中孵育30min。
[0110] HCC-LM3細胞消化之后，用無血清DMEM培養基洗3次，計數，配成細胞懸液，密度 為2 X 105個/mL。每孔加入100 μ L細胞懸液，同時加入25 μ L化合物2a-c的溶液，使其 終濃度為20 μ M。空白對照加25 μ L含0. 1 % DMS0的DMEM培養基配制的溶液。下室加入 600 μ L無血清DMEM培養基，在37°C和5% C02培養箱中培養48小時。
[0111] 用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞之后，用4%的多聚甲醛固定細胞30min。吸除 固定液，用PBS洗3次，用0. 1 %的結晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
[0112] 在每個小室選取9個大致相同的視野觀察，拍照，計數。實驗數據統計均采用t檢 驗和方差分析，侵襲的細胞數以均值土SD表示。
[0113] 5)結果見表4。可以看出，化合物2的濃度為20μΜ時與空白對照組相比，具有明 顯的抗HCC-LM3細胞侵襲作用。與發明人公開的Lys-Glu抑制SACC-LM細胞侵襲的有效濃 度為ImM相比，化合物2的有效濃度降低了 50倍。
[0114] 表4化合物2的體外抗腫瘤細胞侵襲活性
[0115]
[0116] η = 9 ;a)與空白對照組比p < 0. 01.
[0117] 實驗例6化合物2抗腫瘤細胞迀移的活性
[0118] 1)化合物2用含0. 1 % DMS0的DMEM培養基配制成濃度為100 μ Μ的溶液。
[0119] 2)細胞為高轉移HCC-LM3。
[0120] 3)實驗方法
[0121] HCC-LM3細胞消化之后，用無血清DMEM培養基洗3次，計數，配成細胞懸液，密度為 5 X 105個/mL。每孔加入100 μ L細胞懸液，同時加入25 μ L同時加入25 μ L化合物2的溶 液，使其終濃度為20 μ Μ。空白對照加25 μ L含0. 1 % DMS0的DMEM培養基配制的溶液。下 室加入600 μ L無血清DMHM培養基，在37°C和5% C02培養箱中培養8小時。
[0122] 用棉簽擦去上室內的細胞之后，用4%的多聚甲醛固定細胞30min。吸除固定液， 用PBS洗3次，用0. 1 %的結晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
[0123] 在每個小室選取9個大致相同的視野觀察，拍照，計數。實驗數據統計均采用t檢 驗和方差分析，侵襲的細胞數以均值土SD表示。
[0124] 4)結果見表5。可以看出，在20μΜ濃度下化合物2與空白對照組比，發生迀移的 細胞數均顯著減少，說明在該條件下化合物2具有明顯的抗HCC-LM3細胞迀移作用。與發 明人公開的Lys-Glu抑制HCC-LM3細胞迀移的有效濃度為ImM相比，化合物2的有效濃度 降低了 50倍。
[0125] 表5化合物2的體外抗腫瘤細胞迀移活性
[0126]
[0127] η = 9 ;a)與空白對照組組比p < 0· 01.
[0128] 實驗例7化合物2a_c抗腫瘤轉移的活性
[0129] 受試化合物化合物2
[0130] 陽性對照藥阿霉素
[0131] 實驗動物C57BL/6小鼠，SPF級，雄性C57BL小鼠，體重18-20g，6-8周，購于北京 維通利華實驗動物技術有限公司。接種C57BL/6小鼠的瘤源為Lewis小鼠肺癌細胞（LLC)， 由體外細胞培養，自行傳代維持。
[0132] 化合物2加入少量的吐溫80潤濕助溶，逐漸加入0. 5% CMCNa水溶液至所需要濃 度即可。
[0133] 化合物2組小鼠口服給藥。每天給藥一次，給藥劑量為0. 1 μ mol/kg，連續給藥10 天。陰性對照組小鼠口服生理鹽水。每天給藥一次，劑量為〇.2mL/只，連續給10天。陽性 對照劑量為以腹腔注射阿霉素。每天給藥一次，給藥劑量為2 μmol/kg，連續給藥10天。
[0134] 動物模型
[0135] l)Lewis小鼠肺癌細胞（LLC)，購自ATCC。選用DMEM培養，其中含10%經滅活的 胎牛血清和1 X 105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素培養LLC細胞。按照貼壁細胞培養方法， 每兩天傳代一次，富集細胞。
[0136] 2)待細胞生長狀態良好、處于對數生長期時，消化細胞。用生理鹽水調整細胞濃度 至lXl〇7mL，胎盤藍（Tryanblue)拒染實驗示活細胞數> 95%。取近交系C57BL/6小鼠， 雄性，左手固定小鼠，用75%乙醇消毒小鼠右前肢腋窩皮膚，右手持ImL無菌注射器于小鼠 腋部皮下注射瘤細胞懸液〇. 2mL/只（含腫瘤細胞數約為2X 106/mL)。接種后8-10天可以 生長成綠豆粒大的腫瘤，給藥備用。
[0137] 3)取接種8-10天生長良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，頸椎脫白，用75%乙醇浸泡消 毒lOmin，在超凈工作臺上剝離瘤體，選擇生長良好的瘤組織，在無菌平皿中剪碎，放置于玻 璃組織勻漿器內，按瘤塊重（g):生理鹽水體積（mL)為1 : 3的比例加入4°C預冷的生理鹽 水輕輕研磨，制成細胞懸液，過200目尼龍網制成單細胞懸液，用生理鹽水調整細胞濃度至 lX107/mL，胎盤藍（Tryanblue)拒染試驗示活細胞數> 95%。
[0138] 4)取近交系C57BL/6小鼠，雄性，左手固定小鼠，用75%乙醇消毒小鼠右前肢腋窩 皮膚，右手持lmL無菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤細胞懸液0. 2mL (含腫瘤細胞數約為 2X 106/mL)。接種后8-10天可以生長成綠豆粒大的腫瘤，測量腫瘤體積，按腫瘤平均體積 分組進行給藥。
[0139] 5)每天觀察各給藥組小鼠的自主活動能力、精神狀態、毛發顏色、呼吸狀態、飲食 情況、糞便性狀。
[0140] 6)每組連續給藥10天后，于第11天稱取小鼠體重，乙醚麻醉并脫頸椎處死小 鼠，然后用鑷子固定小鼠右腋腫瘤生長部位，剪開皮膚使腫瘤完全暴露，鈍性剝離，稱重，以 無土SDg表示。
[0141] 7)用鑷子固定小鼠右腋部位，剪開皮膚使雙肺完全暴露，鈍性剝離雙肺，稱重，并 迅速放入生理鹽水中保存。統計雙肺的瘤節轉移數和轉移例數。
[0142] 8)實驗結果列入表6和表7。從表6可知，在0. 1 μ mol/kg的給藥劑量下，化合物 2除有效地抑制Lewis瘤生長。劑量比阿霉素低20倍時，化合物2抑制Lewis瘤生長的活 性與阿霉素沒有統計學差異。可見，化合物2抑制Lewis瘤生長的活性是阿霉素的20倍。 從表7可知，在0. 1 μ mol/kg的給藥劑量下，化合物2有效地減少瘤節轉移例數和轉移個 數。
[0143] 表6化合物2抑制Lewis肺癌的活性
[0144]
[0145] η = 12 ;a)與生理鹽水組比P < 0.01，與阿霉素組比P > 0.05.
[0146] 表7化合物2在Lewis肺癌轉移模型中的轉移瘤節和轉移例數
[0147]
[0148] η =12 ;a)與生理鹽水組比，P< 0.01。
【主權項】
1. 下面結構的化合物卜乙酰基-味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-IIe-Ser-Lys-Pro2. 權利要求1的卜乙酰基-味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的 制備方法，該方法由以下步驟構成： (1) 室溫下L-Trp-OMe與1，3_二羥基丙酮在稀鹽酸中反應48h，過濾得到濾餅，濾餅 溶解于二氧六環，得到的溶液在冰鹽浴下用2N的NaOH水溶液調節pH至12,反應10h，得到 1-乙酰基-β -咔啉酰-3-羧酸； (2) 1-乙酰基-β -咔啉酰-3-羧酸與L-Trp-OBzl偶聯并皂化制備1-乙酰基-β -咔 啉酰-3-色氨酸； (3) 將 Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl 與 1-乙酰基-β - P專P林酰 _3_ 色 氨酸偶聯制備1_乙酰基_ β _味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys (Fmoc) -Pro-OB zl ; (4) 將 1-乙酰基-β - P專卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys(Fmoc)-Pro-OBzl 脫保護制備1-乙酰基-β -卩專卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-IIe-Ser-Lys-ProD3. 權利要求1的卜乙酰基-味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro的 納米結構。4. 權利要求1的1-乙酰基-β -味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro在 制備抗腫瘤藥物中的應用。5. 權利要求1的卜乙酰基-味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro在 制備抗腫瘤細胞粘附、迀移和侵襲藥物中的應用。6. 權利要求1的卜乙酰基-味卩林酰-色氨酰-Leu-Pro-Asn-Ile-Ser-Lys-Pro在 制備抗腫瘤轉移藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK105884863SQ201410772094
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月16日
【發明人】彭師奇, 趙明, 王玉記, 吳建輝, 于翔
【申請人】首都醫科大學