一種鹽酸丁螺環酮的藥物組合物及其醫藥用圖
【專利摘要】本發明公開了一種鹽酸丁螺環酮的藥物組合物及其醫藥用途，本發明提供的鹽酸丁螺環酮的藥物組合物中含有鹽酸丁螺環酮和一種從知母的干燥根莖中分離得到的結構新穎的天然產物化合物(Ⅰ)，鹽酸丁螺環酮和本發明提供的化合物(Ⅰ)聯合作用時，可使滑膜細胞停滯在細胞周期G1期，從而抑制滑膜細胞增殖，治療滑膜炎；治療效果優于鹽酸丁螺環酮或化合物(Ⅰ)單獨作用。鹽酸丁螺環酮與化合物(Ⅰ)組合物可開發成治療滑膜炎的藥物，與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【專利說明】
一種鹽酸丁螺環酮的藥物組合物及其醫藥用途
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及鹽酸丁螺環酮的新用途，具體涉及鹽酸丁螺環酮 的藥物組合物及其醫藥用途。
【背景技術】
[0002] 鹽酸丁螺環酮片是一種新型抗焦慮藥物，它主要是通過激活腦內五羥色胺(5-HT) 1A受體而改變焦慮情緒。
[0003] 膝關節滑膜炎是一種無菌型炎癥，是由于膝關節扭傷和多種關節內損傷而引起 的。滑膜的功能異常會導致關節液無法正常生成和吸收，膝關節就會產生積液。滑膜的形態 改變還會侵襲膝關節軟骨，不及時治療會導致膝關節骨性關節炎，存在很大的致殘危機。
[0004] 迄今為止，尚未見鹽酸丁螺環酮及其藥物組合物與滑膜炎的相關性報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種鹽酸丁螺環酮的藥物組合物，該藥物組合物中含有鹽 酸丁螺環酮和一種結構新穎的天然產物，鹽酸丁螺環酮和該天然產物可以協同治療滑膜 炎。
[0006] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0007] 一種具有下述結構式的化合物（I)，
[0009] -種鹽酸丁螺環酮的藥物組合物，包括鹽酸丁螺環酮、如權利要求1所述的化合物 (I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0010] 進一步地，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0011] 進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0012] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將知母的干燥根莖粉碎，用75 ~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的 正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁 醇取物用大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70 %乙醇洗脫12個柱體積，收 集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正 相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組 分；⑷步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和1:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離， 用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓 濃縮得到化合物(I)。
[0013] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用80%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0014] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0015]進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0016] 上述化合物(I)在制備治療滑膜炎的藥物中的應用。
[0017] 上述鹽酸丁螺環酮的藥物組合物在制備治療滑膜炎的藥物中的應用。
[0018] 本發明的優點：
[0019] 本發明提供的鹽酸丁螺環酮的藥物組合物中含有鹽酸丁螺環酮和一種從知母的 干燥根莖中分離得到的結構新穎的天然產物，鹽酸丁螺環酮和該天然產物單獨作用時，對 滑膜炎具有治療作用;二者聯合作用時，對滑膜炎的治療效果進一步提高，可以開發成治療 滑膜炎的藥物。本發明與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0021 ]實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0022]分離方法：（a)將知母的干燥根莖(2kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提取（15L X 3次）， 合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水飽和的 正丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙 醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70% 乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1 (10個柱體積）、45:1 (8個柱體積）、 25:1(10個柱體積）和15:1(8個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟 (c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1(10個柱體積）、15:1(8個柱體積） 和1:1(6個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16 個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (260mg，HPLC歸一化純度大于98% )。 [0023] 結構確證:無色結晶，HR-ES頂S顯示[M+H]+為m/z 335.2174,結合核磁特征可得分 子式為〇2〇出()〇4，不飽和度為6。核磁共振氫譜數據5[^口111，口5^(1;[116-(15,50010^):!1-1(6.04， dd，J = 6.7，12.1Hz)，H-2(6.52，dd，J=12.1，9.5Hz)，H-3(7.13，d，J = 9.5Hz)，H-5a(3.23， d，J=15.6Hz)，H-5b(2.98，dd，J=15.6,9.3Hz)，H-6(5.06，dd，J = 9.3，1.4Hz)，H-7(1.87， m)，H-8(1.53，m)，H-9a(2.02，m)，H-9b(1.61，m)，H-10(1.96，m)，H-ll(1.77，m)，H-12(0.85， d，J = 5.9Hz)，H-13(1 · 13，d，J = 6.8Hz)，H-14(1.20，d，J = 6.8Hz)，H-2'（2.73，m)，H-3' (4.25，m)，H-4'（1.33，d，J = 6.1Hz)，H-5'（1 · 18，d，J = 7.4Hz);核磁共振碳譜數據5c(ppm， pyridine-d5，125MHz):133.2(CH，1-C)，127.4(CH，2-C)135.3(CH，3-C)，122.5(C，4-C)， 28.3(CH2,5-C)，77.4(CH，6-C)，52.7(CH，7-C)，27.7(CH，8-C)，35.2(CH2,9-C)，42.8(CH，10-C)，26.4(CH，n-C)，22.1(CH 3，12-C)，23.8(CH3，13-C)，18.4(CH3，14-C)，171.2(C，15-C)， 209.4(C，r-C)，48.7(CH，2'-C)，70.3(CH，3'-C)，22.0(CH 3,4'-C)，13.7(CH3,5'-C)。紅外波 譜中的1756cnf1吸收帶與UV譜中的236nm吸收帶表明該化合物含有α，β-不飽和內酯結構，紅 外波譜中的335301^1715(^ 1與1624CHT1吸收帶表明結構中存在羥基、酮基與α，β-不飽和 共輒體系。13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有20個碳信號，包括五個甲基，兩個亞甲基，十個次 甲基(兩個連氧碳和三個烯烴碳），以及三個季碳(兩個羰基碳和一個烯烴碳），以上功能結 構再結合不飽和數表明該化合物為雙環結構。 1H-NMR譜結合HSQC譜顯示五個甲基質子信號 δΗ 0.85(3H，d，J = 5.9Hz)、1.13(3H，d，J = 6.8Hz)、1.20(3H，d，J = 6.8Hz)、1.33(3H，d，J = 6.1他）、1.18(3!1，(1，1 = 7.4抱），三個共輒烯烴質子信號5116.04(1!1，(1(1，1 = 6.7，12.1抱）、 6.52(1!1，(1(1，1=12.1，9.5!^)與7.13(1!1，(1，1 = 9.5!^)，兩個連氧次甲基質子信號5[15.06 (lH，dd，J = 9 · 3，1 · 4Hz)與4 · 25( lH，m) ,Η-1!! COSY譜中存在Η-1/Η-2/Η-3、Η2-5/Η-6/Η-7/Η-8/出-9/!1-10、!1-7/!1-11/出-12、!1-11/!1 3-13以及!1-8/出-14相關信號，結合腿8(：譜中顯示的 Η-2、Η2-9和Η-10與C-l，H-2、H2-5和Η-6與C-4相關信號可以構建吉馬烷型倍半萜骨架。 COSY譜中H3-5'/H-2'/H-37H3-4'相關信號與HMBC譜中H-2'與C-Γ、C-3'和C-5' 以及H-3'與 C-2 '和C-4 '相關信號可以構建0-3 ' -0-羥基-2 ' -甲基丁酮基片段，同時HMBC譜H-10與C-Γ 相關信號表明這一片段與吉馬烷型倍半萜骨架連接的位置。另外HMBC譜H-3、H2-5和H-6與 C-15相關信號暗示C-6與C-15之間存在一個內酯環結構。N0ESY譜中，假設H-8為β構型，那么 Η-8與Η-10相關信號表明Η-10也為β構型，因此，0-3 ' -0-羥基-2 ' -甲基丁酮基應該為a構型。 綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物 如下所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0024]該化合物化學式及碳原子編號如下：
[0026] 實施例2:藥理作用
[0027] 1.材料與方法
[0028] 1.1動物
[0029]選用雄性Wistar大鼠（華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心提供），體重120g左 右。
[0030] 1.2試劑與樣品
[0031 ]鹽酸丁螺環酮購自中國藥品生物制品檢定所。化合物（I)自制，制備方法見實施例 1。11型膠原(美國Sigma公司）、不完全弗氏佐劑(Sigma公司）、RPMI-1640(GIBC0公司）。
[0032] 1.3儀器
[0033] 美國nurie C02培養箱(NU4750型）、日本奧林巴氏倒置熒光顯微鏡(CKX41型）、美 國Beckman Coulter流式細胞儀(EPICSXL型）、日本透射電鏡（日立H-7500型）。
[0034] 1.4大鼠模型制備及細胞分組
[0035]膠原誘導性關節炎(CIA)大鼠模型的制備將Π 型膠原溶解于O.lmmol/L的冰乙酸 中（Π 型膠原的終濃度為2g/L)，4°C過夜。然后將其滴加至冷的等積不完全弗氏佐劑中充分 乳化。將該乳劑每只大鼠皮內注射0.5ml，分背部4點和尾跟部1點。7天后同樣方法加強注射 1次。根據關節腫脹指數評分系統每天對每只大鼠關節進行評分，分為0~4分:0分，無紅腫； 1分，小趾關節紅腫；2分趾關節和足跖腫脹;3分，踝關節以下的足爪腫脹;4分，包括踝關節 以內的全部足爪腫脹。把各個關節的指數累積計分，即為每只大鼠的關節炎指數。
[0036]滑膜細胞的體外培養致炎后第25天，脫白處死發病的大鼠，無菌條件下取得滑膜 組織，剪切成約1mm3的碎塊，0.5mg/ml的Π 型膠原酶37°C消化6~7h，1200r/m離心8min，加 入1640培養液【分為5組:模型對照組、陽性對照組、鹽酸丁螺環酮組、化合物（I)組、鹽酸丁 螺環酮與化合物（I)組合物組，每組均含10%胎牛血清；陽性對照組還含有1.〇 X l(T6m〇l/L 的甲氨蝶呤，鹽酸丁螺環酮組還含有2.0 X 10-6mol/L的鹽酸丁螺環酮，化合物（I)組還含有 2.0 X l(T6mol/L的化合物（I)，鹽酸丁螺環酮與化合物（I)組合物組還含有1.0 X l(T6mol/L 的鹽酸丁螺環酮和1. 〇 X l(T6m〇l/L的化合物（I)】，置于37°C5%C02培養箱內培養，消化傳 代，用第3~5代細胞。
[0037] 1.5流式細胞儀檢測滑膜細胞周期
[0038]收集細胞，用roS重懸吹打成單細胞懸液，將其緩慢加到預冷的5ml 75%乙醇中，4 °C固定過夜；用ros將其濃度調整到5 X 106個/ml，然后取400μ1，加 RAase 20ml，37 °C水浴 30min;加 PI 100μΙ，避光染色20min，300目尼龍網過濾，上流式細胞儀。
[0039] 1.6統計學方法
[0040]實驗數據用均數土標準差(X土s)表示，應用SPSS18.0版統計軟件進行單因素方差 分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。
[0041 ] 2.實驗結果
[0042]流式細胞儀周期分析結果顯示，與模型組比較，陽性對照組G1期增加，S期減少，差 異具有統計學意義(p〈0.05);鹽酸丁螺環酮與化合物（I)組合物組G1期明顯增加(P〈0.01)， S期明顯減少（？〈〇.〇1);鹽酸丁螺環酮組和化合物（1)組61期增加（？〈〇.〇5)，3期減少0〈 0.05)〇
[0043]表1對CIA大鼠滑膜細胞周期的影響
[0045] 在類風濕關節炎(RA)關節損傷和組織重構中，滑膜細胞既是靶細胞，也通過多種 途徑成為參與者，其功能的改變在疾病的進程中起著至關重要的作用，成纖維樣滑膜細胞 是滑膜組織的主要成分，參與了關節軟骨破壞及關節周圍的骨組織破壞，所以抑制成纖維 樣滑膜細胞增殖是治療RA的手段之一。
[0046] 上述結果表明，鹽酸丁螺環酮和本發明提供的化合物（I)聯合作用時，可使滑膜細 胞停滯在細胞周期G1期，從而抑制滑膜細胞增殖，治療滑膜炎;治療效果優于鹽酸丁螺環酮 或化合物(I)單獨作用。鹽酸丁螺環酮與化合物(I)組合物可開發成治療滑膜炎的藥物。
[0047] 上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物（I)，2. -種鹽酸丁螺環酮的藥物組合物，其特征在于：包括鹽酸丁螺環酮、如權利要求1所 述的化合物(I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據權利要求2所述的鹽酸丁螺環酮的藥物組合物，其特征在于:藥學上可以接受的 載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附 載體或潤滑劑。4. 根據權利要求2所述的鹽酸丁螺環酮的藥物組合物，其特征在于：所述劑型包括片 劑、膠囊劑、□服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注 射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將知 母的干燥根莖粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油 醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70% 乙醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中 70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85 :1、45:1、25 :1和15:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比 為20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16 個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用80%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為DlOl型 大孔吸附樹脂。8. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療滑膜炎的藥物中的應用。10. 權利要求2~4任一所述的鹽酸丁螺環酮的藥物組合物在制備治療滑膜炎的藥物中 的應用。
【文檔編號】A61P19/04GK105884720SQ201610260256
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月23日
【發明人】陳斌
【申請人】陳斌