多肽組合物及使用其的多能干細胞的培養方法
【專利摘要】本發明提供一種可誘導多能干細胞的細胞培養性能尤其是優異的細胞增殖能力的多肽組合物及使用其的多能干細胞的培養方法。本發明提供：多肽組合物，其包含規定的多肽，所述規定的多肽包含來源于人玻連蛋白或玻連蛋白的規定的第1區域的氨基酸序列，且通過第1區域所包含的半胱氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體以上的多聚體多肽為組合物所包含的多肽的總質量的20質量％以下；多能干細胞的培養方法，其包含在該多肽組合物的存在下培養多能干細胞的階段；培養器，其具備具有細胞培養表面的支撐體及配置在支撐體的細胞培養表面上的多肽組合物所包含的多肽。
【專利說明】
多化組合物及使用其的多能干細胞的培養方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種多膚組合物及使用其的多能干細胞的培養方法。
【背景技術】
[0002] W損傷組織的功能恢復等為目的開發了各種再生醫療。其中，報告了大量關于W 組織本身的再生等為最終目的的靈長類尤其人類的全能或多能干細胞的技術。尤其，誘導 型多能干細胞QPS細胞)與胚胎干細胞不同是從體細胞誘導，因此具有倫理方面的問題少 的優點。
[0003] 在培養運些靈長類的全能或多能干細胞(對運兩者進行統稱，本發明中簡稱為"多 能干細胞"。）的情況下，要求在未分化狀態下經長期維持多能干細胞。為了長期培養未分化 狀態的多能干細胞，通常使用小鼠成纖維細胞等飼養細胞。
[0004] 然而，指出因使用如小鼠成纖維細胞的來源于異種動物的飼養細胞，培養液中可 能混入來源于異種動物的抗原性物質等的異物。在將全能或多能干細胞用于醫療用途或與 此相當的用途的情況下，要求將運些細胞在不存在飼養細胞的條件下進行培養。
[0005] 鑒于運種情況，進行了代替飼養細胞功能的細胞粘附性材料的開發。例如化ture Biotechnology ,2001，Voll9，pp. 971-974中公開了作為飼養細胞的代替物使用小鼠肉瘤提 取成分即基質膠，始終良好地對維持了未分化狀態的人胚胎干細胞進行培養。
[0006] 日本專利公開2001-17183號公報中公開有不含飼養細胞且含有增殖的靈長類原 始細胞的細胞性組合物，作為優選方式公開有還含有細胞外基質的細胞性組合物。并且，日 本專利公開2010-29186號公報中公開有W含有規定濃度的細胞外基質蛋白質及水性溶劑 的涂布溶液，涂布已進行等離子體聚合的細胞培養表面的細胞培養基質，并且記載有根據 該細胞培養基質具有有助于避免胚胎干細胞的分化的良好的粘附性。
[0007] Biomaterials,2010,Nov;Vol .31(32),卵.8281-8288及化ture Biotechnology, 2010，Vol. 28 ,No.6，pp.606-610中分別公開有由可有助于胚胎干細胞的長期培養的玻連蛋 白部分序列構成的重組膚或合成膚，具體而言，天然玻連蛋白的氨基酸序列中的第1個至第 52個的氨基酸序列的多膚（參考Biomaterials,2010，Nov;Vol.31 (32)，pp.8281-8288)及包 含RGD序列的第41個至第52個的氨基酸序列（參考化ture Biotechnology，2010，Vol. 28， No . 6，PP. 606-610)的多膚。已知由于運些多膚為非生物體試料，因此能夠避免混入抗原性 物質等的混入的可能性，且可進行工業生產運一點上優異。
【發明內容】
[000引發明要解決的技術課題
[0009]然而，若考慮將多能干細胞用于再生醫療等的醫療用途或與此相當的用途，則應 盡量排除W來源于小鼠等的成纖維細胞等的異種飼養細胞或來源于小鼠的基質膠為首的 來源于異種動物的成分的使用。并且，即使是來源于同種動物的細胞或成分，也不能完全排 除混入抗原性物質等的可能性。而且，即使是同種及異種中任一種，來源于生物體的材料其 提取量極為微量，或根據給予體其性能有所偏差等，從工業上的觀點考慮也不優選。近年， W醫療用途中的應用為目標，盛行沒有混入來源于異種動物的成分或抗原性物質的化學上 認可的條件下對干細胞進行培養的研究。然而，未發現能夠代替顯示足W實用的細胞培養 性能的飼養細胞的材料。
[0010] 例如，作為避免使用來源于生物體的材料本身的方法，Biomaterials ,2010 ,Nov; Vol .31(32),卵.8281-8288及Na1:ure Biotechnology,2010,Vol .28,No.6,PP.606-610中公 開有使用由人玻連蛋白的部分序列構成的重組膚或合成膚來實施胚胎干細胞的長期培養 的例。
[0011] 然而，即使是運些重組膚，作為多能干細胞的細胞培養性能還不夠充分。
[0012] 本發明能夠提供一種可誘導多能干細胞的細胞培養性能尤其是優異的細胞增殖 能力的多膚組合物及使用其的多能干細胞的培養方法。
[0013] 用于解決技術課題的手段
[0014] 本發明為如下所述。
[0015] [1]一種多膚組合物，其包含選自由W下多膚(a)~（C)構成的組中的至少一種： (a)具有由序列號1表示的氨基酸序列的多膚；（b)具有與由序列號1表示的氨基酸序列的同 源性為80% W上的氨基酸序列且具有多能干細胞的培養性能的多膚;及山)具有序列號1中 缺失、取代或附加1或數個氨基酸的氨基酸序列且具有多能干細胞的培養性能的多膚，多膚 (a)~(C)為包含由W下（1-i)~（1-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第1區域的多膚：（1-i)由序列號1表示的氨基酸序列中由第1個~第44個氨基酸殘基構成的氨基酸序列；（1-ii) 由與由氨基酸序列（1-i)構成的氨基酸序列的同源性為80% W上的氨基酸序列構成且具有 對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列；及（1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代 或附加1或數個氨基酸的氨基酸序列構成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序 列，且選自由多膚(a)~（C)構成的組中的至少一種且通過第1區域所包含的半脫氨酸殘基 而進行分子之間交聯的二聚體W上的多聚體多膚為組合物所包含的多膚的總質量的20質 量％^下。
[0016] [2]-種多膚組合物，其包含由40個~450個氨基酸殘基構成的多膚(d)，多膚(d) 為包含由W下（1-i)~（1-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第1區域及由W下(2-i)~(2-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第2區域的多膚：（1-i)由序列號1表示的氨基酸序列中 由第1個~第44個氨基酸殘基構成的氨基酸序列；（1-ii)由與由氨基酸序列（1-i)構成的氨 基酸序列的同源性為80% W上的氨基酸序列構成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的 氨基酸序列;及(1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1或數個氨基酸的氨基酸序 列構成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列，（2 - i )由 PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRG服RGRNQN(序列號3)表示的氨基酸序列；（2-ii)與由序列號3表 示的氨基酸序列具有80% W上的同源性且具有對支撐體的細胞培養表面的吸附能力的氨 基酸序列;及(2-iii)相對由序列號3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加1或數個氨基酸且 具有對支撐體的細胞培養表面的吸附能力的氨基酸序列，且多膚(d)且通過第1區域所包含 的半脫氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體W上的多聚體多膚為組合物所包含的多膚 的總質量的20質量％ W下。
[0017] [3]根據[1]或[2]所記載的多膚組合物，其中，通過多膚中的任一位置的半脫氨酸 殘基而進行分子之間交聯的二聚體W上的多聚體多膚為組合物所包含的多膚的總質量的 20質量下。
[0018] [4]根據[1]~[3]中任一項所述的多膚組合物，其中，組合物中的多膚(a)~(C)或 (d)包含如下至少一種多膚，即包含于第1區域且在由序列號1表示的氨基酸序列中相當于 第25個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基及相當于第31個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基之間進行 分子內交聯的多膚。
[0019] [5]根據[1]~[3]中任一項所述的多膚組合物，其中，組合物中的多膚(a)~(C)或 (d)包含如下多膚，所述多膚包含于第1區域且分別在由序列號1表示的氨基酸序列中，相當 于第5個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基與相當于第9個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基之間、相當 于第19個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基與相當于第21個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基之間、相 當于第25個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基與相當于第31個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基之間、 及相當于第32個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基與相當于第39個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基 之間進行分子內交聯。
[0020] [6]根據[1]~[3]中任一項所述的多膚組合物，其中，組合物所包含的多膚與纖溶 酶原激活物抑制劑-1 (Plasminogen activator inhibitor-l)的結合常數大于0.06。
[0021] [7]根據[1]~[6]中任一項所述的多膚組合物，其中，作為組合物中的多膚(a)~ (C)或(d)包含如下至少一種多膚，所述多膚還包含由下述(3a-i)~(3a-iii)中的任一個氨 基酸序列構成的第3區域：（3a-i)由序列號1表示的氨基酸序列中，由第56個~第341個氨基 酸殘基構成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列；（3a-ii)與（3a-i)的氨基酸序列或其部分 氨基酸序列具有80% W上的同源性的氨基酸序列;及(3a-iii)相對(3a-i)的氨基酸序列或 其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或數個氨基酸的氨基酸序列。
[0022] [引根據[1]~[7]中任一項所述的多膚組合物，其中，作為組合物中的多膚(a)~ (C)或(d)包含如下至少一種多膚，所述多膚還包含由下述(4a-i)~(4a-iii)中的任一個氨 基酸序列構成的第4區域：（4a-i)由序列號1表示的氨基酸序列中，由第374個~第459個氨 基酸殘基構成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列；（4a-ii)與(4a-i)的氨基酸序列或其部 分氨基酸序列具有80% W上的同源性的氨基酸序列;及(4a-iii)相對(4a-i)的氨基酸序列 或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或數個氨基酸的氨基酸序列。
[0023] [9]一種多膚組合物，其包含選自由W下多膚(a)~（C)構成的組中的至少一種： (a)具有由序列號1表示的氨基酸序列的多膚；（b)具有與由序列號1表示的氨基酸序列的同 源性為80% W上的氨基酸序列且具有多能干細胞的培養性能的多膚;及山)具有序列號1中 缺失、取代或附加1或數個氨基酸的氨基酸序列且具有多能干細胞的培養性能的多膚，通過 多膚中所包含的半脫氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體W上的多聚體多膚為組合物 所包含的多膚的總質量的20質量％ W下。
[0024] [10]-種多能干細胞的培養方法，其包含在[1]~[9]中任一項所述的多膚組合物 的存在下培養多能干細胞的階段。
[0025] [ 11 ]-種培養器，其具備具有細胞培養表面的支撐體及配置在支撐體的細胞培養 表面上的[1]~[9]中任一項所述的多膚組合物所包含的多膚。
[0026] 發明效果
[0027] 根據本發明，能夠提供一種可誘導多能干細胞的細胞培養性能尤其是優異的細胞 增殖能力的多膚組合物及使用其的多能干細胞的培養方法。
【附圖說明】
[0028] 圖1是表示本發明的參考例中各多膚的培養板表面的吸附試驗結果的曲線圖。
[0029] 圖2是表示本發明的參考例中使用各多膚的細胞的增殖曲線的曲線圖。
[0030] 圖3是在本發明的參考例中各多膚上進行培養時的iPS細胞菌落的形態圖像（左 欄)及放大圖像(右欄）。
[0031] 圖4是本發明的參考例中各多膚上進行培養時的iPS細胞的DAPI染色圖像(左欄） 及NANOG染色圖像(右欄）。
[0032] 圖5是本發明的實施例所設及的多膚組合物I-U泳道(B))與1-2(泳道(A))的SDS-PAGE的凝膠圖像。
[0033] 圖6是表示本發明的實施例所設及的多膚組合物中的多膚與PAI-I的結合關系的 曲線圖。
【具體實施方式】
[0034] 本發明的多膚組合物，包含選自由W下多膚(a)~(C)構成的組中的至少一種：
[0035] (a)具有由序列號1表示的氨基酸序列的多膚；
[0036] (b)具有與由序列號1表示的氨基酸序列的同源性為80% W上的氨基酸序列且具 有多能干細胞的培養性能的多膚;及
[0037] (C)具有序列號1中缺失、取代或附加1或數個氨基酸的氨基酸序列且具有多能干 細胞的培養性能的多膚，
[0038] 多膚(a)~(C)為包含由W下（1-i)~（1-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第1區 域的多膚：
[0039] (1-i)由序列號1表示的氨基酸序列中由第1個~第44個氨基酸殘基構成的氨基酸 序列；
[0040] (1-ii)由與由氨基酸序列（1-i)構成的氨基酸序列的同源性為80% W上的氨基酸 序列構成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列;及
[0041] (1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1或數個氨基酸的氨基酸序列構 成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列，且
[0042] 選自由多膚(a)~(C)構成的組中的至少一種且通過第1區域所包含的半脫氨酸殘 基而進行分子之間交聯的二聚體W上的多聚體多膚為組合物所包含的多膚的總質量的20 質量下。
[0043] 并且，本發明的其他多膚組合物包含由40個~450個氨基酸殘基構成的多膚(d)， 多膚(d)為包含由W下（1-i)~（1-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第1區域及由W下(2-i)~(2-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第2區域的多膚：
[0044] (1-i)由序列號1表示的氨基酸序列中由第1個~第44個氨基酸殘基構成的氨基酸 序列；
[0045] (1-ii)由與由氨基酸序列（1-i)構成的氨基酸序列的同源性為80% W上的氨基酸 序列構成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列;及
[0046] (1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加 I或數個氨基酸的氨基酸序列構 成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列，
[0047] (2-i)由PRPSLAKKQRF畑RN服GYRSQRG服RGRNQN(序列號3)表示的氨基酸序列；
[0048] (2-ii)與由序列號3表示的氨基酸序列具有80% W上的同源性且具有對支撐體的 細胞培養表面的吸附能力的氨基酸序列;及
[0049] (2-iii)相對由序列號3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加1或數個氨基酸且具 有對支撐體的細胞培養表面的吸附能力的氨基酸序列，且
[0050] 多膚(d)且通過第1區域所包含的半脫氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體W 上的多聚體多膚為組合物所包含的多膚的總質量的20質量％ W下。
[0051] 本發明人等為了開發能夠增殖多能干細胞的重組蛋白質不斷進行深入研究發現， 通過在如下多膚組合物的存在下培養多能干細胞，能夠提高多能干細胞的增殖能力，所述 多膚組合物不是W通過人玻連蛋白N末端側的半脫氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體 W上的多聚體的形態，而是W沒有分子之間交聯的單體的形態，大量包含含有規定的人玻 連蛋白N末端側的部分序列且具備具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列的多 膚。本發明是基于運個研究結果而完成的。
[0052] W下，對本發明的實施方式進行詳細的說明。
[0053] 本發明的多膚組合物為如下的組合物，包含選自由上述的多膚(a)~(C)構成的組 中的至少一種，且選自由多膚(a)~（C)構成的組中的至少一種且通過第1區域所包含的半 脫氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體W上的多聚體多膚為組合物所包含的多膚的總 質量的20質量％ ^下。本多膚組合物能夠提高多能干細胞的增殖能力。
[0054] 并且，本發明的其他多膚組合物為如下的組合物，包含上述的多膚(d)，且多膚(d) 且通過第1區域所包含的半脫氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體W上的多聚體多膚為 組合物所包含的多膚的總質量的20質量％^下。本多膚組合物能夠維持未分化狀態并提高 多能干細胞的增殖能力。
[0055] 在本說明書中"工序"運一用語，不只是獨立的工序，即使無法與其他工序明顯地 區別的情況下也能夠實現本工序所期望的目的，則也包含在本用語中。
[0056] 并且，在本說明書中用"~"來表示的數值范圍表示分別將"~"的前后所記載的數 值作為最小值及最大值來包含的范圍。
[0057] 并且，在本說明書中，對于組合物中的各成分的量，在存在多個相當于組合物中各 成分的物質時，若無特別說明，表示組合物中存在的該多個物質的總量。
[0058] 在本說明書中，"同種"是指人，"異種"是指除人W外的動物。
[0059] 本說明書中，有時將氨基酸序列中的氨基酸殘基W本技術領域中周知的單字母標 記(例如，將甘氨酸殘基標記為"G")或S字母標記(例如，將甘氨酸殘基標記為"Gly")來進 行標記。
[0060] 本發明中，對于與多膚的氨基酸序列有關的"％"，若無特別說明，W氨基酸(或亞 氨基酸)殘基的個數為基準。
[0061] 在本說明書中，對于氨基酸序列的特定氨基酸殘基所使用的"對應的氨基酸殘基" 等的表述是指將進行對比的兩個W上氨基酸序列，W本技術領域中周知的方法，在插入、缺 失及取代考慮在內的基礎上，W相等的氨基酸殘基達到最多的方式進行排列(對齊)時，與 成為基準的氨基酸序列中的特定氨基酸殘基的位置一致的其他氨基酸序列中的氨基酸殘 基。
[0062] 有關本說明書中的氨基酸序列的"同源性"可W是指使用BLAST軟件包（參考 Ausubel等，1999Sho;rt Protocolsin Molecular Biology，4thEd-Qiapter 18)計算的值。 例如，相對序列號1的同源性為80% W上是指BLAST中的Max. Identities的值為80W上。
[0063] 在本說明書中，氨基酸序列中對于"缺失、取代或附加氨基酸的氨基酸序列"的表 述并不排除缺失、取代及附加的氨基酸序列所包含的氨基酸的兩個W上組合。
[0064] < 多膚 >
[0065] 本發明所設及的多膚(a)~(C)為如下所述：
[0066] (a)具有由序列號1表不的氨基酸序列的多膚；
[0067] (b)具有與由序列號1表示的氨基酸序列的同源性為80% W上的氨基酸序列且具 有多能干細胞的培養性能的多膚;及
[0068] (C)具有序列號1中缺失、取代或附加 1或數個氨基酸的氨基酸序列且具有多能干 細胞的培養性能的多膚。
[0069] 序列號1:
[0070] D犯SCKGRCTEGFNVD邸CQC呢LCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTM陽DEYTVY孤GEEKNNATV肥QVGGP 化TSDLQAQSKGNPEQTPVLKP邸EAPAPEVGASK陽GIDSRPETLHPGRPQPPAE邸LCSGKP抑AFTDLKNGSLF AFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLI畑VWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRF邸GVLDPDYPRNISDGraGI PDNVDAALALPA服YSGRERVYFFKGKQYWEYQFQ冊PS犯ECEGS化SAV陽HFAMMQ畑SWEDI巧LLFWGRTSA GTRQPQFIS畑W服VPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRF畑RN服GYRSQRG服RGRNQNSRRPSRATWLSL FS沈ESNLGANNY孤YRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL
[0071] 在此，多膚中"具有多能干細胞的培養性能"是指具有多能干細胞的增殖活性。可 通過如下進行對于是否具有增殖活性的評價，例如在吸附多膚的細胞培養表面上接種多能 干細胞使其細胞密度達到250cells/孔，并培養8天后用PBS清洗方式除去非粘附細胞時，粘 附細胞是否存在2500cells/孔(接種細胞數的10倍)W上。
[0072] 在此粘附細胞數可通過對多能干細胞所表現的堿性憐酸酶的活性進行定量的方 法或MlT試驗等來進行定量。
[0073] 由序列號1表示的全長459氨基酸殘基構成的多膚為玻連蛋白，在本發明中，玻連 蛋白是指人玻連蛋白。另外，確認了天然的玻連蛋白為序列的一部分中具有糖鏈的糖蛋白 質。
[0074] 多膚(b)優選為具有與由序列號1表示的氨基酸序列的同源性為90% W上的氨基 酸序列且具有多能干細胞的培養性能的多膚，更優選為具有與由序列號1表示的氨基酸序 列的同源性為95% W上的氨基酸序列且具有多能干細胞的培養性能的多膚。
[0075] 多膚(C)優選為具有序列號1中缺失、取代或附加 1個~5個氨基酸的氨基酸序列且 具有多能干細胞的培養性能的多膚。
[0076] 本發明所設及的多膚優選為(al)由序列號1表示的氨基酸序列構成的多膚、（bl) 由與由序列號1表示的氨基酸序列的同源性為80% W上的氨基酸序列構成且具有多能干細 胞的培養性能的多膚、或（Cl)由序列號1中缺失、取代或附加1或數個氨基酸的氨基酸序列 構成且具有多能干細胞的培養性能的多膚。
[0077] 在此，（bl)的多膚優選為由與序列號1所表示的氨基酸序列的同源性為90% W上 的氨基酸序列構成且具有多能干細胞的培養性能的多膚，更優選為由與序列號1所表示的 氨基酸序列的同源性為95% W上的氨基酸序列構成且具有多能干細胞的培養性能的多膚。
[0078] 并且，（Cl)的多膚優選為由序列號1中缺失、取代或附加1或數個優選1個~5個氨 基酸的氨基酸序列構成且具有多能干細胞的培養性能的多膚。
[0079] 多膚(a)~（C)包含由W下（1-i)~（1-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第1區 域。
[0080] (1-i)由序列號1表示的氨基酸序列中由第1個~第44個氨基酸殘基構成的氨基酸 序列；
[0081] (1-ii)由與由氨基酸序列（1-i)構成的氨基酸序列的同源性為80% W上的氨基酸 序列構成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列;及
[0082] (1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1或數個氨基酸的氨基酸序列構 成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列。
[0083] 由序列號1表示的氨基酸序列中由第1個~第44個氨基酸殘基構成的多膚部位是 作為人玻連蛋白的生長素介質B(SMB)域而所知的域。已知SMB域與纖溶酶原激活物抑制劑-I(PAI-I)相互作用。并且，SMB域中含有相當于玻連蛋白的氨基酸序列中第25個~第31個運 7個氨基酸殘基的由CSYYQSC(序列號2)表示的氨基酸序列、及相當于玻連蛋白的氨基酸序 列中第45個~第47個運3個氨基酸殘基的細胞粘附性基序的RGD序列兩者。多膚(a)~k)中 的第1區域可具有選自由序列號2表示的氨基酸序列及RGD序列構成的組中的任一種，從細 胞粘附性及細胞增殖性的觀點考慮，多膚(a)~(C)中的第1區域優選包含運些序列的兩者。
[0084] 即，（1-i)~（1-iii)的第1區域為位于天然玻連蛋白的較N末端側的序列，并發揮 與未分化多能干細胞的粘附性，其結果，可推測能夠增殖多能干細胞。因此，包含第1區域的 多膚與不包含第1區域的多膚相比，細胞粘附性優異，細胞增殖能力更優異。
[0085] 本發明中的多膚(a)~(C)中包含規定氨基酸序列的第1區域具有優異的細胞粘附 性。因此本發明中的多膚能夠良好地增殖細胞尤其是多能干細胞。具有運種氨基酸序列的 本發明所設及的(a)~(C)的多膚能夠經長期增殖多能干細胞。
[0086] 多膚具有％多能干細胞的細胞粘附能力"是指多能干細胞對多膚顯示附著性。可 通過已知的評價方法來評價多能干細胞對多膚是否顯示附著性。例如，可在由多膚包覆的 培養表面接種多能干細胞并在24小時后，用憐酸緩沖液(PBS)等輕輕擦拭，并根據擦拭后培 養表面上殘留的多能干細胞的量進行評價。
[0087] 由（1-ii)表示的氨基酸序列優選為由與由氨基酸序列（1-i)構成的氨基酸序列的 同源性為90% W上的氨基酸序列構成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列， 更優選為由與由氨基酸序列（1-i)構成的氨基酸序列的同源性為95% W上的氨基酸序列構 成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列。
[0088] 由（1-iii)表示的氨基酸序列優選為由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1個 ~5個氨基酸的氨基酸序列構成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列。
[0089] 序列號1表示的氨基酸序列中第1個~第44個氨基酸殘基中，作為第5個氨基酸殘 基、第9個氨基酸殘基、第19個氨基酸殘基、第21個氨基酸殘基、第25個氨基酸殘基、第31個 氨基酸殘基、第32個氨基酸殘基及第39個氨基酸殘基包含有半脫氨酸殘基。多膚(a)~（C) 可W不包含相當于運些8個半脫氨酸殘基的半脫氨酸殘基，或可包含至少一個。半脫氨酸殘 基由于在生理條件下具有與其他半脫氨酸殘基容易交聯的傾向，因此當多膚(a)~(C)包含 半脫氨酸殘基時，多膚中其他部位的半脫氨酸殘基彼此之間可產生分子內交聯。
[0090] 從促進并提高多能干細胞的增殖的觀點考慮，多膚(a)~（C)優選包含序列號1中 示出的氨基酸序列中上述的8個半脫氨酸殘基中的兩個W上，尤其優選第1區域所包含的兩 個W上的半脫氨酸殘基相互分子內交聯。
[0091] 從促進并提高多能干細胞的增殖的觀點考慮，可形成分子內交聯的半脫氨酸殘基 的組合優選為相當于第5個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基與相當于第9個氨基酸殘基的半脫 氨酸殘基、相當于第19個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基與相當于第21個氨基酸殘基的半脫氨 酸殘基、相當于第25個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基與相當于第31個氨基酸殘基的半脫氨酸 殘基、及相當于第32個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基與相當于第39個氨基酸殘基的半脫氨酸 殘基的組合。多膚(a)~(d)優選包含可形成分子內交聯的半脫氨酸殘基的四個優選組合中 的任一個，更優選包含所有運種四個組合。另外，本說明書中，有時將特定的半脫氨酸殘基 W與表示序列號1中示出的氨基酸序列位置的數字的組合來表示，例如，當為序列號1中示 出的氨基酸序列中相當于第25個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基時，表示為"Cys25"。
[0092] 第1區域的氨基酸殘基數從多能干細胞的細胞粘附性及增殖性的觀點考慮，可設 定為3~60氨基酸殘基數，優選為10~55氨基酸殘基數。
[0093] 多膚(a)~（C)所包含的氨基酸殘基數(氨基酸長度）只要在400~550的范圍內則 并無特別限制，從具有對人玻連蛋白的高相同性的方面考慮，優選為450~520,更優選為 450~459。
[0094] 本發明所設及的多膚(d)為如下所述。
[00M]包含由上述（1-i)~（1-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第1區域及由W下（2-i)~(2-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第2區域，且由40個~450個氨基酸殘基構成的 多膚：
[0096] (2-i)由PRPSLAKKQRF畑RN服GYRSQRG服RGRNQN(序列號3)表示的氨基酸序列；
[0097] (2-ii)與由序列號3表示的氨基酸序列具有80% W上的同源性且具有對支撐體的 細胞培養表面的吸附能力的氨基酸序列;及
[0098] (2-iii)相對由序列號3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加1或數個氨基酸殘基 且具有對支撐體的細胞培養表面的吸附能力的氨基酸序列。
[0099] 多膚(d)為了具有多能干細胞的培養性能，具備"對多能干細胞的細胞粘附性"及 "對支撐體的細胞培養表面的吸附能力"，因此優選。在此，支撐體是指使用本發明的培養方 法進行細胞培養時，具有賦予本發明所設及的多膚的面的培養器的部位。
[0100] 目P，由上述（1-i)~（1-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第1區域具有優異的細 胞粘附性，由此能夠良好地增殖細胞尤其是多能干細胞。包含運種氨基酸序列的多膚(d)能 夠在維持未分化狀態的同時經長期增殖多能干細胞。
[0101] 并且，由上述(2-i)~（2-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第2區域有助于對支 撐體的細胞培養表面的吸附性。包含運種氨基酸序列的多膚(d)顯示對支撐體的細胞培養 表面的良好的粘附性。多膚(d)通過同時包含第1區域及第2區域，培養期間內不會從支撐體 的細胞培養表面剝離而能夠在維持未分化狀態的同時經長期增殖多能干細胞。并且，多膚 (d)能夠抑制從支撐體的細胞培養表面的剝離并增殖培養中未分化狀態的多能干細胞，且 能夠提高培養操作時的操作性。
[0102] 其結果，多膚(d)能夠促進多能干細胞在未分化狀態下的增殖，并且無需基于化學 鍵的對支撐體的細胞培養表面的固定處理而獲得可在工業上生產的多膚。
[0103] 并且，多膚(d)與天然人玻連蛋白相比在排除抗原性物質、感染癥源的混入風險的 同時能夠保持與天然玻連蛋白同等的性能，即對多能干細胞的粘附性、細胞增殖性及未分 化維持性。
[0104] 在此，關于多膚"在未分化狀態下能夠增殖多能干細胞"是指多能干細胞在培養期 間維持分化能力。對于多能干細胞是否處于未分化狀態，可通過已知的評價方法來進行評 價。例如，通過分子標記物的表達(SSEA-4及/或Oct-4等基于流式細胞儀的表達測定、Oct-4 及/或NANOG等免疫染色等）、體外實驗時的多能分化的確認及基于對免疫缺陷小鼠等的移 植的崎胎瘤形成的確認等本領域技術人員已知的方法來進行。對于是否進行增殖可通過常 規方法，利用使用了各種顯微鏡W肉眼進行觀察或ALP活性等的反應試驗、流式細胞儀等的 方法或通過其他方法來進行評價。并且，作為本發明中的維持多能干細胞分化能力的培養 期間，根據培養條件及多能干細胞的細胞狀態而有所不同，例如可設定為1個月的培養期 間。
[0105] 多膚(d)中的第1區域與多膚(a)~(C)中的第1區域含義相同。對于與多膚(d)中的 第1區域有關的事項，直接適用有關多膚(a)~(C)所記載的事項。
[0106] 第2區域包含由序列號3表示的32個氨基酸殘基構成的氨基酸序列，從多膚(d)的 精制容易性的觀點考慮，優選多膚(d)中的第2區域為由序列號3表示的氨基酸序列構成的 多膚。由序列號3表示的氨基酸序列包含于位于天然玻連蛋白的C末端側的血紅素結合蛋白 樣結構域II的一部分中，且相當于由序列號1表示的氨基酸序列的第342個~第373個氨基 酸殘基構成的肝素結合域。W下，有時將由序列號3表示的氨基酸序列稱為肝素結合域。
[0107] 多膚(d)具有肝素結合域，由此可推測具有對支撐體的細胞培養表面的吸附能力。 其結果，通過使用多膚(d)，能夠維持未分化狀態而經長期培養未分化多能干細胞。
[0108] 并且，多膚(d)包含肝素結合域，由此具有確保多膚(d)的親水性并抑制多膚的疏 水凝集的傾向。其結果，多膚(d)的精制變得容易，并能夠提高制造效率。
[0109] 在此，"具有對支撐體的細胞培養表面的吸附能力"是指氨基酸序列不會對成為對 象的培養器的細胞培養表面（W下，有時簡稱為"培養表面"）產生化學反應而是進行物理性 的吸附。可通過如下進行是否對支撐體的細胞培養表面具有吸附能力的評價，例如，已進行 等離子體處理的聚苯乙締制培養器中添加含有該多膚的溶液使其達到20化mol/cm 2并在37 °C下放置2個小時后，用憐酸緩沖液清洗兩次時，殘留于培養皿表面的該多膚是否存在 IOpmol/cm2 W上。
[0110] 在此，殘留于培養皿表面的多膚的量可通過對與識別多膚的抗體的結合量進行定 量的ElLISA化nzyme-Linked Immunosorbent Assay)法或水解吸附的多膚并將生成的氨基 酸通過HPLC等進行定量來測定。
[0111] 并且肝素結合域可W是與由序列號3表示的氨基酸序列具有80% W上、優選90% W上、更優選95% W上的同源性，并且在未分化狀態下能夠增殖多能干細胞，且具有對支撐 體的細胞培養表面的吸附能力的氨基酸序列。
[0112] 并且進而肝素結合域可W是由相對由序列號3表示的氨基酸序列缺失、取代或附 加 1個或數個、優選1個~5個氨基酸殘基的氨基酸序列構成且具有對支撐體的細胞培養表 面的吸附能力的氨基酸序列。
[0113] 多膚(d)只要具有第1區域及第2區域即可，其相對位置并無特別限制。多膚(d)中 優選第1區域位于第2區域的N末端側。
[0114] 具有第1區域及第2區域的多膚(d)由40個~450個氨基酸殘基構成。通過設定為40 個氨基酸殘基W上，細胞粘附性或細胞增殖性或對支撐體的細胞培養表面的吸附能力優 異，另一方面，通過設定為450個氨基酸殘基W下，更能發揮細胞粘附性或細胞增殖性及對 支撐體的細胞培養表面的吸附能力，而且能夠抑制蛋白質之間的締合、交聯或凝集的形成。 多膚(d)從難W引起凝集的形成等的觀點考慮，優選為80個W上，更優選為90個W上，進一 步優選為100個W上，另一方面，優選為400個W下，更優選為250個W下，進一步優選為170 個W下，更進一步優選為150個W下。對于它們的上限值或下限值可任意組合，例如，優選由 40個~400個氨基酸殘基構成，更優選由80個~250個氨基酸殘基構成，進一步優選由80個 ~150個氨基酸殘基構成，更進一步優選由100個~150個氨基酸殘基構成。
[0115] 從防止疏水凝集的觀點考慮，優選多膚(a)~（d)具有-2.0~-0.95的GRAVY值。 GRAVY 值化J. ,Doolittle R.F. (1982)，J.Mol.Biol ,157:105-132)表示多膚的疏水度 的總平均。表示GRAVY的值越大疏水度越高。若GRAVY值為-0.95 W下，則具有能夠容易抑制 疏水凝集發生的傾向。另一方面，若為-2. OW上，則具有對支撐體的細胞培養表面的吸附及 未分化細胞的增殖變得容易，且隨著GRAVY值變大吸附性及細胞增殖性提高的傾向。從兼顧 抑制凝集形成與吸附性或細胞增殖性的方面考慮，作為多膚的GRAVY值，更優選-1.70~-0.975,進一步優選-1.60~-1.10。由于氨基酸殘基數越少越有凝集的傾向，因此當為氨基 酸殘基數為80~170個的多膚時，從兼顧抑制凝集形成與吸附性或細胞增殖性的方面考慮， GRAVY值優選為-1.70~-0.975，進一步優選為-1.60~-1.10。
[0116] 01?4￥￥值可通過增減序列中的例如疏水性氨基酸（例如，1'巧^7'、？116、1^611、116、 化1或Met)比例或增減氨基酸殘基數等來進行調整。
[0117] 多膚(a)~(d)優選還具有上述的氨基酸序列W外的其他氨基酸序列。從適當發揮 細胞粘附性及對支撐體的細胞培養表面的吸附能力的觀點考慮，多膚(a)~(d)優選包含由 序列號1表示的氨基酸序列即人玻連蛋白的氨基酸序列的部分序列。由此，多膚(a)~(d)能 夠獲得接近人玻連蛋白的性質例如對多能干細胞優異的粘附性及增殖性。
[0118] 作為可包含于多膚(a)~(d)中的人玻連蛋白的部分氨基酸序列，從多膚(a)~(d) 的細胞粘附性及細胞增殖性或對支撐體的細胞培養表面的吸附能力或抑制凝集形成的觀 點考慮，優選包含選自由W下第3區域及第4區域構成的組中的至少一個：
[0119] (3)由下述氨基酸序列構成的第3區域，所述氨基酸序列選自由序列號1表示的氨 基酸序列中由第56個~第341個氨基酸殘基構成的氨基酸序列及其部分氨基酸序列，及
[0120] (4)由下述氨基酸序列構成的第4區域，所述氨基酸序列選自由序列號1表示的氨 基酸序列中由第374個~第459個氨基酸殘基構成的氨基酸序列及其部分氨基酸序列。
[0121] 作為第3區域，從制作多膚時具有抑制疏水凝集的傾向的觀點考慮，可選擇(3a)由 序列號1表示的氨基酸序列中由第56個~第341個氨基酸殘基構成的氨基酸序列或其部分 氨基酸序列，可選擇(3b)由第269個~第341個氨基酸殘基構成的氨基酸序列或其部分氨基 酸序列，可選擇(3c)由第274個~第341個氨基酸殘基構成的氨基酸序列或其部分氨基酸序 列，或可選擇(3d)由第294個~第個氨基酸殘基構成的氨基酸序列或其部分氨基酸序 列。（3a)~（3d)的氨基酸序列中，具有減少氨基酸殘基數而能夠減輕疏水凝集的傾向。其 中，由于具有能夠更可靠地抑制疏水凝集的傾向，因此優選選擇(3d)的氨基酸序列。
[0122] 在此，多膚(a)~(d)優選還包含由下述(3a-i)~(3a-iii)中的任一個氨基酸序列 構成的第3區域的多膚。
[0123] (3a-i)由序列號1表示的氨基酸序列中由第56個~第341個氨基酸殘基構成的氨 基酸序列或其部分氨基酸序列、
[0124] (3a-ii)與（3a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80% W上、優選90% W 上、更優選95 % W上的同源性的氨基酸序列、及
[0125] (3a-iii)相對(3a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加 1或數 個、優選1個~5個氨基酸的氨基酸序列。
[01%] 并且，多膚(a)~(d)優選還包含由下述(3b-i)~(3b-iii)中的任一個氨基酸序列 構成的第3區域的多膚。
[0127] (3b-i)由序列號1表示的氨基酸序列中由第269個~第341個氨基酸殘基構成的氨 基酸序列或其部分氨基酸序列、
[01%] (3b-ii)與（3b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80% W上、優選90% W 上、更優選95 % W上的同源性的氨基酸序列、及
[0129] (3b-iii)相對(3b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加 1或數 個、優選1個~5個氨基酸的氨基酸序列。
[0130] 第4區域從對培養皿的吸附性的觀點考慮，可設定為由第374個~第459個氨基酸 殘基構成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，可設定為由第374個~第409個氨基酸殘基構 成的氨基酸序列或其部分氨基酸序列，或可設定為由第374個~第379個氨基酸殘基構成的 氨基酸序列或其部分氨基酸序列。
[0131] 其中，除了對培養皿的吸附性W外，從制作多膚時易于抑制疏水凝集的方面考慮， 優選第374個~第379個，通過減少所選擇的氨基酸數具有減輕疏水凝集的傾向。
[0132] 在此，多膚(a)~(d)優選還包含由下述(4a-i)~(4a-i i i)中的任一個氨基酸序列 構成的第4區域的多膚。
[0133] (4a-i)由序列號1表示的氨基酸序列中由第374個~第459個氨基酸殘基構成的氨 基酸序列或其部分氨基酸序列、
[0134] (4a-ii)與(4a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80% W上、優選90% W 上、更優選95 % W上的同源性的氨基酸序列、及
[0135] (4a-iii)相對(4a-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或數 個、優選1個~5個氨基酸的氨基酸序列。
[0136] 并且，優選還包含由下述(4b-i)~(4b-iii)中的任一個氨基酸序列構成的第4區 域的多膚。
[0137] (4b-i)由序列號1表示的氨基酸序列中由第374個~第409個氨基酸殘基構成的氨 基酸序列或其部分氨基酸序列、
[0138] (4b-ii)與（4b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80% W上優選90% W 上、更優選95 % W上的同源性的氨基酸序列、及
[0139] (4b-iii)相對(4b-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或數 個、優選1個~5個氨基酸的氨基酸序列。
[0140] 多膚(a)~(d)進一步優選還包含由下述(4c-i)~（4c-iii)中的任一個氨基酸序 列構成的第4區域的多膚。
[0141] (4c-i)由序列號1表示的氨基酸序列中由第374個~第379個氨基酸殘基構成的氨 基酸序列或其部分氨基酸序列、
[0142] (如-1〇與所述（4(3-〇的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80%^上、優選 90% W上、更優選95% W上的同源性的氨基酸序列、及
[0143] (4c-iii)相對(4c-i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或數 個、優選1個~5個氨基酸的氨基酸序列。
[0144] 構成第3區域及第4區域的氨基酸序列的部分氨基酸序列是指在規定范圍的氨基 酸殘基中由連續的3個W上氨基酸殘基構成的氨基酸序列。運些部分氨基酸序列的氨基酸 殘基數可在不超過上述的多膚(d)的總氨基酸殘基數的范圍內選擇。
[0145] 多膚(a)~(d)通過包含第3區域，具有有利于提高與培養皿的吸附性的傾向。通過 包含第4區域，多膚(a)~(d)具有進一步有利于提高與培養皿的吸附性的傾向。多膚(a)~ (d)可只具有第3及第4區域中的任一個，也可具有兩者。
[0146] 并且，多膚(a)~(d)的GRAVY值從調整容易性的觀點考慮，優選通過構成第3及第4 區域的氨基酸序列中的氨基酸殘基數的增減、氨基酸殘基的缺失、取代或附加等來調整，尤 其，更優選調整構成第3區域的氨基酸序列的長度。
[0147] 多膚(a)~(d)可W不包含序列號1中示出的氨基酸序列中第56個~第131個中包 含的氨基酸殘基，也可W不包含第56個~第268個中包含的氨基酸殘基，也可W不包含第 269個~第273個中包含的氨基酸殘基，或也可W不包含第50個~第293個中包含的氨基酸 殘基。可推測由運些氨基酸殘基構成的氨基酸序列對多膚(a)~(d)的多能性細胞培養的性 能沒有幫助，從與培養皿的吸附的觀點考慮可選擇適當的序列。
[0148] 當第3區域包含與由序列號1表示的序列的半脫氨酸殘基對應的氨基酸殘基時，在 該半脫氨酸殘基的位置可具有半脫氨酸殘基W外的氨基酸殘基。由此，能夠防止由半脫氨 酸殘基引起的分子內或分子之間交聯的形成，因此優選。作為取代半脫氨酸殘基的其他氨 基酸殘基，并無特別限制，可優選列舉絲氨酸殘基、丙氨酸殘基或甘氨酸殘基。其中，從具有 與半脫氨酸類似的結構的方面考慮，優選絲氨酸殘基或丙氨酸殘基。
[0149] 并且，多膚(a)~(d)，在不損壞細胞粘附性及對支撐體的細胞培養表面的吸附性 的范圍內，可具有上述W外的其他附加的任意氨基酸殘基。作為由運種其他任意氨基酸殘 基構成的序列，例如可舉出為了通過重組技術容易地制作多膚(a)~（d)而附加的附加序 列。作為運種附加序列，可列舉N末端側的蛋氨酸殘基、N末端側的GPLG序列、標簽序列(例如 谷脫甘膚S-轉移酶(GST )、化AG標簽、Hi S標簽等）、各區域之間可附加的連接序列（例如， GGGS、GGGGS、GGGGGS等)等。
[0150] 多膚(a)~（d)可通過本領域技術人員已知的氨基酸合成技術或基因重組技術來 制造。
[0151] 當通過基因重組技術獲得多膚(a)~(d)時，具體而言，首先取得對成為對象的氨 基酸序列進行編碼的基因，并將其組裝到表達載體中，W制作重組表達載體，并將其導入于 適當的宿主中W制作轉化體。通過在適當的培養基中培養所得到的轉化體，能夠生成作為 目標的多膚，因此通過常規方法從培養物回收作為目標的多膚，由此能夠獲得多膚(a)~ (d)。
[0152] 多膚(a)~k)或(d)從細胞增殖性及未分化多能干細胞的未分化狀態下的增殖能 力等觀點考慮，優選為由80個~450個氨基酸殘基構成的多膚(A)，其包含：
[0153] (1)由下述氨基酸序列構成的第1區域，所述氨基酸序列由序列號1表示的氨基酸 序列的第1個~第47個氨基酸殘基構成；
[0154] (2)由下述氨基酸序列構成的第2區域，所述氨基酸序列由序列號1表示的氨基酸 序列的第342個~第373個氨基酸殘基(序列號3,肝素結合域)構成；W及選自由W下第3區 域及第4區域構成的組中的至少一個：
[0155] (3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列構成的第3區域，所述氨基酸序列由序 列號1表示的氨基酸序列的第269個~第341個氨基酸殘基構成;及
[0156] (4)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列構成的第4區域，所述氨基酸序列由序 列號1表示的氨基酸序列的第374個~第459個氨基酸殘基構成。
[0157] 并且，多膚(a)~（C)或(d)從細胞增殖性及未分化多能干細胞的未分化狀態下的 增殖能力等的觀點考慮，優選為由100個~450個氨基酸殘基構成的多膚(B)，其包含：
[0158] (1)由下述氨基酸序列(包含由序列號2表示的氨基酸序列與RGD序列）構成的第1 區域，所述氨基酸序列由序列號1表示的氨基酸序列的第1個~第44個氨基酸殘基構成；
[0159] (2)由下述氨基酸序列構成的第2區域(肝素結合域），所述氨基酸序列由序列號3 表示的氨基酸序列的第342個~第373個氨基酸殘基構成；W及選自由W下第3區域及第4區 域構成的組中的至少一個：
[0160] (3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列構成的第3區域，所述氨基酸序列由序 列號1表示的氨基酸序列的第269個~第341個氨基酸殘基構成;及
[0161] (4)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列構成的第4區域，所述氨基酸序列由序 列號1表示的氨基酸序列的第374個~第459個氨基酸殘基構成。
[0162] 多膚(a)~（C)從細胞增殖性及未分化多能干細胞的未分化狀態下的增殖能力等 的觀點考慮，優選為由400個~550個氨基酸殘基構成的多膚(A)，其包含：
[0163] (1)由下述氨基酸序列構成的第1區域，所述氨基酸序列由序列號1表示的氨基酸 序列的第1個~第47個氨基酸殘基構成；
[0164] (2)由下述氨基酸序列構成的第2區域(序列號3,肝素結合域），所述氨基酸序列由 序列號1表示的氨基酸序列的第342個~第373個氨基酸殘基構成；W及選自由W下第3區域 及第4區域構成的組中的至少一個：
[0165] (3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列構成的第3區域，所述氨基酸序列由序 列號1表示的氨基酸序列的第269個~第341個氨基酸殘基構成;及
[0166] (4)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列構成的第4區域，所述氨基酸序列由序 列號1表示的氨基酸序列的第374個~第459個氨基酸殘基構成。
[0167] 并且，多膚(a)~(C)從細胞增殖性及未分化多能干細胞的未分化狀態下的增殖能 力等的觀點考慮，優選為由400個~550個氨基酸殘基構成的多膚(B)，其包含：
[0168] (1)由下述氨基酸序列構成的第1區域，所述氨基酸序列由序列號1表示的氨基酸 序列的第1個~第55個氨基酸殘基構成；
[0169] (2)由下述氨基酸序列構成的第2區域(序列號3,肝素結合域），所述氨基酸序列由 序列號1表示的氨基酸序列的第342個~第373個氨基酸殘基構成；W及選自由W下第3區域 及第4區域構成的組中的至少一個：
[0170] (3)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列構成的第3區域，所述氨基酸序列由序 列號1表示的氨基酸序列的第269個~第341個氨基酸殘基構成;及
[0171] (4)由下述氨基酸序列或其部分氨基酸序列構成的第4區域，所述氨基酸序列由序 列號1表示的氨基酸序列的第374個~第459個氨基酸殘基構成。
[0172] 并且，上述多膚(A)或(B)進一步優選GRAVY值為-2.0~-0.95的多膚。
[0173] 并且，作為多膚(d)的上述多膚(A)優選氨基酸殘基數為80個~250個。
[0174] 而且，作為多膚(d)的上述多膚(A)或(B)，進一步優選GRAVY值為-2.0~-0.95且氨 基酸殘基數為80個~250個的多膚。
[01巧]進而，作為多膚(d)的上述多膚(A)，進一步優選GRAVY值為-1.70~-0.975且氨基 酸殘基數為80個~250個的多膚。
[0176] 并且，作為多膚(d)的上述多膚(A)或(B)優選氨基酸殘基數為100個~250個。
[0177] 而且，作為多膚(d)的上述多膚(A)或(B)，進一步優選GRAVY值為-2.0~-0.95且氨 基酸殘基數為100個~250個的多膚。
[017引進而，作為多膚(d)的上述多膚(A)或(B)，進一步優選GRAVY值為-1.70~-0.975且 氨基酸殘基數為100個~250個的多膚。
[01巧]進而，作為多膚(d)的上述多膚(A)或(B)，進一步優選GRAVY值為-1.70~-0.975且 氨基酸殘基數為100個~170個的多膚。
[0180] W下列舉多膚(a)~(C)或(d)的一例，但本發明并不限定于運些。
[0181] [表 1]
[0182]
[0183] 作為本發明所設及的多膚(a)~(C)或(d)的優選例可列舉：
[0184] (dl)具有由序列號4~序列號23、序列號38及序列號39中的任一個表示的氨基酸 序列的多膚；
[0185] (d2)具有與由序列號4~序列號23、序列號38及序列號39中的任一個表示的氨基 酸序列的同源性為80% W上、優選90% W上、更優選95% W上的氨基酸序列且具有多能干 細胞的培養性能的多膚;或
[0186] (d3)具有序列號4~序列號23，序列號38及序列號39中的任一個表不的氨基酸序 列中缺失、取代或附加1或數個、優選1個~5個氨基酸的氨基酸序列且具有多能干細胞的培 養性能的多膚，
[0187] 作為更優選例可列舉：
[0188] (d4)由序列號4~序列號23、序列號38及序列號39中的任一個表示的氨基酸序列 構成的多膚；
[0189] (d5)由與序列號4~序列號23、序列號38及序列號39中的任一個表示的氨基酸序 列的同源性為80% W上、優選90% W上、更優選95% W上的氨基酸序列構成且具有多能干 細胞的培養性能的多膚;或
[0190] (d6)由序列號4~序列號23、序列號38及序列號39中的任一個表示的氨基酸序列 中缺失、取代或附加1或數個、優選1個~5個氨基酸的氨基酸序列構成且具有多能干細胞的 培養性能的多膚。
[0191] 另外，在本說明書中，有時將多膚(a)、多膚化）、多膚(C)及多膚(d)統稱為"特定多 膚"。即，"特定多膚"是指多膚(a)~(d)中的任一個或兩個W上。
[0192] <多膚組合物>
[0193] 多膚組合物包含選自由上述多膚(a)~k)構成的組中的至少一種，且選自由多膚 (a)~k)構成的組中的至少一種且通過第1區域所包含的半脫氨酸殘基而進行分子之間交 聯的二聚體W上的多聚體多膚為多膚組合物所包含的多膚的總質量的20質量％ ^下。并 且，在多膚組合物為包含上述多膚(d)的組合物的情況下，多膚(d)且通過第1區域所包含的 半脫氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體W上的多聚體多膚為多膚組合物所包含的多 膚的總質量的20質量％ ^下。多膚組合物在各自的多膚組合物中可包含選自由多膚(a)~ (C)構成的組中的至少一種及多膚(d)兩者，在運種情況下，選自由多膚(a)~（d)構成的組 中的至少一種且通過第1區域所包含的半脫氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體W上的 多聚體多膚為多膚組合物所包含的多膚的總質量的20質量％ W下。
[0194] 目P，當多膚(a)~(d)所包含的第1區域中存在一個W上半脫氨酸殘基時，第1區域 的半脫氨酸殘基在與存在于其他多膚中的第1區域的半脫氨酸殘基之間形成分子之間交 聯，由此能夠形成多膚的二聚體W上的多聚體。若通過第1區域所包含的半脫氨酸殘基而進 行分子之間交聯的多膚(a)~(d)的多聚體W超過組合物所包含的多膚的總質量的20%的 含率來存在于多膚組合物中，則多能干細胞的增殖能力被損壞。另外，相對于本說明書中的 多膚的總質量的多聚體的含率是指在組合物中存在多種多膚的情況下，設定為相對于組合 運些多膚的總體的總質量的多聚體的含量(率）。
[0195] 多膚組合物中的多膚(a)~(d)的多聚體的含率，從促進多能干細胞的增殖能力的 觀點考慮，優選為組合物所包含的多膚的總質量的15質量％^下，更優選為10質量％ W下， 尤其優選為5質量％ W下。
[0196] 多膚組合物進一步從多能干細胞的培養性能的觀點考慮，通過第1區域的半脫氨 酸殘基的分子之間交聯的多聚體W外的、通過多膚中任一位置的半脫氨酸殘基而進行分子 之間交聯的二聚體W上的多聚體多膚優選為組合物所包含的多膚的總質量的20質量％ W 下，更優選為15質量％^下，更優選為10質量％^下，進一步優選為5質量％ W下。
[0197] 多膚組合物中多膚(a)~(d)的多聚體的含率，例如，通過使用"ImageJ"(美國國立 衛生研究所(NIH:化tional Institutes of Health)提供)等圖像分析軟件分析能夠算出 通過常規方法實施的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鋼-聚丙締酷胺凝膠電泳法)的結果。
[0198] 多膚組合物中的多膚(a)~(d)從促進并提高多能干細胞的增殖的觀點考慮，更優 選包含含于第1區域且在由序列號1表示的氨基酸序列中相當于第25個氨基酸殘基的半脫 氨酸殘基與相當于第31個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基之間進行分子內交聯的多膚，進一步 優選包含包含于第1區域且分別在由序列號1表示的氨基酸序列中相當于第5個氨基酸殘基 的半脫氨酸殘基與相當于第9個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基之間、相當于第19個氨基酸殘 基的半脫氨酸殘基與相當于第21個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基之間、相當于第25個氨基酸 殘基的半脫氨酸殘基與相當于第31個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基之間、及相當于第32個氨 基酸殘基的半脫氨酸殘基與相當于第39個氨基酸殘基的半脫氨酸殘基之間進行分子內交 聯的至少一種多膚(a)~(d)。
[0199] 本發明的多膚組合物可包含多膚(a)~(d) W外的多膚。當多膚組合物為包含選自 多膚(a)~（C)中的至少一種多膚的多膚組合物時，從更有效地獲得本發明效果的觀點考 慮，多膚(a)~(d)的總含率優選為組合物的85質量％^上，更優選為90質量％ W上，進一步 優選為95質量％ ^上，尤其優選為99質量％ ^上。并且，當多膚組合物為包含多膚(d)的多 膚組合物時，從更有效地獲得本發明效果的觀點考慮，多膚(a)~(d)的總含率優選為組合 物的85質量％ ^上，更優選為90質量％ ^上，進一步優選為95質量％ ^上，尤其優選為99質 量％ W上。
[0200] 多膚組合物所包含的多膚與纖溶酶原激活物抑制劑-1 (Plasminogen activator inhibitor-1 :PAI-1)的結合常數從多能干細胞的培養性能的觀點考慮，優選大于0.06。具 有通過第25個的半脫氨酸殘基與第31個的半脫氨酸殘基形成的分子內交聯的多膚已知有 相對纖溶酶原激活物抑制劑-1 (Plasminogen activator inhibitor-l: PAI-I)顯示結合性 的情形。因此，表示相對PAI-I的結合常數越低，具有通過第25個半脫氨酸殘基與第31個半 脫氨酸殘基形成的分子內交聯的多膚越少。從促進多能干細胞的增殖的觀點考慮，組合物 中的多膚與PAI-I的結合常數優選為0.1 W上，進一步優選為0.22W上。另外，對于組合物中 的多膚與PAI-I的結合常數的上限值并無特別限制，但從與在所有多膚中各結合有1分子 PAI-I的情況相當的方面考慮，優選1.OW下。
[0201] 多膚中的半脫氨酸殘基具有在與相同多膚中的其他半脫氨酸殘基之間或其他多 膚中的半脫氨酸殘基之間交聯的傾向。通過調整氧化還原條件能夠控制與其他多膚中的半 脫氨酸殘基之間形成的分子之間交聯的形成是公知的，例如，可舉出Sinha N.K.et al. J Biol Chem. 250pp. 8624-8629，1975所記載的方法。
[0202] 具體而言，可通過包含如下工序的制造方法獲得作為目的的多膚(a)~(d)，即，審U 備組合尿素、脈鹽酸鹽等改性劑W使改性劑濃度成為4M~8M的反應溶液的工序;在得到的 反應溶液中，W規定的比例例如還原劑與氧化劑WlO: 1~2:1的比例(還原劑:氧化劑(摩爾 比））來共存還原型谷脫甘膚及半脫氨酸等的還原劑與氧化型谷脫甘膚及脫氨酸等氧化劑 的工序;將包含還原劑及氧化劑的反應溶液中的改性劑的濃度逐漸降至OM~0.5M的工序。
[0203] 本發明的多膚組合物可W是如下多膚組合物，即包含選自由多膚(a)~(C)構成的 組中的至少一種，且通過多膚中所包含的半脫氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體W上 的多聚體多膚為組合物所包含的多膚的總質量的20質量％ ^下。本方式的多膚組合物中， 通過多膚(a)~（C)中的任一位置的半脫氨酸殘基而進行分子之間交聯的多聚體的含率為 組合物所包含的多膚的總質量的20質量％ ^下。因此，本方式的多膚組合物也與前述的多 膚組合物相同能夠提高多能干細胞的增殖性能。
[0204] 關于可包含于本方式的多膚組合物中的多膚(a),對于所有與其他方式的多膚組 合物有關的前述的事項，只要能夠適用于本方式的多膚組合物中的多膚(a),可直接沿用前 述的事項，優選范圍也可直接沿用。
[0205] 可包含于本方式的多膚組合物中的多膚(b)只要是具有與由序列號1表示的氨基 酸序列的同源性為80% W上的氨基酸序列且具有多能干細胞的培養性能的多膚，可W是具 有任意序列的多膚，也可W不具有上述的（1-i)~（1-iii)的氨基酸序列。對于所有與由序 列號1表示的氨基酸序列的同源性有關的事項、可含有多膚(b)的氨基酸序列及GRAVY值等 其他方式的多膚組合物有關的前述的事項，只要能夠適用于本方式的多膚組合物中的多膚 化），可直接沿用前述的事項，優選范圍也可直接沿用。
[0206] 可包含于本方式的多膚中的多膚(C)，只要是具有序列號1中缺失、取代或附加1或 數個氨基酸的氨基酸序列且具有多能干細胞的培養性能的多膚，可W是具有任意序列的多 膚，也可W不具有上述的（1-i)~（1-iii)的氨基酸序列。對于所有由序列號1表示的氨基酸 序列中缺失、取代或附加的氨基酸的數量及種類、可含有多膚(b)的氨基酸序列、GRAVY值等 其他方式的多膚組合物有關的前述的事項，只要能夠適用于本方式的多膚組合物中的多膚 (C)，可直接沿用前述的事項，優選范圍也可直接沿用。
[0207] <多能干細胞的培養方法>
[0208] 本發明的多能干細胞的培養方法包含在上述的多膚組合物的存在下培養多能干 細胞的階段。根據本培養方法，能夠更有效地增殖多能干細胞。
[0209] 多能干細胞的培養方法從促進多能干細胞的增殖的觀點及操作性的觀點考慮，包 含在支撐體的細胞培養表面賦予本發明所設及的多膚組合物，W得到多膚包覆培養表面的 階段（W下，稱為培養表面制備工序)及在多膚包覆培養表面上接種多能干細胞而進行培養 的階段(W下，稱為培養工序）。
[0210] 作為本發明所設及的多能干細胞優選為靈長類動物的多能干細胞，具體而言，包 含胚胎干細胞化S細胞）、誘導型多能干細胞（iPS細胞）、成體干細胞、受精卵內部細胞團細 胞及早期胚細胞等，運些細胞可使用一種或根據需要混合使用兩種W上。iPS細胞中包含在 NaUire，2007July 19;Vol.448，pp.313-317;Cell,2006,August 25;Vol. 126(4)，卵.663-676中所記載的細胞或與此類似的細胞。
[0211] 其中，作為本發明中優選適用的多能干細胞的例，可列舉細胞。
[0212] 另外，作為靈長類動物，可列舉人、猴子及猩猩等，尤其優選與所使用的多膚(a)~ (d)同屬的人。適用于本發明中的成分或物質，只要是來源于靈長類動物的成分或物質，貝U 作為來源于同種動物的成分或物質而能夠優選適用于本發明中。
[0213] 作為用于培養的培養液，可根據成為培養對象的細胞的種類適當選擇。作為可使 用的培養液，可W是公知的任何培養液，例如，可列舉Essential8、DMEM、MEM、F12、DME、 RPMI1640、MCDB104、199、MCDB153、LI 5、SkBM 及 Basal 培養基等，優選為 Essent ial8。
[0214] 并且，運些培養液中可添加通常能夠添加的各種成分，例如葡萄糖、FBS(胎牛血 清)或人血清、抗生素(青霉素、鏈霉素等）。另外，添加血清時的濃度，可根據當時的培養狀 態進行適當變更，但通常可設定為10% (v/v)。
[0215] 其中，作為其他的成分優選為水、鹽(鋼、鐘、儀、巧等的氯化物、氨氧化物、碳酸化 物等的無機鹽及丙酬酸鋼等的有機鹽）、氨基酸（必需氨基酸及非必需氨基酸）、維生素(核 黃素、生物素、氯鉆胺素、抗壞血酸及抗壞血酸衍生物等）、微量元素(砸、鐵、鋒、銅等）、碳源 (D-葡萄糖等）、FGF(堿性成纖維細胞生長因子FGF-2等）、TGF-e、膜島素及轉鐵蛋白的培養 基。
[0216] 本發明的培養方法中，優選在不存在來源于異種動物的成分下培養多能干細胞。 由此，能夠W較高的精度來排除混入來源于異種動物的異物的可能性。作為不存在來源于 異種細胞的成分下的培養，可舉出使用不含有來源于異種動物的成分的培養液的培養及不 使用來源于異種動物的飼養細胞等的培養等。
[0217] 而且，本發明的培養方法中，優選在不存在來源于異種動物的成分及血清成分下 培養多能干細胞。由此，能夠進一步排除來源于異種動物的成分的混入。
[0218] 作為不含有來源于異種動物的成分的培養基，可使用由含有非必需氨基酸、谷氨 酸、e-琉基乙醇、FGF-2、TGF-e、膜島素及轉鐵蛋白等培養基成分中的至少一種的低滲透壓 培養基構成的混合培養基。具體而言，可使用TeSR2(StemCell Technologies Inc.)及 Essential8(Life Technology, Inc.)等培養基，但并不限定于此。
[0219] 另外，細胞的培養中，可適用常規培養條件例如在37°C的溫度下5%(v/v)0)2濃度 的培養箱（in州bator)內的培養。
[0220] 多能干細胞的培養及繼代方法中，可使用用于維持多能干細胞而使用的常規的培 養基。具體而言，例如可列舉mTeSR、TeSR2(StemCell Technologies Inc.)等。通過常規方 法進行對培養基的多能干細胞的接種。另外，一系列繼代中使用的培養基可W不一定相同， 只要能夠將多能干細胞維持在未分化狀態，則也可W是不同的培養基。
[0221] 培養表面制備工序中包含多膚包覆培養表面對于支撐體的培養表面賦予含有規 定量的特定多膚的涂布溶液的階段。由此，通過特定多膚能夠包覆培養表面。
[0222] 涂布溶液中的特定多膚的總含量，根據成為涂布對象的培養表面的種類或大小有 所不同，但從對培養表面的吸附能力的觀點考慮，優選設定為Ipmol/cm 2~1000 pmo Vcm2，更 優選設定為10化mol/cm2~300pmol/cm2。作為為了制備涂布溶液而使用的水性介質并無特 別限制，例如可列舉憐酸緩沖液、Tris緩沖液及超純水等。
[0223] 對于涂布，可賦予涂布溶液后，保持規定時間例如30分~24小時左右，由此無需特 別處理，而能夠在培養表面包覆特定多膚。
[0224] 培養工序包含在多膚包覆培養表面上接種多能干細胞而進行培養的階段。
[0225] 對于多能干細胞的接種密度及培養，并無特別限制，可直接適用常規進行的條件。 例如，作為IX IO3個/cm2~IX IO5個/cm2左右的接種密度，可按照上述的培養及繼代條件來 進行培養。并且可W Wl個/cm2~5個/cm2左右的接種密度并按照上述的培養及繼代條件來 培養10皿~100皿的細胞團。
[0226] 由此，W特定多膚包覆的培養表面上使多能干細胞操作性良好，并且在使用多膚 (d)的情況下，能夠維持未分化狀態而進行良好地增殖。
[0227] 而且，在特定多膚的存在下(優選進一步來源于異種動物的成分等的非存在下)培 養的多能干細胞能夠幾乎完全或大幅度地排除來源于試料等抗原性物質等異物混入的可 能性，通過該培養方法培養的多能干細胞對于醫療用途或與此相當的用途的使用能夠充分 地確保安全性。
[0228] 另外，根據使用特定多膚的培養方法，能夠W更低的成本且簡便的操作來培養多 能干細胞，不僅對醫療用途而且對研究領域中的需要也能夠作出巨大的貢獻。
[0229] <培養器>
[0230] 本發明中培養器是指具備具有細胞培養中使用的表面的支撐體的培養器。作為運 種支撐體，可直接使用本領域中作為細胞培養用支撐體而周知的培養器。作為支撐體原材 料的例，可包含塑料(例如，聚苯乙締、丙締臘-下二締-苯乙締樹脂、聚碳酸醋樹脂、聚醋樹 脂）、玻璃、微孔過濾器材料(例如，纖維素、尼龍、玻璃纖維、聚醋及聚碳酸醋）、W間歇式或 連續式在細胞培養中或基因工程學(例如生物反應器等）中使用的生物反應器用材料(可包 含中空纖維管或微載體珠。）及聚對苯二甲酸乙二醋、Teflon(注冊商標）、陶瓷及其相關聚 合物材料等。
[0231] 并且，支撐體也可W是由等離子體聚合薄膜包覆培養表面的支撐體。
[0232] 作為培養器的形態并無特別限制，可W是能夠適用于多能干細胞的培養的任何形 態。作為運種形態的容器的例，可列舉多孔板(例如，6孔、12孔、24孔、96孔）、培養皿(例如， 有蓋培養皿等）、管、培養瓶、滾瓶、振蕩培養瓶等。
[0233] 本發明所設及的培養器是具備具有細胞培養表面的支撐體及配置在支撐體的細 胞培養表面上的多膚組合物所包含的多膚的培養器。
[0234] 本培養器具有具備前述的本發明所設及的多膚組合物中的多膚即選自由多膚(a) ~(d)構成的組中的至少一種的培養表面。因此，特定多膚良好地吸附在培養表面，在特定 多膚上接種多能干細胞的情況下，操作性良好，并且，在使用多膚(d)的情況下，在維持未分 化狀態下能夠增殖多能干細胞。
[0235] 在此，培養器中的培養表面是指在接種細胞并進行生長發育時細胞能夠附著的表 面。
[0236] 本發明所設及的培養器可通過包含如下工序的制造方法制造，即準備具備具有細 胞培養表面的支撐體的培養器（W下，稱為"準備工序"）；在細胞培養表面賦予選自由多膚 (a)~(d)構成的組中的至少一種而進行吸附處理（W下，稱為"吸附處理工序"）。由此，能夠 容易地獲得本發明所設及的培養器。
[0237] 準備工序中準備具備具有培養表面的支撐體的培養器。支撐體在培養表面具有等 離子體聚合薄膜的情況下，可包含在支撐體上形成等離子體聚合薄膜的工序。對于形成等 離子體聚合薄膜的方法，可直接適用常規方法。
[0238] 吸附處理工序中包含在培養表面賦予特定多膚并進行保持的工序。吸附處理工序 中，可通過制備W規定量含有特定多膚的吸附液而賦予培養表面并保持規定時間，由此特 定多膚吸附于培養表面。
[0239] 對于吸附處理工序，可直接適用在培養方法中W多膚包覆培養表面制備工序來說 明的事項。
[0240] 實施例
[0241] W下，通過實施例詳細說明本發明。但是，本發明并不受它們的任何限定。另外，若 無特別說明，"％"為質量基準。
[0242] [參考例1]
[0243] <多膚的制備>
[0244] 通過利用PCR的常規方法，對將具有表2及表3所示的氨基酸序列的RCP-I~RCP-17 的各多膚進行編碼的基因序列進行擴增。另外，RCP-Il相當于天然人玻連蛋白的序列。另 夕h將與各多膚的氨基酸序列對應的天然人玻連蛋白的氨基酸序列（序列號1)中的位置示 于表2及表3中的"NOTE"欄。其中，各多膚的氨基酸序列中，有時包含對表中所記載的對應范 圍的天然人玻連蛋白的氨基酸序列進行附加、刪除或取代的氨基酸序列。另外，RCP-I~ RCP-IO及RCP-17相對于由上述的序列號4~13及序列號38表示的各個氨基酸序列，除了在N 末端具有蛋氨酸W外，由相同的氨基酸序列構成。
[0245] 對于RCP-I~RCP-IO及RCP-17,在預先通過NcoKTAKARA BIO INC.)進行切斷處理 的pET-28b( + )中，使用InI^sion Advantage PCR Cloning Kit(商品名，Clontech Laboratories , Inc)插入目標基因，W構筑各表達用載體。對于RCP-Il~RCP-16，預先通過 BamHKTAKARA BIO INC.)進行切斷處理的 pGEX-6P-l(GE Healthcare Japan Corporation)中，W與上述同樣的方法插入目標基因，W構筑各表達用載體。表達用載體的 序列，通過序列分析進行確認。
[0246] [表 2]
[0247]
[0248] [表 3]
[0249]
[0250] 使用已制作的RCP-I~RCP-IO及RCP-17的表達載體，通過常規方法轉換為化21 (DE3)pLysS(Novagen)，并涂布于含卡那霉素 LB板上，在37°C下解育16個小時。通過菌落直 接PCR法確認載體的導入后，在添加 ImM的IPTG(異丙基-P-D-硫代半乳糖巧，Wako Pure 化emical Industries,Ltd.)的含卡那霉素 LB中，在37°C下振蕩培養5個小時，W誘導多膚 的表達。
[0251] 通過離屯、處理回收菌體，并用清洗用緩沖液(20mM Tris，150mM化Cl，pH7.6)再懸 浮菌體。通過聲波降解法破碎菌體后，W1500化pm、30min、4°C的條件進行離屯、，W回收不溶 性級分。用包含0.5質量％Triton XlOO的清洗用緩沖液進行清洗后，用低濃度尿素緩沖液 (Xow Urea BufferJOmM IYisJSOmM PfeClJM尿素，pH7.6)進行再懸浮，并進行聲波降解 法處理。通過離屯、處理回收不溶性級分后，添加高濃度尿素緩沖液化igh Urea Buffer: 20mM化is，150mM化Cl，8M尿素，pH7.6)，并通過聲波降解法處理對不溶性級分進行可溶 化。
[0巧2] 將包含通過上述方法得到的目標膚的溶液，使用AKTA E邱IorerlOO(商品名，GE Healthcare Japan Corporation)及HiTrap Heparin HP 5ml(商品名，GE Healthcare Japan Corporation)進行精制。將前述的高濃度尿素緩沖液作為結合用緩沖液，并將高鹽 濃度調整緩沖液(20mM Tris，lM NaCl，8M尿素，pH7.6)作為溶出用緩沖液進行階段性溶出， W精制目標多膚。
[0巧3]使用上述中制備的RCP-Il~RCP-16的表達載體，通過常規方法轉換為BL21 (Novagen),并涂布于含氨節青霉素 LB板上，在37°C下解育16個小時。通過菌落直接PCR法確 認載體的導入后，在添加 IOOyM的IPTG的含氨節青霉素 LB中，在20°C下振蕩培養24個小時， W誘導多膚的表達。
[0254]回收菌體，并用B-PER(注冊商標）Bacterial Protein Extraction Reagent in Phosphate Buffer(商品名，Thermo FisherScientific Inc.)進行再懸浮后，通過聲波降 解法破碎菌體。Wl50(K)rpm、30min、4°C的條件進行離屯、，W除去不溶性級分，并使用AKTA E邱IorerlOO及GSlYapHPSml X 2(商品名，GE Healthcare Japan Coloration)精制上清 液。使用化prep 26/lODesalting(商品名，GE Healthcare Japan Coloration)對溶出級 分進行脫鹽，進一步W溶液量的1/2000添加 GST融合蛋白切斷用蛋白酶（PreScission Protease )，并在4°C下解育24個小時，切斷GST標簽。再通過GS化apHP 5ml X 2進行精制，將 已切斷的GST標簽吸附于色譜柱而除去。使用Slide-A-Lizer(商品名，3.5K MWCO. :Thermo Fisher Scientific Inc.,下同）對通過色譜柱的級分進行透析，并取代為PBS。
[0巧引將與上述一樣得到的RCP-I的多膚，利用LADY GEL(12.5% ,Bio-Rad Laboratories , Inc .)進行電泳，利用GelCode? BlueStain Reagent (商品名，Thermo Scientific Inc.)進行染色。其結果，在相當于由氨基酸序列預測的分子量為28.3kDa的位 置上可W確認到單一的條帶。對于其他多膚也得到了同樣的結果。
[0巧6] 對于RCP-I~RCP-IO及RCP-17,將精制后的各多膚溶液，使用Slide-A-Lizer(商品 名，3.5K麗CO.)進行透析。透析外液是W透析用緩沖液(PBS，1.5M化C1，0.5M心精氨酸， ImM EDTA，抑7.4)為基礎，并通過階段透析除去尿素。最終透析產物使用Nano化OP(商品名， Thermo Fisher Scientific Inc.)并根據280nm的吸光度計算出濃度。有無透析后的凝集 示于表4。
[0257] 并且，GRAVY值作為將每個氨基酸所確定的疏水性指標進行總和并除W氨基酸數 的值進行計算（參考 Kyte J. ,Doolittle R.F.( 1982)，J.Mol. Biol ,157:105-132) eGRA VY 值 為從各多膚所包含的氨基酸的疏水度計算的多膚的親疏水性的指標，值越大則表示越疏 水，值越小則表示越親水。將結果示于表4。
[0258] 并且對于有無凝集，則W W下的G、A及B來進行評價。結果一并示于表4。
[0259] G:未見凝集物形成。
[0260] A:可確認到粒徑IOOnm左右的顆粒形成。
[0261 ] B:可確認到粒徑Imm W上的可見凝集的形成。
[0%2][表 4]
[0264] 如表4所示，RCP-2~RCP-5、RCP-7~RCP-8、及RCP-17是氨基酸殘基數為約80個~ 約170個的多膚，雖然容易發生凝集，但GRAVY值在-1.70~-0.975的范圍，由此可知凝集的 形成被抑制。
[02化][參考例2]
[0%6] <對培養皿的吸附性評價>
[0267] 將通過上述方法得到的各多膚在規定的緩沖液中進行稀釋，W使其能夠WO~ 2(K)pmol/cm2的規定的最終濃度添加于孔中，并在結束等離子體處理的聚苯乙締制96孔板 (Tissue Culture-IYeated,falcon公司）中每次添加64化。在37°C下解育2個小時而將各多 膚吸附于板上后，用PBS清洗兩次，得到RCP-I~RCP-16的各多膚包覆表面。
[0268] 通過上述的方法得到的各多膚包覆表面中，對包覆RCP-I及RCP-Il~16的表面，分 別賦予64化棚酸緩沖液與IN的化0H，并在80°C且100%濕度下解育24個小時。空氣冷卻后， 在各孔中添加75化棚酸緩沖液，進一步添加 W1:100 (質量比）混合OPA(鄰苯二甲醒:Wako Pure 化emical Indushies ,Ltd.)/甲醇溶液（160mg/ml)與NAC(N-乙酷基-心半脫氨酸： Wako Pure Qiemical Industries,Ltd.)/棚酸緩沖液溶液（2mg/ml)的50化反應液。在40°C 下解育30分鐘后，使用Envision多標記分析儀（商品名，Perki址Imer公司）測量巧光強度 (激發355nm/巧光486nm)。通過另外各多膚溶液制作校準曲線，算出吸附量。將結果示于圖 1。圖1中黑色菱形表示RCP-I，黑色四邊形表示RCP-11，黑色S角形表示RCP-12，黑色圓形表 示RCP-13,白色菱形表示RCP-14,白色四邊形表示RCP-15,白色=角形表示RCP-16。
[0269] 如圖1所示，試驗中使用的多膚中，使用包含PRPSLAKKQRFRHRNWGYRSQI^fflSRGRNQN (序列號3[由序列號1中的第342個~第373個氨基酸殘基構成的氨基酸序列])的RCP-U15、 16的多膚時，可知具有與具有人玻連蛋白序列的RCP-Il同等的良好的對板的吸附性。另一 方面，可知不含PRPSLAKKQRFRHRN服GYRSQRG服RGRNQN的RCP-13、14的吸附量相對于包含該 序列的多膚約為1/4較低。
[0270] [參考例3]
[0271] <細胞粘附性評價1>
[0272] 對于上述多膚的人iPS細胞（"Tic":細胞編號NO.JCRB1331:獨立行政法人醫藥基 盤研究所[567-0085大阪府茨木市彩都淺木7下目6番8號]分售)的細胞粘附性評價，按如下 進行。
[0273] 作為用于維持人iPS細胞的飼養細胞，使用EmbryoMax(注冊商標）（第一代小鼠胚 胎成纖維細胞：潮霉素抗性，經絲裂霉素 C處理，來源于巧7/化6,繼代第3代KMillipore Corporation)，并用DMEM(Invitrogen Corporation)、10% (v/v)胎牛血清培養基培養24個 小時，W粘附于T25燒瓶（商品名，Corning Inco巧orated)上。人細胞用培養基使用在表 5的組成的物質中添加 FGF-2(Sigma-al化ich Co丄LC.)使其最終濃度達到lOng/ml的物質。
[0274] [表 5]
[0275]
[0276] iPS細胞使用上述培養基，并在37°C下5%(v/v，下同）0)2培養箱內進行維持培養。 培養基除了細胞的接種次日W外，每天更換新的培養基。繼代操作通過用DISPASE(注冊 商標）II (neutral protease GradeII ,Roche公司）剝離細胞，并通過移液操作將細胞分離 成適當尺寸來實施。
[0277] 將與上述一樣培養的人iPS細胞，利用化ypLE Select(商品名，Invitrogen公司） 并在37 °C下處理5分鐘，分離成單個細胞。并W 30化pm離屯、2min回收細胞，并懸浮包含終濃 度IOiiM Y-27362((R)-( + )-反式-N-(4-化晚基）-4-(1-氨乙基)-環己酷胺? 2肥1 ?出0、化〇 結合激酶抑制劑，Wako化re化emical Industries,Ltd.)的TeSR2(商品名，不含來源于異 種動物的成分及血清成分的培養基，Stemcell Technologies Inc.)。
[027引將RCP-I~RCP-IO及亂?-17、肪?-11、亂?-15及亂?-16、及作為比較對照將人玻連 蛋白（從人血漿提取，BD bioscience Company)、重組層粘連蛋白（rLaminin-SiOriental Yeast Co. ,Ltd.及Human Recombinant Laminin-511 :Biolamina公司）分另。從達到表6所不 的添加濃度的方式，懸浮于規定的緩沖液(RCP-1~RCP-IO及RCP-17為上述的GRAVY值及凝 集特性的評價中使用的透析用緩沖液，3〔口-11、15、16、天然玻連蛋白及重組層粘連蛋白為 PBS)中，制備試料1~17,并添加于96孔板的各孔中，并在37°C下保持2個小時后進行吸附。 在得到的膚處理96孔板的各孔中，接種iPS細胞使其達到30000cells/孔的細胞密度。培養 24個小時后，通過PBS清洗除去非粘附細胞，并用4%多聚甲醒（Wako Pure化emical Industries ,Ltd.)只固定粘附細胞。使用Atto地OS(注冊商標)AP Fluorescent Substrate System(P;romega Coloration)計算出ALP活性，從校準曲線計算出具有ALP活性的未分化 iPS細胞數。將結果示于表6。表6中，對于細胞粘附率采用將基于使用天然玻連蛋白的試料 15的細胞粘附率設定為100時的相對值。n = 3。
[0279][表 6]
L0281J 如表6所示，具有序列號I所記載的序列的第I個~第44個的RCP-I~RCP-10、RCP-17及RCP-Il與天然人玻連蛋白的iPS細胞的細胞粘附率良好。尤其，不含序列號1所記載的 序列的第56個至第268個氨基酸的一部分或全部的RCP-I~RCP-IO及RCP-17與天然人玻連 蛋白W及具有與天然人玻連蛋白相同氨基酸序列的RCP-Il相比細胞粘附率更為良好。由 此，可知序列號1所記載的第1個~第44個序列中存在對細胞粘附重要的序列。
[0282] [參考例4]
[0283] <細胞粘附性評價2>
[0284] 通過Fmoc固相合成法合成表7所示的多膚。制作W13化mol/cm2的濃度吸附天然玻 連蛋白的表面后，W30,000cells/孔的比例接種添加 IOOiiM的上述合成膚的細胞懸浮液。W 與<細胞粘附性評價1>同樣的方法計算出接種24h后的粘附細胞數。將結果示于表7。表7 中，對于細胞粘附率采用將不含合成膚的培養液中的細胞粘附率設定為100時的相對值。n =3。
[0285] [表 7]
[0286]
[0287] 如表7所示，可知相對于通過添加包含CSYYQSC或RGD的化ptide-4、5及6而有意阻 礙細胞對天然玻連蛋白的粘附，在添加將不含CSYYQSC及RGD的P邱tide-1、2、3及化Ptide-5、6的RGD序列取代為RGE的Peptide-7、8時，沒有阻礙粘附。因此，可知通過多膚包含 CSYYQSC及RGD中的至少一個，能夠發揮細胞粘附能力。
[028引[參考例5]
[0289] <增殖評價>
[0290] 在吸附RCP-Ull及天然人玻連蛋白的96孔板中，W250cells/孔的比例接種W與 上述<細胞粘附性評價1 >同樣回收的iPS細胞，并在37°C下5 %C〇2培養箱內培養8天。W與 上述 <細胞粘附性評價1>同樣的方法計測各經時后的粘附細胞數，得到增殖曲線。將增殖 曲線示于圖2。另外圖帥，黑色菱形表示使用RCP-I的例，黑色四邊形表示使用RCP-Il的例。 [0巧 1] 同樣地，將RCP-I~10及RCP-17、及作為比較對照將Human Recombinant Laminin- 511分別W達到表8所示的添加濃度的方式制備試料I~12,在與上述<細胞粘附性評價1> 同樣地吸附各多膚的96孔板中，WSOOOcells/孔的比例進行接種，并在37°C下C〇2培養箱內 培養3天。W與上述 <細胞粘附性評價1>同樣的方法計測3天后的細胞數。將結果示于表8。 [0 巧 2][表 8] 「0巧31
[0294] 根據圖2，RCP-1顯示比具有天然玻連蛋白的氨基酸序列的RCP-Il更高的細胞增殖 性。RCP-11的細胞數在培養第8天為RCP-I的細胞數的約2/3左右。從得到的細胞數的增減計 算出倍增時間的結果，使用RCP-I的情況下為46.4± 2.1小時，使用RCP-11的情況下為67.7 ±2.1小時。
[0295] 并且根據表8，可知RCP-I~RCP-IO及RCP-17均比與玻連蛋白相同的細胞外基質即 層粘連蛋白的細胞增殖率高。可知即使將序列號1中的第274個半脫氨酸殘基取代為絲氨酸 殘基同樣也能獲得運種高的細胞增殖率。
[0296] 從圖2及表8的結果令人吃驚地發現，由對細胞增殖與培養皿的吸附有效的序列構 成，且不含相當于天然人玻連蛋白的第56個至第268個氨基酸的一部分或全部的序列的 RCP-I~RCP-IO及RCP-17具有比具有與人玻連蛋白同等的序列的RCP-Il及作為比較例的 Laminin-511更高的增殖能力。
[0巧7] 而且，根據表8,可知包含CSYYQSC的序列及RGD序列、 PRPSLAKKQRFRHRN 服 GYRSQRGHSRGRNQN 序列雙方的 RCP-I ~RCP-IO 及 RCP-17 均顯示高的細胞 增殖性。
[0巧引[參考例6]
[0299] <細胞粘附性評價3>
[0300] 除了將RCP-I用PBS來調整為125pmol/cm2~lOOOpmol/cm 2的濃度而使用W外，與上 述<細胞粘附性評價1>同樣地評價細胞粘附性。將結果示于表9。表9中，對于細胞粘附率 采用將相對于W13化mol/cm 2的濃度吸附天然玻連蛋白的培養器的細胞粘附率設定為100 時的相對值。n = 3。
[0301] [表 9] 「nono1
[0303] ~如表9所示，對RCP-I的iPS細胞的粘附性通過添加125pmol/cm2W上而顯示與天然' 玻連蛋白同等的細胞粘附率。
[0304] [參考例7]
[0305] <未分化維持評價>
[0306] 在TeSR2中懸浮與上述 <細胞粘附性評價1>同樣地回收的iPS細胞。在與上述< 細胞粘附性評價1>同樣地分別吸附上述<細胞粘附性評價1>中使用的試料1、試料2、試 料5、試料6及試料7的6孔板（Tissue culture-treated，Falcon Company)中接種iPS細胞， 并在37°C下C〇2培養箱內進行培養。培養基除了接種次日W外，每天更換新的培養基。每隔6 天W與前述同樣的方法進行繼代。將在各自的試料上培養的細胞的形態示于圖3。
[0307] 并且W本條件來培養1個月后，將細胞用4% (v/v)多聚甲醒來進行固定，并通過 l%(v/v)T;riton-X/PBS亢進膜透性。通過Image 口 Si即al Enhancer(商品名，Invitrogen 公司）進行粘連處理后，添加抗人NANOG抗體(AF1997，R&D Systems, Inc)、Alexa Fluor555 結合兔抗山羊I gG抗體（Invi trogen公司）及DAPI ( DOJINDO公司）并進行標記，并用巧光顯微 鏡進行拍攝。將運些巧光顯微鏡圖像示于圖4。
[0308] 圖3及圖4的各圖中，（A)表示在RCP-I上培養的iPS細胞，（B)表示在RCP-Il上培養 的iPS細胞，（C)表示在天然人玻連蛋白上培養的iPS細胞，（D)表示在rLaminin-5上培養的 iPS細胞，化)表示在rLaminin-511上培養的iPS細胞。比例尺：100皿。圖3中，左欄表示菌落 整體圖像，右欄表示放大圖像，圖4中，左欄表示DAPI染色圖像，右欄表示基于抗NANOG抗體 的染色圖像。圖3及圖4中的比例尺:200wii。
[0309] 如圖3所示，在包含對細胞增殖與培養皿的吸附有效的序列的RCP-Ull與天然人 玻連蛋白上進行培養的巧S細胞顯示出具有均質的菌落、且高的核占有率的未分化細胞的 特征形態。并且如圖4所示，在具有細胞增殖域及吸附域的RCP-Ull與天然人玻連蛋白上進 行培養的細胞在菌落整體中強烈表達NANOG，可知良好地維持了未分化狀態。
[0310] 從上述參考例1~7的評價結果可知，由包含CSYYQSC及RGD序列中的任一個與 PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRG服RGRNQN序列的40個~450個氨基酸殘基構成的多膚對支撐體 的細胞培養表面的吸附性優異。并且，運種多膚在與細胞的共培養條件下，就細胞的 細胞粘附性及未分化狀態的維持而言，與具有與天然玻連蛋白及人玻連蛋白同等序列的 RCP-Il是同等的，且就iPS細胞的增殖性而言，是比RCP-Il更優異的結果。可知RCP-I~RCP-10及RCP-17在巧S細胞的細胞粘附性及未分化狀態的維持方面均為良好。運種各能力的全 部中，在其他多膚或作為比較例的重組層粘連蛋白中未能獲得良好的結果。
[031。 因此，根據本發明所設及的（d)的多膚，能夠在未分化狀態下增殖多能干細胞，并 且能夠提供對細胞培養表面的吸附性優異的多膚與使用該多膚的多能干細胞的培養方法 及培養器。
[0312] [實施例。
[0313] <多膚組合物的制備>
[0314] 上述中得到的RCP-I~RCP-IO及RCP-17中，將RCP-17用于W下的實施例。
[0315] 將參考例1中得到的精制后的多膚RCP-17的溶液使用S1 i de-A-Li Z er (商品名， 3.5K MWCO.)進行透析。透析外液是W透析用緩沖液(PBS，1.5M化C1，0.5M k精氨酸，ImM 邸TA，pH7.4)為基礎，進行階段透析直至尿素濃度達到2M，并除去尿素。
[0316] 透析后，將多膚溶液Wl/10倍（v/v)稀釋于稀釋用緩沖液（2M尿素，PBS，1.5M 化Cl，0.5Mレ精氨酸，ImM抓TA，pH7.4)，接著為了進行多膚的氧化，將氧化緩沖液（2M尿 素，2mM氧化型谷脫甘膚[Wako Pure化emical Indushies,Ltd.]，20mM還原型谷脫甘膚 [Wako Pure 畑emical Industries，Ltd.]，PBS，1.5M 化C1，0.5M レ精氨酸，ImM EDTA， pH7.4)作為透析外液透析5天。接著在透析用緩沖液(PBS，1.5M化Cl，0.5M k精氨酸，ImM EDTA，pH7.4)進行透析而除去尿素。最終透析產物使用Amicon Ultra 3K(商品名， Mi 11 ipore Co;rporat ion)進行濃縮直至多膚濃度達到0.5mg/ml。
[0317]將最終透析產物在4 °C下靜置24h，并充分進行氧化，作為最終產物得到多膚組合 物1-1。使用NanoDrop(商品名，Thermo Fisher Scientific Inc.)并根據280nm的吸光度計 算出最終產物的濃度。
[0；31引另一方面，將參考例1中得到的精制后的多膚RCP-17的溶液使用Sl ide-A-Li zer (商品名，3.5K MWCO.)，并且將透析外液W透析用緩沖液(PBS，1.5M化C1，0.5M心精氨酸， ImM抓TA,pH7.4)為基礎，進行階段透析直至尿素濃度達到0M，W除去尿素，作為最終產物 得到比較用多膚組合物1-2。
[0319] <多膚組合物的性狀>
[0320] 分別將含有W上述方法得到的RCP-17的多膚的多膚組合物I-I及1-2與作為比較 例包含VTN-N(商品名，重組人玻連蛋白，Life Technologies)的多膚組合物1-3,使用非還 原SDS-PAGE(15質量％ ,ATTO CORPORATION)進行分離，并使用GelCode? Blue Stain Reagent(ThermC) Scientific Inc.)進行染色。將結果示于圖5。并且，通過使用ImageJ分析 得到的染色圖像來定量Band強度，并計算出單體及多聚體的存在比。將結果示于表10。
[0321] [表 10]
[0322]
[0323] 圖5中，對于通過階段透析只除去尿素的多膚組合物1-2及含有VTN-N的多膚組合 物1-3中的、能夠確認分子之間交聯的多聚體的形成，經多膚的氧化處理得到的多膚組合物 I-I中，沒有確認到RCP-17的多聚體。
[0324] 并且，如表10所示，實施例所設及的多膚組合物I-I中多聚體為約5質量％ W下。
[0325] [實施例2]
[0326] <細胞增殖性評價2>
[0327] 使用實施例1中得到的多膚組合物I-I~多膚組合物1-3進行了 W下的細胞增殖性 評價。
[0328] 將各多膚組合物I-I~I-3W使其在組合物中的多膚的濃度達到表11所示的最終 濃度的方式懸浮于規定的緩沖液(對于包含RCP-17的多膚組合物I-I及1-2采用參考例的 GRAVY值及凝集特性的評價中使用的透析用緩沖液，而對于包含VTN-N的多膚組合物1-3采 用PBS)中，W制備多膚液，并添加到具有等離子體處理細胞培養表面的等離子體處理劑聚 苯乙締制96孔板(BD Falcon)的各孔中，并在37°C下保持2個小時而進行吸附，得到具有多 膚包覆表面的膚處理96孔板。在得到的膚處理96孔板的各孔中，接種Wl: 1(體積比）混合 TeSR2(Stemcell Technologies Inc.)與Nutristem(注冊商標，Bio Industries Inc.)的 培養基中懸浮的細胞使其細胞密度達到1000 Ocel 1 s/孔。培養72個小時后，通過PBS清洗 除去非粘附細胞，用4質量％多聚甲醒(Wako Pure化emical Industries,Ltd.)只固定粘 附細胞。用Attophos(注冊商標）AP Fluorescent Substrate System(P;romega Corporation)計算出ALP活性，并從校準曲線計算出具有ALP活性的未分化iPS細胞數。將結 果示于表11。表11中，細胞增殖率W將使用重組層粘連蛋白進行培養時經過72個小時后的 細胞數設定為1OO %時的比例來表示。n = 3。
[0329] [表 11]
[0330]
[0331] 如表11所示，可知本發明的實施例所設及的多膚組合物I-I比多膚組合物1-2細胞 增殖性更優異。運表示通過多膚的多聚體的形成細胞增殖活性遭到破壞。
[0332] [實施例3]
[0333] <多膚組合物的制備>
[0334] 上述中得到的RCP-I~RCP-IO及RCP-17中，對于RCP-5WW下的方法實施了還原處 理。
[0335] 在包含RCP-5 的多膚溶液中添加 Tris(S-Carboxyethyl)Phosphine Hy化Ochloride(Wakc)化re 化emical Industries,Ltd.)使其終濃度達到IOOmM,并在4°C 下靜置2地，W制備試料A。
[0336] 作為比較，將包含RCP-5的多膚溶液W未處理的狀態在-80°C下進行凍結，W制備 試料B。
[0337] 將各自的試料使用Sl ide-A-Lizer (商品名，3.5K MWCO.)進行了透析。透析外液是 W透析用緩沖液(PBS，1.5M化C1，0.5M k精氨酸，ImM抓TA，pH7.4)為基礎，并通過階段透 析除去尿素，分別得到多膚組合物II-U試料A)及11-2(試料B)。
[033引 < 多膚的結構分析>
[0339] 使用化ptide Mass Finge巧rint法進行了二硫化物鍵的分析。詳情如下。
[0340] 1)蛋白質的酶消化
[0%1] 將50mM碳酸氨錠緩沖液(pH7.8)900化加入微量離屯、管中，并且分別添加10化L的 多膚組合物II-I及11-2。另外，添加10化的lOOiig/ml膜蛋白酶（Wako化re Chemical Industries ,Ltd.)或500ng/ml的Glu-C(Promega)，并在37°C下靜置一個晚上。將被消化的 片段化膚使用離屯、濃縮裝置(Buchi)進行濃縮直至達到10化L。
[0342] 2)脫鹽
[0%3] 將上述消化物10化使用Ziptip C15CHIP(商品名，Millipore)進行脫鹽，并作為測 量試料。
[0344] 3)MALDI-MS 測量
[0345] 使用叫traflexTOF/TOF(商品名，Bruker Daltonics)，并W33化m激光波長來測量 了試料。采用反射模式進行測量，同樣使用P邱tide calibration standard II(商品名， Bruker Daltonics，產品編號222570)，對m/z 700~4000的范圍進行了質量校正。非還原測 量中，混合膚消化物1化與C肥A基質(a-氯基-4-徑基肉桂酸）的0.1%TFA/此0-MeCN(2:1)飽 和溶液4化，并載持于祀板上。還原測量中，在祀板上混合膚消化物0.化L與40mM DTT溶液 (抑9.0 )0.扣L，并靜置20分鐘后，載持CHCA基質飽和溶液0.扣L，并進行干燥。將試料載持于 革己板之后的最終目標（On-target)清洗（脫鹽）按照從化址er Daltonics Co巧oration獲得 的操作指南進行實施。
[CX346] 4)測量值的評價
[0347] 對于得到的質量分析值通過Mascot server(商品名，Mahix Science Ltd.)進行 捜索，確定基于各自酶的片段化膚的序列。同樣，通過調查基于還原處理的片段化膚的質量 變化，確定片段化膚內所包含的半脫氨酸有關的二硫化物鍵的交聯位置。
[0；34引分析結果，關于多膚組合物II-I所包含的RCP-5的N末端側4個殘基（Cys5、切s9、 切sl9及切s21)，檢測出作為主成分的W切巧與切s9、切sl9與切s21為一對的進行分子內交 聯的組合物。并且只在多膚組合物II-2所包含的RCP-5中，觀測到切s39彼此進行分子之間 交聯的成分。
[0349] <PAI-1結合性評價>
[0350] 使用已知的與具有Cys25與Cyc31交聯的結構的多膚結合的Plasminogen Acitivator Inhibitor-I(PAI-I)，嘗試了Cys25與Cyc31 交聯結構的檢測。
[0巧1] 將上述多膚組合物II-I及11-2( lOOiig/ml)添加到聚苯乙締制的平面底、黑色96孔 板化alf-Area)中使其達到64化/孔。使用密封薄膜(Funakoshi Co . ,Ltd.)包覆板整體，并 在4°C下靜置而對各多膚組合物中的RCP-5進行固相。12個小時后，去掉孔內的液體，并添加 包含5%Bovine Serum A化Umin(Sigma)的TBS(NIPP0N GE肥 00.，1；10.)使其達到150化/ 孔。在37°C下靜置1個小時后，去掉孔內的液體，再添加 Blocker Casein(商品名，Thermo scientific)使其達到ISOiiL/孔，同樣在37°C下靜置而實施粘連。1個小時后，添加包含 0. 05%Tween20的TBS(TBST)使其達到15化L/孔，并連續從孔內去掉液體。實施4次該操作， 清洗孔內。
[0352] 接著，將使用TBS并從170nM至2.6nM依次進行等倍稀釋的重組體PAI-I(目錄編號 1786-PI，R&D systems)溶液，分別添加到孔內使其達到50化/孔，并在37°C下進行靜置。1個 小時后，從孔內去掉PAI-I溶液，W與前述同樣的方法并用TBST共清洗4次，除去未結合PAI- 1。 接著，將未標記anti-goat IgG H+L(目錄編號A10537，Life technologies)原液用TBS進 行700倍稀釋，并添加使其達到15化L/孔，在37 °C下靜置而再進行粘連。1個小時后，從孔內 去掉抗體溶液，W與前述同樣的方法并用TBST共清洗4次。然后，將抗PAI-I抗體（目錄編號 AF1786，R&D systems)原液用TBS進行100倍稀釋，并添加使其達到10化L/孔。在37°C下靜置 1個小時后，從孔內去掉抗體溶液，W與前述同樣的方法用共TBST清洗4次而除去未結合 Anti-PAI-I 抗體。
[0353] 而且，將HRP標記抗goat IgG抗體（目錄編號81-1620，Life technologies)原液用 TBS進行7500倍稀釋，并添加使其達到10化L/孔。在37°C下靜置1個小時后，從孔內去掉抗體 溶液，W與前述同樣的方法并用TBST共清洗4次而除去未結合標記抗體。接著，使用 QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate Kit(商品名，Thermo scientific)，并按 照說明書所記載的方法調整HRP基質，并添加使其達到50化/孔。在37°C下靜置20分鐘后，添 加附屬于同kit的停止液使其達到50化/孔，W停止反應。將激發、巧光波長分別設定為 330nm、410nm，并使用Envision(商品名，Perkinelmer)將RCP-5與PAI-I的結合作為相對巧 光單位進行了測量。
[0354]將得到的測量值設定為X軸，將測量值除WPAI-I添加濃度(nM)的值設定為巧由來 標繪的結果示于圖6。得到的直線相當于W下Scatchard Plot的式，因此從傾斜度可W計算 出結合常數化A)。
[0355]試）
[0；356] PAI-I 結合量/PAI-I 添加量= -KA X PAI-I 結合量
[0357] 將算出的結果示于表12。可知多膚組合物II -1中的RCP-5與多膚組合物II -2中的 RCP-5相比PAI-I的結合常數大，即存在較多Cys25、Cys31、分子內交聯體。
[0；35 引[表 12] L〇36〇」 < 細胞增殖性評價>
[0361] W與實施例3的<細胞增殖性評價2>所記載的方法同樣的方法，評價了多膚組合 物II-I及II-2的細胞增殖性。將結果示于表13。可知多膚組合物II-I與多膚組合物II-2相 比細胞增殖活性優異，即Cys25、Cys31、分子內交聯體結合的多膚的細胞增殖活性優異。
[0362] [表 13]
[0363]
[0364] 如此，本發明的多膚組合物為不是W通過人玻連蛋白N末端側的半脫氨酸殘基而 進行分子之間交聯的二聚體W上的多聚體的形態，而是W沒有進行分子之間交聯的單體的 形態，包含較多的包含規定的人玻連蛋白N末端側的部分序列且具備具有對多能干細胞的 細胞粘附能力的氨基酸序列的多膚的膚組合物。可知在運種多膚組合物的存在下有效地增 殖多能干細胞。
[0365] 因此，根據本發明，能夠提供可誘導多能干細胞的細胞培養性能尤其是優異的細 胞增殖能力的多膚組合物及使用其的多能干細胞的培養方法。
[0366] 2013年10月31日于日本申請的日本專利申請第2013-227583號的公開，通過參考 并將其內容全部援用于本說明書中。
[0367]本說明書中所記載的所有的文獻、專利申請及技術標準，通過參考而援用于此的 每個文獻、專利申請及技術標準與具體且個別記載時相同程度地通過參考援用于本說明書 中。
【主權項】
1. 一種多肽組合物，其包含選自由以下多肽(a)~(c)構成的組中的至少一種： (a) 具有由序列號1表不的氣基酸序列的多妝； (b) 具有與由序列號1表示的氨基酸序列的同源性為80%以上的氨基酸序列且具有多 能干細胞的培養性能的多肽;及 (c) 具有序列號1中缺失、取代或附加1或數個氨基酸而成的氨基酸序列且具有多能干 細胞的培養性能的多肽， 多肽(a)~(c)為包含由以下（1-i)~（1-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第1區域的 多肽： (1-i)由序列號1表示的氨基酸序列中由第1個~第44個氨基酸殘基構成的氨基酸序 列； (1-ii)由與由氨基酸序列（1-i)構成的氨基酸序列的同源性為80%以上的氨基酸序列 構成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列;及 (1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1或數個氨基酸而成的氨基酸序列構 成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列，且 選自由多肽(a)~（c)構成的組中的至少一種中的通過第1區域所包含的半胱氨酸殘基 而進行分子之間交聯的二聚體以上的多聚體多肽為組合物所包含的多肽的總質量的20質 量％以下。2. -種多肽組合物，其包含由40個~450個氨基酸殘基構成的多肽(d)，多肽(d)為包含 由以下（1-i)~（1-iii)中的任一個氨基酸序列表示的第1區域及由以下(2-i)~(2-iii)中 的任一個氨基酸序列表示的第2區域的多肽： (1-i)由序列號1表示的氨基酸序列中由第1個~第44個氨基酸殘基構成的氨基酸序 列； (1-ii)由與由氨基酸序列（1-i)構成的氨基酸序列的同源性為80%以上的氨基酸序列 構成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列;及 (1-iii)由氨基酸序列（1-i)中缺失、取代或附加1或數個氨基酸而成的氨基酸序列構 成且具有對多能干細胞的細胞粘附能力的氨基酸序列， (2-i)由PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN即序列號3表示的氨基酸序列； (2-ii)與由序列號3表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性且具有對支撐體的細胞 培養表面的吸附能力的氨基酸序列;及 (2-iii)相對由序列號3表示的氨基酸序列缺失、取代或附加了 1或數個氨基酸且具有 對支撐體的細胞培養表面的吸附能力的氨基酸序列，且多肽(d)中的通過第1區域所包含的 半胱氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體以上的多聚體多肽為組合物所包含的多肽的 總質量的20質量％以下。3. 根據權利要求1或2所述的多肽組合物，其中， 通過多肽中的任一位置的半胱氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體以上的多聚體 多肽為組合物所包含的多肽的總質量的20質量％以下。4. 根據權利要求1~3中任一項所述的多肽組合物，其中， 組合物中的多肽(a)~(c)或(d)包含如下至少一種多肽，所述多肽包含于第1區域且在 相當于由序列號1表示的氨基酸序列中的第25個氨基酸殘基的半胱氨酸殘基與相當于第31 個氨基酸殘基的半胱氨酸殘基之間進行分子內交聯。5. 根據權利要求1~3中任一項所述的多肽組合物，其中， 組合物中的多肽(a)~(c)或(d)包含如下多肽，所述多肽包含于第1區域且分別在相當 于由序列號1表示的氨基酸序列中的下述半胱氨酸殘基之間進行分子內交聯： 相當于第5個氨基酸殘基的半胱氨酸殘基與相當于第9個氨基酸殘基的半胱氨酸殘基 之間、 相當于第19個氨基酸殘基的半胱氨酸殘基與相當于第21個氨基酸殘基的半胱氨酸殘 基之間、 相當于第25個氨基酸殘基的半胱氨酸殘基與相當于第31個氨基酸殘基的半胱氨酸殘 基之間、及 相當于第32個氨基酸殘基的半胱氨酸殘基與相當于第39個氨基酸殘基的半胱氨酸殘 基之間。6. 根據權利要求1~3中任一項所述的多肽組合物，其中， 組合物所包含的多肽與纖溶酶原激活物抑制劑-1的結合常數大于0.06。7. 根據權利要求1~6中任一項所述的多肽組合物，其中， 作為組合物中的多肽(a)~（c)或(d)包含如下至少一種多肽，所述多肽還包含由下述 (3a_i)~(3a_iii)中的任一個氨基酸序列構成的第3區域： (3a-i)由序列號1表示的氨基酸序列中，由第56個~第341個氨基酸殘基構成的氨基酸 序列或其部分氨基酸序列； (3a_ii)與（3a_i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸 序列;及 (3a_iii)相對(3a_i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或數個氨 基酸而成的氨基酸序列。8. 根據權利要求1~7中任一項所述的多肽組合物，其中， 作為組合物中的多肽(a)~（c)或(d)包含如下至少一種多肽，所述多肽還包含由下述 (4a_i)~(4a_i i i)中的任一個氨基酸序列構成的第4區域： (4a-i)由序列號1表示的氨基酸序列中，由第374個~第459個氨基酸殘基構成的氨基 酸序列或其部分氨基酸序列； (4a_ii)與(4a_i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸 序列;及 (4a_iii)相對(4a_i)的氨基酸序列或其部分氨基酸序列缺失、取代或附加1或數個氨 基酸而成的氨基酸序列。9. 一種多肽組合物，其包含選自由以下多肽(a)~(c)構成的組中的至少一種： (a) 具有由序列號1表不的氣基酸序列的多妝； (b) 具有與由序列號1表示的氨基酸序列的同源性為80%以上的氨基酸序列且具有多 能干細胞的培養性能的多肽;及 (c) 具有序列號1中缺失、取代或附加1或數個氨基酸而成的氨基酸序列且具有多能干 細胞的培養性能的多肽， 通過多肽中所包含的半胱氨酸殘基而進行分子之間交聯的二聚體以上的多聚體多肽 為組合物所包含的多肽的總質量的20質量％以下。10. -種多能干細胞的培養方法，其包含在權利要求1~9中任一項所述的多肽組合物 的存在下培養多能干細胞的階段。11. 一種培養器，其具備具有細胞培養表面的支撐體及配置在支撐體的細胞培養表面 上的權利要求1~9中任一項所述的多肽組合物所包含的多肽。
【文檔編號】C12M3/00GK105874058SQ201480058971
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年10月29日
【發明人】萩屋啟太, 森岡早苗, 村上裕太, 半戶里江, 鈴木晃生, 巖木義英, 佐佐木翼
【申請人】富士膠片株式會社