工程化的高親和力人類t細胞受體的制作方法【專利摘要】提供了對于存活素(Survivin)抗原具有較高親和力的T細胞受體(TCR)。所述高親和力TCR通過產生單鏈形式的突變TCR庫、接著針對酵母表面上提高的穩定性和親和力進行選擇(即定向進化)而工程化。在實施例中，所述工程化的TCR可以按可溶形式用于體內靶向遞送，或在過繼T細胞環境下以基因形式引入T細胞中。【專利說明】工程化的高親和力人類T細胞受體[0001]相關申請的交叉引用[0002]本申請根據35U.S.C.§119(e)要求2013年11月22日提交的美國臨時專利申請第61/907,887號的權益，并且此臨時申請W全文引用的方式并入本文中。[0003]關于聯邦贊助的研究或開發的聲明[0004]本發明在美國政府支持下在由國家衛生研究院（NationalInstitutesof胎alth)授予的撥款號R01GM55767和T32GM070421下作出。美國政府擁有本發明的某些權利。[00化]關于序列表的聲明[0006]與本申請相關的序列表W文本格式代替紙本拷貝提供，并且在此W引用的方式并入本說明書中。含有序列表的文本文件的名稱是IMMU_003_01W0_ST25.txt。文本文件12邸，創建于2014年11月21日，并且W電子方式經由EFS-Web提交。
技術領域：
[0007]本發明設及針對存活素(Survivin)抗原的通過體外技術工程化的高親和力T細胞受體(TCR);W及制備經修飾的TCR和單鏈TCR的方法;和所述TCR用于治療、診斷和成像方法的相應用途。【
背景技術：
】[0008]T細胞受體（TCR)和抗體是已經進化W識別不同類別的抗原（配位體）的分子((Mu巧hy(2012)，xix，第868頁））eTCR是負責識別在抗原呈遞細胞(APC)或任何有核細胞(例如，體內的除紅細胞外的所有人類細胞）的表面上的主要組織相容性復合物(MHC)的產物情境下呈遞的抗原膚的抗原特異性分子。相比之下，抗體典型地識別可溶或細胞表面抗原，并且不需要通過MHC呈遞抗原。此系統經由其TC則武予T細胞W識別由細胞(包括病毒蛋白質)表達的細胞內抗原的整個陣列的潛在能力，所述細胞內抗原在細胞內加工為短膚，結合到細胞內MHC分子并且W膚-MHC復合物(pepMHC)形式遞送到表面。此系統允許幾乎任何外源蛋白質(例如，突變癌癥抗原或病毒蛋白質)或異常表達蛋白質提供T細胞的標祀(綜述于化avis和Bjorkman(1988)《自然(化Uire)》，334,395-402;Davis等人（1998)《免疫學年鑒(AnnuRev11111]111]1〇1)》，16,523-544;111巧117(2012),義;[義，第868頁）中）。[0009]TCR與pepMffi：的相互作用可W驅動T細胞成為各種活化狀態，取決于結合的親和力(或解離速率）dTCR識別過程通過提供多樣TCR譜系而允許T細胞在正常健康細胞與例如已經經由病毒或惡性腫瘤變得轉化的細胞之間進行區別，其中一種或多種TCR針對結合到MHC分子的外源膚W高于用于刺激T細胞活性的闊值的結合親和力存在的概率很高(Manning和Kranz(1999)《今日免疫學（ImmunoIogyToday)》，20,417-422)。[0010]迄今為止，從通過體外培養鑒別的人類或小鼠T細胞克隆分離的野生型TCR已經顯示具有相對低結合親和力化d=1-300咖)（化avis等人（1998)《免疫學年鑒》，16，523-544)。對此的部分解釋似乎是，胸腺中出現的T細胞在自身-pepMHC配位體上被負選擇(耐受性誘導），使得缺失具有過高親和力的T細胞(S化rr等人(2003)《免疫學年鑒》，21,139-76)。為了補償運些相對低親和力，T細胞已經進化共同受體系統，其中細胞表面分子CD4和CD8結合到分子(分別II類和I類)并且與TCR在介導信號傳導活性方面協同作用。CD8在此過程中特別有效，使得具有極低親和力(例如，Kd=300山〇的TCR介導有效抗原特異性活性。[0011]在體外，定向進化已經用W產生對于特定pepMHC具有較高親和力的TCRdS種已經使用的不同呈現方法是酵母呈現化oiler等人（2003)《自然?免疫學(化tImmunol)》，4，55-62;Holler等人（2000)《美國國家科學院院刊（Proc化tlAcadSciUSA)》，97,5387-92)、隧菌體呈現化i等人(2005)《自然?生物技術(NatBiotechnol)》，23,349-54)和T細胞呈現（Chervin等人（2008)《免疫學方法雜志（JImmunolMethods)》，339,175-84)。在所有=種方法中，過程包括使展現野生型TCR的正常低親和力的TCR工程化或修飾其，使得TCR的突變體的親和力對于同源pepMHC(T細胞特異性針對的初始抗原)具有增加的親和力。因此，野生型TCR被用作制備一個或多個CDR中的誘變庫的模板，并且具有較高親和力的突變體通過結合到同源膚-MHC抗原而被選擇。[0012]在本發明中，公開了通過酵母呈現而工程化的對存活素癌癥抗原具有特異性的高親和力T細胞受體。存活素蛋白質通過抑制導致正常細胞調亡的信號傳導促進瘤形成(DoM等人（2004)《臨床調查雜志（JournalOfClinicalInvestigation)》114,1117-1127)。存活素在癌組織中上調(Ambrosini等人（1997)《自然?醫學(化tMed)》3,917-921)。其已經成為疫苗工作，和使用具有野生型T細胞受體的T細胞的各種過繼T細胞方法的標祀。[0013]存活素膚抗原在由國家癌癥研究所(National化ncerInstitute)所列的前75種癌癥抗原的優先排序清單中排名第2UCheever等人（2009)《臨床癌癥研究（ClinCancerRes)》，15,5323-5337)。因此，需要鑒別特異性祀向此癌癥抗原的藥劑，例如，治療劑。本發明提供了體外工程化的較高親和力TCR，其可W例如W可溶形式用于體內祀向遞送或在過繼T細胞環境下W基因形式引入T細胞中。【
發明內容】[0014]本發明設及一種W提高的親和力結合到存活素抗原的體外工程化T細胞受體(TCR)。更確切地說，本發明設及通過酵母、隧菌體或哺乳動物細胞的表面上的庫的呈現而選擇的穩定化和親和力突變;選自運些庫的用于W增加的親和力結合到抗原的TCR蛋白質；和體外選擇的TCR衍生物用于治療、診斷或成像應用的用途。[0015]本發明的一個方面設及一種經修飾的T細胞受體或其抗原結合片段，其包含來源于野生型T細胞受體的Va和V0，其中所述Va、所述W或運兩者相對于所述野生型T細胞受體包含一個或多個互補決定區（CDR)中的突變，其中所述經修飾的T細胞受體結合到稱為存活素/HLA-A2的膚/MHC抗原（結合到被稱為HLA-A2的MHC產物的存活素膚LMLGEFLKUSEQIDN0:5))。[0016]在一個實施例中，所述經修飾的T細胞受體包括包含與SEQIDN0:3中闡述的Va氨基酸序列具有至少80%-致性的氨基酸序列的經修飾的Va,其中所述經修飾的T細胞受體WlO6M更高的親和力化A值)結合到存活素/HLA-A2。[0017]在另一實施例中，所述經修飾的T細胞受體包括包含與SEQIDN0:4中闡述的Va氨基酸序列具有至少80%-致性的氨基酸序列的經修飾的Va,其中所述經修飾的T細胞受體WlO6M更高的親和力化A值)結合到存活素/HLA-A2。[0018]在另一實施例中，所述T細胞受體是包含SEQIDN0:6中闡述的氨基酸序列的單鏈T細胞受體。[0019]在另一實施例中，所述T細胞受體是包含SEQIDN0:7中闡述的氨基酸序列的單鏈T細胞受體。[0020]在另一實施例中，所述T細胞受體含有選自SEQIDNO:3中闡述的氨基酸序列的腳25、化001(、41016、1?102￥和1^0：31(的至少一個〔01?〇突變。[0021]在另一實施例中，所述T細胞受體含有選自SEQIDN0:4中闡述的氨基酸序列的腳2山化006、4101胖、3102￥和1^031'的至少一個〔01?3〇突變。[0022]在一個實施例中，所述經修飾的T細胞受體提供體外選擇突變T細胞受體的酵母呈現庫而產生。[0023]在另一實施例中，所述經修飾的T細胞受體表達為結合到其標祀抗原的可溶蛋白質。[0024]在另一實施例中，經修飾的T細胞受體表達于T細胞表面上W便介導CD4+或CD8+T細胞的活性。[0025]本發明的一個方面設及一種祀向表達存活素抗原的癌細胞的治療劑，其中所述治療劑包含本文所述的經修飾的T細胞受體。在一個實施例中，一種祀向表達存活素抗原的癌細胞的治療劑，其中所述治療劑包含表達本文所述的經修飾的T細胞受體的人類T細胞。[0026]-個實施例提供了一種治療患有表達存活素抗原的癌癥的受試者的方法，其包含投與本文所述的治療劑。【附圖說明】[0027]圖1是展示一種使單鏈TCR工程化W獲得針對膚:HLA.A2的提高的親和力的方法的圖。展示了用W使高親和力TCR工程化的通用方法。[0028]圖2A是展示TCR:P邱M肥復合物(A6;PDB:1A07)的側視圖的3維圖。指示a鏈和0鏈的可變(V)和恒定(C)區。所展示的結構不包括TCR的化區。HLA-A2(al、a2、a3和的m)W灰色展示，并且化X膚化LFGYPVYV，SEQIDN0:6)W黑色展示。在本發明中檢查的A6和存活素TCR都使用Va2片段(基于IMGT命名法，也稱為TRAV12)。[0029]圖2B是展示膚-MHC(Tax/HLA-A2)上的TCR(CDR)足跡的俯視圖的3維圖。盡管關于本發明中使用的存活素TCR未描述晶體結構，但迄今為止已經在幾乎所有復合物中觀察到Va區定位于a2MHC螺旋和膚的N末端上并且W區定位于alMHC螺旋和膚的C末端上的此對角線對接定向。[0030]圖3是用于使單鏈T細胞受體片段(Va-連接子-VP或W-連接子-Va)工程化的酵母呈現系統的示意圖。[0031]圖4A和4B展示了在用識別V的0的構象表位的抗體分選之后存活素易錯庫的流式細胞術直方圖。將存活素易錯庫依序用1:10稀釋的BChV的OFITCIgG和Al強a巧陽)傅)488山羊抗小鼠IgGd:100)二級抗體分選，總共3次分選。將每次分選之后的酵母細胞的等分試樣與1:10稀釋的BChV的0-起培育（圖4A)。灰色指示僅用二級抗體染色的酵母細胞。將穩定克隆K2相繼用1:20稀釋的hV02OFITCIgG和AlexaFlour647山羊抗小鼠IgG(I=IOO)二級抗體染色（圖4B)。[0032]圖5A和5B展示了在用BChV的0和Sur^2M:HLA-A2分選之后存活素CDR3a庫的流式細胞術直方圖，和兩種高親和力TCR與SurvT2M:HLA-A2的結合。將存活素CDR3a庫使用磁性柱，首先用BChV的0(1:10)、接著用MB抗小鼠IgG微珠（1:25)二級抗體分選。然后將存活素CDR3a庫相繼用IOOnMSur^2M:HLA-A2二聚體（DimerX;獲自抓Pharmingen)和MB抗小鼠IgG微珠(1:25)二級抗體分選，總共=次磁性分選。隨后將經分離的酵母使用巧光激活細胞分選術（FACS)，相繼用IOOnMSurvT2M:HLA-A2二聚體（DimerX;獲自BD曲armingen)和AkxaFIuor貨647山羊抗小鼠IgGd:100)二級抗體分選。然后將每次分選之后的酵母細胞的等分試樣相繼與IOOnMSurvT2M:HLA-A2二聚體（DimerX;獲自BDPharmingen)和AlcxaFiucn?貨647山羊抗小鼠IgG(l:100)二級抗體一起培育（圖5A)。灰色指示僅用二級抗體染色的酵母細胞。將在使用FACS第4次分選之后分離的結合改進的克隆K2.4.1(圖5B，左圖）和K2.4.6(圖5B，右圖）相繼用IOOnMSurvT2M:HLA-A2二聚體（DimeriC;獲自抓Pharmingen)和AIcxaFiuor巧647山羊抗小鼠IgG(1:100)二級抗體染色（圖5B)。[0033]圖6A和6B展示了高親和力TCR，K2.4.1對于SurvT2M:HLA-A2單體的結合性質。圖6A是展示相繼用各種濃度的SurvT2M:HLA-A2單體和SA-PEd:100)二級抗體染色的高親和力scTCRK2.4.1的流式細胞術直方圖。圖6B是展示圖6A中繪制的直方圖的平均巧光強度(MFI)值相較于SurvT2M:HLA-A2單體濃度的線圖。[0034]圖7描繪了存活素特異性化2.4.1和K2.4.6)高親和力TCR的序列。從CDR庫中分離高親和力單鏈變異體，然后針對親和力成熟篩選其。從穩定性庫中分離的突變加下劃線并且加粗;從親和力成熟庫中分離的突變加框并且加粗。還展示了具有K2酵母呈現克隆中的"穩定化"突變的野生型V區序列。關于ve鏈展示的氨基酸序列對應于SEQIDN0:12,并且所描繪的連接子序列是SEQIDNO:7。關于Va鏈展示的氨基酸序列從上到下對應于SEQIDN0:13、巧口2。[00對圖8A-8C展示了其中T細胞經K2.4.1TCR轉導的T細胞分析的結果。將T細胞從AAD轉基因小鼠（運些是如下的小鼠：其具有由HLA-A2的al和a2域和小鼠Db的a3域組成的雜交I類基因；運些AAD小鼠可獲自杰克遜實驗室(JacksonLaboratories))中分離。將細胞用與抗CD3/抗CD28珠子偶合的珠子活化24小時。將T細胞使用PMP71載體反轉錄轉導，所述載體含有K2.4.ITCR的Va和扣:或連接到鼠類2CTCR的Ca和地域（圖8A)。然后將模擬(灰色)和K2.4.1轉導（黑線）的T細胞用濃度是20nM的Sur^2M:HLA-A2四聚體染色（圖8B)。然后將T細胞在1:化:T下與表達HLA-A2的人類T2細胞和各種濃度的存活素膚一起培育24小時。收集上清液，并且使用化ISA測量IFN-丫釋放（圖8C)。[0036]圖9A和9B是說明從架構庫中分離的高親和力單鏈TCR的例示性治療應用的圖。圖9A描繪了適用作可溶治療產品的TCR形式的五種實例：1)呈Va-W定向或W-Va定向的單鏈TCR(突變的高親和力V域用星號展示）；2)在框內與抗體的恒定區結構域融合的單鏈TCR;3)與輕鏈或重鏈的恒定區的框內免疫球蛋白融合體;4)直接偶合到藥物的單鏈TCR(或2和3中展示的免疫球蛋白融合體）；和5)在框內與單鏈Fv(Vk連接子-VH)連接W產生雙特異性藥劑的單鏈TCR。圖9B描繪了將使用高親和力可變域(V)的基于細胞的療法的兩種實例，所述高親和力可變域(V)通過酵母呈現分離，克隆到哺乳動物細胞載體中，W便在過繼T細胞療法中按W下形式通過T細胞表達:1)嵌合抗原受體(CAR)中的單鏈受體和2)全長a和機CR。[0037]序列表的簡要說明[003引SEQIDN0:1是W高親和力結合到存活素A1LA-A2的TCR(存活素-K2.4.1)的經修飾的Va區的氨基酸序列。[0039]SEQIDN0:2是W高親和力結合到存活素/HLA-A2的TCR(存活素-K2.4.6)的另一經修飾的Va區的氨基酸序列。[0040]SEQIDN0:3是W高親和力結合到存活素A1LA-A2的單鏈TCR(存活素-K2.4.1)的氨基酸序列。[0041]SEQIDNO:4是W高親和力結合到存活素/HLA-A2的另一單鏈TCR(存活素-K2.4.6)的氨基酸序列。[0042]SEQIDNO:5是存活素抗原的氨基酸序列。[0043]沈QIDNO:6是化X抗原的氨基酸序列。[0044]SEQIDNO:7是連接子的氨基酸序列。[0045]SEQIDNO:8是引物剪接化的多核巧酸序列。[0046]沈QIDNO:9是引物T7的多核巧酸序列。[0047]SEQIDNO:10是用W產生SurvCDR3a庫的PreSOE1號的反向引物的多核巧酸序列。[004引SEQIDNO:11是用W產生SurvCDR3a庫的PreSOE2號的正向引物的多核巧酸序列。[0049]SEQID^:12是結合到存活素/化4-42的1'0?(存活素-1(2)的￥6區的氨基酸序列。[0050]SEQID^:13是結合到存活素/化4-42的1'0?(存活素-1(2)的化區的氨基酸序列。[0051]SEQIDNO:14是WTl抗原的氨基酸序列。[0化2]SEQIDNO:15是A型流感膚的氨基酸序列。[0053]SEQIDNO:16是變異A型流感膚的氨基酸序列。【具體實施方式】[0054]W下描述希望促進對本發明的理解但并不希望具限制性。[0055]-般來說，本文所用的術語和短語具有其領域公認的含義，其可W參考標準文本、雜志參考文獻和本領域的技術人員已知的情境找到。W下定義經提供W闡明其在本發明的情境下的特定用途。[0056]如本文所用，"連接"是指兩個基團之間的締合，其可W是共價或非共價締合。基團可W使用可變長度膚鏈、非氨基酸化學基團或如本領域中已知的其它手段連接。連接子區可W是可操作地連接蛋白質或膚的兩個功能或結構域的氨基酸序列。[0057]如本文所用，術語"化學治療劑"是指能夠減少或預防一種癌細胞、一群癌細胞、月中瘤或其它惡性組織生長、增殖或擴散的任何物質。所述術語預期還涵蓋任何抗腫瘤劑或抗癌劑。[005引如本文所用，術語"有效量"預期涵蓋例如醫藥有效量或治療有效量的情境。舉例來說，在某些實施例中，有效量能夠實現篩選分析中的有益狀態、有益結果、功能活性或改善臨床病況。[0059]如本文所用，術語"癌細胞"預期涵蓋如本領域中廣泛理解的定義。在一個實施例中，所述術語是指可能會促進人類或動物的癌癥的臨床病況的異常調節細胞。在一個實施例中，所述術語可W指人體或動物體內或來源于人體或動物體的經培養的細胞系或細胞。癌細胞可W是如本領域中理解的多種多樣的分化細胞、組織或器官類型。癌細胞的特定實例包括乳癌、結腸癌、皮膚癌、卵巢癌、白血病、肺癌、肝癌、睪丸癌、食道癌和其它類型的癌癥。[0060]如本文所用，"治療（treating/化eatment)"是指用于獲得有益或所要結果、包括并且優選臨床結果的方法。治療可W指改善疾病或病況的癥狀或延遲疾病或病況的進展。[0061]如本文所用，"預防(prevention/preventing)"是指用于預防、抑制或減少疾病或病況的可能性、疾病或病況的發作或復發的方法。其還指預防、抑制或減少疾病或病況的癥狀的可能性、疾病或病況的癥狀的出現或再現，并且其還包括在疾病或病況發作或復發之前減少疾病或病況的強度、作用、癥狀和/或負擔。[0062]如本文所用，"抑制細胞生長"或"抑制細胞增疆'是指降低或中斷細胞的生長速率。舉例來說，通過抑制腫瘤細胞的生長，腫瘤的大小的增加速率可能減慢。在其它實施例中，腫瘤可W保持相同大小;或大小減小，即，消退。在特定實施例中，細胞生長或細胞增殖的速率被抑制至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。[0063]術語"野生型"和"wt"在本文中可互換地使用并且關于具有編碼從天然存在或未經修飾的TCR(例如，初始或母體T細胞克隆)分離的可變區的氨基酸序列或多核巧酸、對于抗原具有特異性的TCR使用。[0064]在呈現氨基酸序列的圖和表中，野生型指示為"wt"。在頂部序列下方呈現的序列中，破折號指示氨基酸與比對的Wt或頂部序列中呈現的氨基酸相同。字母指示已經在所述位置從頂部序列進行取代。[0065]如本文所用，術語"經修飾的"、"變異的"、"突變性"、"突變的"和"衍生的"T細胞受體是指具有與初始或野生型T細胞克隆相比具有一個或多個突變的可變區的TCR序列。經修飾的TCR的實例包括較高親和力TCR。[0066]編碼序列是編碼蛋白質的氨基酸序列或功能RNA(例如tRNA或rRNA)的基因或CDNA的一部分。[0067]補體或互補序列意指根據沃森-克里克(Watson-化ick)堿基配對規則與核巧酸的另一序列形成氨鍵結的雙螺旋體的核巧酸的一序列。[0068]下游是指DNA或RNA中的相對位置并且是朝鏈的3'末端的區。[0069]表達是指將基因轉錄到結構RNA(rRNA、tRNA)或信使RNA(mRNA)中并且隨后將mRNA轉譯到蛋白質中。[0070]如果兩個核酸序列來源于單獨生物體，無論此類生物體是否是不同物種，只要所述序列不一起W相同排列天然存在于同一生物體中，那么所述序列與彼此是異源的。[0071]同源性是指兩個核巧酸或氨基酸序列之間的一致性的程度。[0072]功能上等效于具體例示的TCR序列的氨基酸序列是已經通過單或多氨基酸取代、通過添加和/或缺失氨基酸而修飾或其中一個或多個氨基酸已經被化學修飾，但盡管如此仍保持本發明的細胞結合或可溶TCR蛋白質的結合特異性和高親和力結合活性的氨基酸序列。功能上等效的核巧酸序列是編碼具有與具體例示的細胞結合或可溶TCR蛋白質實質上相同的生物活性的多膚的核巧酸序列。在本發明的情境下，可溶TCR蛋白質不具有天然細胞結合TCR的部分并且在溶液中穩定（即，當如本文所述并且在用于蛋白質溶液的標準條件下處置時，其在溶液中通常不凝集）。[0073]術語"經分離的"是指通過人力從天然狀態改變的組合物、化合物、物質或分子。舉例來說，如果天然存在的組合物或物質已經從其初始環境有所改變或從其初始環境移出或運兩種情況都有，那么其是經分離的。舉例來說，在所述術語用于本文中時，天然存在于活動物中的多核巧酸或多膚不是經分離的，但與其天然狀態的共存物質分離的相同多核巧酸或多膚是經分離的。[0074]核酸構筑體是從天然存在的基因分離或已經被修飾W含有核酸的W否則將不天然存在的方式組合和并列的片段的核酸分子。[0075]核酸分子意指含有通過3'-5'憐酸二醋鍵連接的脫氧核糖核巧酸或核糖核巧酸的單或雙鏈線性多核巧酸。[0076]如果連接的性質不干擾兩個DNA序列相對于彼此影響其正常功能的能力，那么所述序列可操作地連接。舉例來說，如果啟動子能夠實現編碼序列的轉錄，那么啟動子區將可操作地連接于編碼序列。[0077]多膚是通過膚鍵連接的氨基酸的線性聚合物。[0078]術語"啟動子"是指通常80-120個堿基對長并且位于基因的起始位點上游的順式作用DNA序列，RNA聚合酶可W結合到其并且起始正確轉錄。可W存在提供轉錄的開/關調節和/或增強(增加)下游編碼序列的表達的相關額外轉錄調節序列。[0079]重組核酸分子(例如重組DNA分子)是在體外通過兩個或更多個非同源DNA分子的連接形成的新穎核酸序列（例如含有克隆到至少一個克隆位點中的外源DNA的一個或多個插入片段的重組質體）。[0080]術語"轉化"和"轉染"是指通過外部應用來自另一不同基因型細胞的經純化的重組DNA定向修飾細胞的基因組，導致其吸收并且整合到受試細胞的基因組中。在細菌中，重組DNA典型地不整合到細菌染色體中，而是自主地復制為質體。術語"經轉化的"和"經轉染的"在本文中可互換地使用。舉例來說，T細胞可W在過繼T細胞處理之前用編碼本文所述的經修飾的或高親和力的TCR的DNA序列轉染。[0081]上游意指在DNA或RNA中的任何位點的5'側上。[0082]載體是能夠在宿主細胞中自主地復制并且可W接受外源DNA的核酸分子。載體攜有其自身的復制起點；一個或多個可W用于插入外源DNA的限制性核酸內切酶的獨特識別位點；W及通常可選標記，例如編碼抗生素抗性的基因，和通常用于表達插入的DNA的識別序列(例如，啟動子）。常見載體包括質體載體和隧菌體載體。[0083]高親和力T細胞受體(TCR)是比野生型TCR更強地結合到標祀配位體的工程化TCR。高親和力的一些實例包括對于標祀配位體在約ICT6M與1()-1?之間W及為其中的所有個別值和范圍的平衡結合常數。此范圍涵蓋據報道為野生型親和力QCT4到的親和力與已經通過定向進化分離的親和力(約I(Ti2M)之間的親和力。[0084]細胞因子是通過影響其它細胞的細胞制備的蛋白質、膚或糖蛋白。[0085]哺乳動物包括人類和非人類哺乳動物。[0086]本領域的技術人員應了解，由于遺傳密碼的簡并，眾多功能上等效的核巧酸序列編碼相同氨基酸序列。[0087]T細胞受體[0088]T細胞受體(TCR)由在T細胞表面上配對W形成異源二聚受體的兩條鏈(曰0或丫S)組成。a機CR表達于體內的大多數T細胞上并且已知參與識別M肥限制抗原。a機CR的分子遺傳學、結構和生物化學現在已經得到透徹的研究。每條a和e鏈由兩種結構域組成:錯定細胞膜中的蛋白質并且與CD3信號傳導裝置的恒定亞單位締合的恒定域(C)，和通過六個環(稱為互補決定區（CDR))賦予抗原識別的可變域(V)。每一個V域具有S個CDR。運些CDR與結合到由主要組織相容性復合物編碼的蛋白質的抗原膚之間的復合物（pepMHC)相互作用(Davis和Bjorkman(1988)《自然》，334，395-402;Davis等人（1998)《免疫學年鑒》，16，523-544;Mu巧hy(2012)，xix,第868頁）。[0089]TCR的分子遺傳學已經展現了組合W形成V域的編碼區的多種基因之間的遺傳重組的過程。所述過程類似于抗體發育，其中重和輕鏈基因重排W產生由B細胞衍生的抗體展現的巨大多樣性(Tonegawa(1988)《體外細胞發育生物學（InVitroCellDevBiol)》，24，253-65)。在T細胞的情況下，a鏈V域通過將一個V區（在人類中約75之中）與一個連接(J)基因片段(在人類中約61之中）重排而形成（圖5.8Janeway,第8版）。0鏈V域通過將一個V區(在人類中約52之中）與一個多樣性(D)基因（在人類中2之中）與一個連接(J)基因片段(在人類中13之中）重排而形成（圖5.8，（Mu巧hy(2012)，XiX，第868頁））。VaJa與V抓0扣基因重排的連接點編碼每條鏈的CDR3環，并且其促進a機CR的巨大多樣性，理論極限是超過l〇is個不同TCR(Davis和Bjorkman(1988)《自然》，334,395-402)，遠高于人類中可實現的多樣性，因為總計僅存在約1011個T細胞(Mason(1998)《今日免疫學》，19,395-404)。每條鏈的可能CDRl和CDR2多樣性通過V基因的數目表示，因為運些環編碼于V基因內，并且TCR不經歷體內體細胞突變。盡管CDRl和CDR2環的多樣性與CDR3環相比相對有限，但已經有多個實例顯示其中基于膚抗原和/或血IC產物對于特定V區已經存在選擇。[0090]I類MHC產物結合到8到10個氨基酸長度的膚并且其表達于體內的所有有核細胞上(由（Rock和Gol化erg(1999)《免疫學年鑒》，17,739-79)綜述）。盡管抗體-抗原相互作用的全部結合能都集中于外源抗原上，但TCR-膚:MHC的相當大部分的結合能引導于自身-MHC分子處(Manning和Kranz(1999)《今日免疫學》，20，417-422)。實際上，更為新近的研究已經提出，CDRl和/或CDR2環的特定殘基已經進化W與M肥螺旋上的特定殘基相互作用，因此提供對于MHC的基礎親和力，解釋M肥限制的過程(Garcia等人(2009)《自然?免疫學》，10,143-7;Marrack等人（2008)《免疫學年鑒》，26，171-203)。[0091]已經關注了使用對于膚-MHC抗原（I類)具有高于正常范圍的親和力的TCR(所謂的較高親和力TCR)，W便：U驅動CD4輔助T細胞(其不具有CD8共同受體)的活性;或2)使可W用于直接祀向細胞的可溶TCR發育，通過連接"效應子"分子(例如，抗體化區、毒性藥物或抗體scFv，例如抗CD3抗體，W形成雙特異性蛋白質）（（Ashfield和Jakobsen(2006)ID;rugs,9，554-9;Foote和Eisen(2000)《美國國家科學院院刊》，97,10679-81;Holler等人(2000)《美國國家科學院院刊》，97,5387-92;MolIoy等人（2005)《藥理學當前觀點（CurrOpin曲armacol)》，5，438-43;Richman和Kranz(2007W生物分子工程（Biomol化g)》，24，361-73)。此方法還可W克服一些癌癥患者面臨的問題，由此其T細胞對于潛在腫瘤抗原不W充足特異性和結合親和力表達TCR(部分由于耐受性的胸腺和周邊過程）。舉例來說，現在已經鑒別了超過300種M肥限制的T細胞界定的腫瘤抗原kancerimmunity.o巧/peptide/)(Boon和01d(1997)《免疫學當前觀點(CurrOpinImmunol)》，9，681-3;Cheever等人(2009)《臨床癌癥研究》，15，5323-37)。運些腫瘤抗原包括突變膚、分化抗原和過度表達的抗原，其都可W充當療法的標祀。因為迄今為止描述的大多數癌癥抗原來源于在MHC分子的情境下僅可W在細胞表面處祀向的細胞內蛋白質，所WTCR在其已經進化W識別此類別的抗原時成為治療劑的理想候選物。[0092]類似地，TCR可W檢測已經于感染細胞中天然加工并且由M肥分子呈現于細胞表面上的來源于病毒蛋白質的膚。在過去25年中已經鑒別立多種病毒抗原標祀，包括來源于HIV和HTLV中的病毒基因組的膚(例如，Addo等人(2007)《公共科學圖書館?綜合(PLoS0肥)》，2，e321;Tsomides等人（1994)《實驗醫學雜志（JExpMed)》，180，1283-93;Utz等人（1996)《病毒學雜志(JVirol)》,70,843-51)。然而，患有運些疾病的患者可能不具有對于感染細胞的結合和摧毀最優的TCR。最終，有可能TCR可W用作自體免疫標祀的受體括抗劑;或在高度特異性的過程中用作免疫抑制局部免疫細胞反應，因此避免一般性免疫抑制的遞送藥劑((MolIoy等人（2005M藥理學當前觀點》，5,438-43;Stone等人（2012M蛋白質工程(ProteinEngineering)》））。[0093]經修飾的T細胞受體[0094]定向進化已經用W產生對于特定pepMHC具有較高親和力的TCRdS種已經使用的不同呈現方法是酵母呈現（Holler等人（2003)《自然?免疫學》，4,55-62;化Iler等人(2000)《美國國家科學院院刊》，97,5387-92)、隧菌體呈現化i等人(2005)《自然?生物技術》，23，349-54)和T細胞呈現(Chervin等人（2008)《免疫學方法雜志》，339，175-84)。在所有S種方法中，過程包括使展現野生型TCR的正常低親和力的TCR工程化，W便TCR的突變體對于特定pepMHC(即，對于T細胞特異性針對的初始抗原）具有增加的親和力。因此，野生型TCR被用作制備一個或多個CDR中的誘變庫的模板，接著通過結合到同源膚-MH討亢原選擇具有較高親和力的突變體。本領域中眾所周知，為了使親和力工程化W便高于野生型親和力超過僅幾倍，此類體外定向進化是必需的。[00M]酵母呈現允許相關蛋白質WAga2融合體形式表達于表面上（Boder和Wittr叩(1997)《自然?生物技術》，15,553-557;Boder和Wittr叩（2000)《酶學方法（MethodsEnzymol)》，328，430-44)。此系統已經成功地用于使較高親和力TCR、單鏈抗體、纖連蛋白和其它蛋白質工程化。在酵母呈現系統中，TCR已經呈現為呈W-連接子-Va或Va-連接子-W形式的穩定化單鏈蛋白質（Aggen等人（2011)《蛋白質工程、設計與選擇（ProteinEngineering,Desi即，&Selection)》，24,361-72;Holler等人（2000)《美國國家科學院院刊》，97,5387-92;Kieke等人（1999W美國國家科學院院刊》，96,5651-6;Richman等人(2009)《分子免疫學(MolImmunol)》，46,902-16;Weber等人（2005)《美國國家科學院院刊》，102,19033-8)，或二鏈異源二聚體(Aggen等人(2011)《蛋白質工程、設計與選擇》，24，361-72;Richman等人(2009)《分子免疫學》，46,902-16)。兩種小鼠TCR已經使用此系統工程化W獲得更高親和力：2C(I類M肥限制）和3丄2(11類MH邱良制KHoller等人(2000)《美國國家科學院院刊》，97,5387-92;胖666'等人(2005)《美國國家科學院院刊》，102，19033-8)。人類TCR單鏈VaVP片段(稱為SCTv或scTCR)最近也已經通過利用人類Va區（稱為Va2,通過IMGT命名法也稱為TCRA12)的優越穩定性而開發(Aggen等人(2011)《蛋白質工程、設計與選擇》，24,361-72)。在此情況下，呈單鏈形式的體外工程化的高親和力T細胞受體用W分離人類穩定化SCTv片段(W-連接子-Va),其可W在酵母表面上和從大腸桿菌W可溶形式表達為穩定蛋白質。TCR包括兩種穩定化人類SCTv片段，A6scTv，其對來源于人類T細胞淋己病毒化X蛋白質的膚具有特異性；和868scTv，其對來源于人類免疫缺陷病毒Gag蛋白質的膚（膚：SL977-85)具有特異性。運兩種TCR都使用Va2基因（IMGT:TRAV12家族），但其具有來源于初始T細胞克隆的CDR3a、CDRie、CDR20和CDR30殘基，TCR從所述初始T細胞克隆分離。因此，運些scTCR的較高親和力突變體各自針對其同源膚-MHC抗原來源于其初始(親本)TCR。[0096]在第二系統（隧菌體呈現）中，相關蛋白質與病毒外殼蛋白的N末端融合(Scott和Smith(1990)《科學（5^611。6)》，249,386-90)。各種1'〇?，包括稱為46、868和164的那些（1類限制）已經使用此方法工程化W獲得更高親和力化i等人(2005)《自然?生物技術》，23，349-54;Sami等人（2007)《蛋白質工程、設計與選擇》，20，397-403;Varela-Rohena等人(2008)《自然?醫學》，14,1390-5)。運些TCR的隧菌體呈現通過在兩個C域之間引入非天然二硫鍵W便促進a和e鏈的配對而實現。此系統因此使用來源于初始T細胞克隆的全長(VaCa/Ve地)異源二聚蛋白質W便針對其同源膚-MHC工程化。[0097]已經報道用于使TCR工程化的第S系統是哺乳動物細胞呈現(化ervin等人(2008)《免疫學方法雜志》，339,175-84Vessels等人(2000)《美國國家科學院院刊》，97,14578-83)。此系統使用反轉錄病毒載體將TCRa和0鏈引入TCR陰性T細胞雜交瘤中。在一個研究化essels等人(2000)《美國國家科學院院刊》，97,14578-83)中，所選突變TCR顯示為結合到結構上極類似于同源膚的膚(AS肥NMDAM相較于AS肥NMETM;分別是SEQIDNO:15和16)。在其它研究中，突變TCR的親和力顯示為對于同源P邱MHC增加(化ervin等人(2008)《免疫學方法雜志》，339,175-84)。在許多研究中已經顯示，此類較高親和力TCR針對同源膚的結構類似變異體也展現更高親和力（例如，化oiler等人(2003)《自然?免疫學》，4,55-62))。在哺乳動物細胞呈現系統中，引入的TCRW其天然構象表達于表面上，與CD3亞單位復合，允許完全功能性T細胞(信號傳導感受態）。其天然宿主中的全長異源二聚TCR因此使用此方法工程化。[0098]結合到存活素/HLA-A2的高親和力TCR[0099]本發明提供了針對熟知的癌癥抗原存活素/HLA-A2的高親和力TCR。在某些實施例中，工程化的TCR可W按可溶形式用于體內祀向遞送，或在過繼轉移方法或治療中由T細胞重組表達。在一個特定實施例中，單鏈Vave形式的TCR(scTCR)架構可WW有效載荷制備和使用，例如細胞因子、毒素、放射性同位素、化學治療劑或藥物(類似于抗體-藥物結合物），W將效應分子遞送到TCR結合的位置(例如，腫瘤）"TCR還可W用于細胞療法，例如CD4巧細胞、CD8巧細胞和/或自然殺手(NK)細胞的過繼轉移，W介導針對表達存活素的癌細胞的反應。本文所提供的scTCR架構還可W用于經由通過共價連接(例如通過TCR的胺反應性或琉基反應性氨基酸側鏈巧Ij可檢測基團（例如放射性同位素或巧光部分)鑒別例如寶生性或病毒相關的細胞表面抗原，來診斷例如惡性或病毒感染的細胞。[0100]在一個實施例中，本文所述的scTCR蛋白質可呈現于酵母、隧菌體或哺乳動物細胞的表面上，并且可W用W使TCR工程化W對于存活素抗原具有甚至更高親和力。在一個實施例中，本文所述的scTCR蛋白質可W表達于例如W下各者中：原核細胞，例如大腸桿菌、黑曲霉（AspergiIlusniger)、無花果曲霉（AspergiIlusficuum)、泡盛曲霉（AspergiIlusawamori)、米曲霉（Aspergillusoryzae)、里氏木霉（Trichodermareesei)、米黑毛霉(Mucormiehei)、乳酸克魯維酵母化Iuyveromyceslactis)、己斯德畢赤酵母（Pichiapastoris)、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)或地衣芽抱桿菌（BaciIlusIicheniformis);昆蟲細胞（例如，黑腹果蛹（DrosophiIamelanogaster));哺乳動物細胞，包括細胞系，例如中國倉鼠卵巢細胞系(CHO);或植物物種(例如，芥花、大豆、玉米、±豆、大麥、黑麥、小麥），或其它本領域已知的蛋白質表達來源，并且大量產生。舉例來說并且僅作為實例，TCR還可W用W檢測細胞表面上的特定膚/MHC。在一個實施例中，所公開的scTCR基因可W通過使用編碼于DNA構筑體內的適合膚序列連接到用于信號傳導域的基因，并且引入可能會消除標祀細胞的T細胞中。運些構筑體已經被稱為嵌合抗原受體(CAR)，其現在普遍地用于包括使用含有scTCR的CAR的領域中。[0101]在所提供的單鏈VaWTCR蛋白質中，可變a和可變0鏈使用任何適合膚連接子連接，所述膚連接子包括本領域中已知的那些，例如抗體單鏈Fv鍵(Bird等人(1988)《科學》，242，423-426;Holliger等人（1993)《美國國家科學院院刊》，90,6444-8;Hoogenboom(2005)《自然?生物技術》，23，1105-16;Turner等人（1997)《免疫學方法雜志》，205，43-54)。在一個實施例中，提供了一種具有W下結構的可溶人類單鏈TCR:VaA-W或WA-Va，其中L是將W與Va連接的連接子膚，Ve是TCR可變0區，并且Va是TCR可變a區。[0102]在一個實施例中，VPVaTCR被稱為存活素K2.4.1，其中W是第20組的TCR可變0區，并且Va2是第2組的TCR可變a區化tz，U.等人，1996)(Aggen，D.A.等人,2011)。在一個實施例中，WVaTCR被稱為存活素K2.4.6，其中W是第20組的TCR可變0區，并且Va2是第2組的TCR可變曰區。[0103]在一個實施例中，連接子膚含有超過5個賴氨酸殘基。在一個實施例中，連接子膚含有5與30個之間的氨基酸。在一個實施例中，連接子膚具有GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQIDN0:7)的氨基酸序列。在一個實施例中，所提供的SCWVaTCR不含有恒定區。當術語SCWVaTCR用于本文中時，應理解，SCWVaTCR也包括為本領域中理解和使用的術語。因此，W和Va鏈可W通過連接子W任何構形彼此連接。[0104]在本發明的一個方面，本發明的WVaTCRW約ICT6M與ICTi2M之間的平衡結合常數Kd特異性結合到配位體。在本發明的此方面的一個實施例中，配位體是膚/MHC配位體。在一個實施例中，與正常野生型TCR的親和力相比，本發明的WVaTCR對于配位體具有增強的親和力。[0105]生物活性基團[0106]還提供了包括生物活性基團的如本文所述的VPVaTCR蛋白質。如本文所用/'生物活性基團"是在生物系統中導致可測量或可檢測的作用的基團。在一個實施例中，生物活性基團選自：抗腫瘤劑，例如(但不限于)血管生成抑制劑、酶抑制劑、微管抑制劑、DNA嵌入劑或交聯劑、DNA合成抑制劑;細胞因子，例如（但不限于）比-2、比-15、GM-CSF、化-12、TNF-a、IFN-丫或LT-a(Schrama等人（2006)《自然評論藥物發現（化tRevDrugDiscov)》，5,147-59;Wong等人（2011)《蛋白質工程、設計與選擇》，24,373-83);抗炎基團，例如（但不限于）TGF-0、化-37、比-10(Nold等人（2010)《自然?免疫學》，11,1014-22;Stone等人（2012)《蛋白質工程》）；放射性同位素，例如(但不限于)Wy或UiKReiched和化lge-Archer(2007)《自然評論藥物發現》，6,349-56);毒素，例如(但不限于)假單胞菌(Pseudomonas)外毒素A、白喉毒素或一連串的藍麻毒素(Pastan等人(2006)《自然評論:癌癥(NatRevCancer)》，6，559-65;Sc虹ama等人(2006)《自然評論藥物發現》，5，147-59);藥物;或抗體，例如單鏈Fv。[0107]在本發明的此方面的一個實施例中，生物活性基團是細胞毒性分子，有時稱為藥物(例如，在術語"抗體藥物結合物"中）。如本文所用，"細胞毒性"意指對細胞有毒性。細胞毒性分子的實例包括(但不限于）多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶嶺(methotrexate)、絲裂霉素(mitomycin)、5-氣尿喀晚、倍癌霉素（duocarmycin)、奧瑞他汀(au;ris1:atins)、美登素(111日八日]13；[]163)、卡奇霉素（。日1；[證6日111；[(3；[]13)和^上分子的類似物〇日1'￥13(2012)《化學與工程新聞（化emicalandEngineering化WS)》，90,12-18;Litvak-Greenfeld和Benhar(2012)《先進藥物輸送評論(AdvDrugDelivRev)》;Rica;rt和Tolche;r(2007)《自然?臨床實踐腫瘤學(化tClinPract化col)》，4,245-55)。細胞毒性分子不需要導致完全細胞死亡，而是導致生長的可測量或可檢測的抑制或細胞活性的降低。[0108]在一個實施例中，本文所述的TCR連接到能夠將前藥轉化為藥物的酶。運例如通過使得藥物的活性形式在由TCR祀向的位置處(例如，在腫瘤位點處)產生而是適用的。[0109]在一個實施例中，生物活性基團通過連接子結合到單鏈TCR，運可W通過例如與TCR的游離胺基或琉基的標準化學反應來實現。[0110]在另一實施例中，TCR連接到單鏈抗體片段(SCFv)W產生雙特異性藥劑。含有一個針對腫瘤抗原的scFv和一個針對T細胞的CD3分子的scFv的雙特異性抗體現在已經成功地用于臨床(Bargou等人(2008)《科學》，321,974-7)。另外，還已經報道了含有TCR和針對CD3的SCFv的雙特異性藥劑化iddy等人(2012)《自然?醫學》，18,980-7)。[0111]還提供了一種包括可檢測基團的如本文所述的單鏈VPVaTCR。在一個實施例中，可檢測基團是可W通過光譜學或基于酶的方法檢測到的基團。在一個實施例中，可檢測基團是巧光基團，例如(但不限于）巧光素、R-藻紅蛋白（PE)、陽-切5、PE-切7、德克薩斯紅(Texasred)或別藻藍蛋白（APC);經放射性標記的基團，例如(但不限于）125I、32P、99mTc;吸收基團;或具有產生可檢測產物的性質的酶，例如(但不限于)辣根過氧化物酶或堿性憐酸酶。[0112]如本領域中已知，生物活性基團、可檢測基團或連接到TCR的其它基團可W使用柔性膚連接子或通過化學結合連接，并且可W共價或非共價連接到TCR。[0113]本文還提供了一種人類TCR，其用于治療或預防哺乳動物的癌癥的方法，所述方法包含向哺乳動物投與有效量的連接到治療有效分子的經修飾的TCR。在一個特定實施例中，哺乳動物是人類。在另一實施例中，哺乳動物是伴侶動物(例如，狗、貓、兔、曬齒動物、馬)或牲畜動物(例如，奶牛、馬、豬）。[0114]還提供了一種如本文所述的經分離的單鏈TCR(scTCR)，和一種在大腸桿菌中制備單鏈TCR的方法。還提供了一種醫藥組合物，其包含如本文所述的scTCR和醫藥學上可接受的載劑。[0115]還提供了已經連接到信號傳導域的本文所述的SCVaVPTCR,其在T細胞的表面上產生活性TCR。在一個實施例中，此scTCR可W用于治療哺乳動物的癌癥的方法，所述方法包含:將TCR克隆到載體中，將載體引入患者的T細胞中，和將T細胞過繼轉移回患者中。[0116]經修飾的TCR多膚和多核巧酸[0117]本發明涵蓋一種DNA載體，其包括至少一個編碼單鏈T細胞受體（scTCR)的DNA片段。[0118]通過標準誘變技術，結合本文所述的分析，本領域的技術人員可W獲得改變的TCR序列并且針對特定結合親和力和/或特異性測試其。本領域中已知的適用誘變技術包括(但不限于)從頭基因合成、寡核巧酸定向誘變、區域特異性誘變、連接子掃描誘變和通過PCR的定點誘變(參看例如Sambrook等人（1989)和Ausubel等人（1999))。[0119]在獲得經修飾的TCR編碼序列時，本領域的普通技術人員將認識到，TCR衍生的蛋白質可W通過某些氨基酸取代、添加、缺失和轉譯后修飾，在不損失或降低生物活性的情況下修飾。具體來說，眾所周知，保守氨基酸取代（即，用一種氨基酸取代具有類似大小、電荷、極性和構象的另一氨基酸)不大可能顯著改變蛋白質功能。為蛋白質的成分的20種標準氨基酸可W廣泛分類為如下四組保守氨基酸:非極性(疏水性)組包括丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和鄉氨酸;極性(不帶電、中性)組包括天冬酷胺、半脫氨酸、谷氨酷胺、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；帶正電（堿性)組含有精氨酸、組氨酸和賴氨酸;并且帶負電（酸性)組含有天冬氨酸和谷氨酸。蛋白質中用一種氨基酸取代同一組內的另一氨基酸不大可能對蛋白質的生物活性具有不良影響。[0120]在一個實施例中，本發明的scTCR可W在產生穩定化蛋白質的可變域的任何區域中含有額外突變。在一個實施例中，一個或多個額外突變在〔031、〔01?2、^4、〔01?^1?2和尸尺3中的一者或多者中。用于誘變的區域可W通過定向進化確定，其中晶體結構或分子模型用W產生TCR的與所關注的配位體(例如抗原)相互作用的區域。在其它實例中，可變區可W通過添加或缺失氨基酸W使scTCR與配位體之間的所要相互作用工程化而再成形。[0121]本發明的多膚包括經修飾的TCR和其抗原結合片段(例如，scTCR)和嵌合抗原受體(CAR)。術語"多膚"、"蛋白質"和"膚"和"糖蛋白"可互換地使用，并且意指不限于任何特定長度的氨基酸聚合物。所述術語不排除例如肉豆違酷化、硫酸化、糖基化、憐酸化W及信號序列的添加或缺失的修飾。術語"多膚"或"蛋白質"意指一條或多條氨基酸鏈，其中每條鏈包含通過膚鍵共價連接的氨基酸，并且其中所述多膚或蛋白質可W包含多條通過膚鍵非共價和/或共價連接在一起的鏈，所述鏈具有天然蛋白質（即，通過天然存在的并且具體地說非重組細胞產生的蛋白質）或遺傳工程化或重組細胞的序列；并且包含具有天然蛋白質的氨基酸序列的分子，或具有對一個或多個天然序列氨基酸進行的缺失、添加和/或取代的分子。術語"多膚"和"蛋白質"具體地說涵蓋本發明的經修飾的TCR或其抗原結合片段，或具有對經修飾的TCR或其抗原結合片段的一個或多個氨基酸進行的缺失、添加和/或取代的序列。因此，"多狀'或"蛋白厭'可W包含一條(被稱為"單體'）或多條(被稱為"多聚體'）氨基酸鏈。[0122]本文中提及的術語"經分離的蛋白質"意指如下受試蛋白質：（1)不含至少一些其它蛋白質，其將與所述其它蛋白質一起典型地在自然界中找到，（2)基本上不含來自相同來源(例如，來自相同物種）的其它蛋白質，（3)由來自不同物種的細胞表達，（4)已經從至少約50%的多核巧酸、脂質、碳水化合物或其它物質分離，其與所述物質在自然界中締合，（5)與蛋白質部分不締合(通過共價或非共價相互作用），"經分離的蛋白質"與所述蛋白質部分在自然界中締合，（6)與多膚可操作地締合(通過共價或非共價相互作用），其與所述多膚在自然界中并不締合，或（7)不存在于自然界中。此類經分離的蛋白質可W由基因組DNA、cDNA、mRNA或其它RNA編碼，可W是合成來源，或其任何組合。在某些實施例中，經分離的蛋白質實質上不含見于其天然環境中并且將干擾其用途(治療、診斷、預防、研究或其它）的蛋白質或多膚或其它污染物。[0123]在特定實施例中，受試經修飾的TCR可W具有:a)具有與本文所述的經修飾的TCR的a鏈可變區至少80%-致、至少85%-致、至少90%、至少95%或至少98%或99%-致的氨基酸序列的TCRa鏈可變區；和b)具有與本文所述的經修飾的TCR的0鏈可變區至少80%-致、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%或99%-致的氨基酸序列的齡連可變區。[0124]在特定實施例中，經修飾的TCR可W包含:a)包含W下各者的TCRa鏈可變區：i.氨基酸序列與本文所述的所選TCR的a鏈CDRl區一致的CDRl區；ii.氨基酸序列與所選TCR的a鏈CDR2區一致的CDR2區；和iii.氨基酸序列與所選TCR的a鏈CDR3區一致的CDR3區；W及b)包含W下各者的e鏈可變區：i.氨基酸序列與所選TCR的0鏈CDRl區一致的CDRl區；ii.氨基酸序列與所選TCR的0鏈CDR2區一致的CDR2區；和iii.氨基酸序列與所選TCR的0鏈CDR3區一致的CDR3區；其中TCR特異性結合所選非同源抗原。在另一實施例中，經修飾的TCR或其抗原結合片段是變異的經修飾的TCR，其中除了Va和VP區的CDR區中的多達8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個氨基酸取代W外，變異體包含與所選經修飾的TCR-致的a鏈和0鏈。就此來說，所選變異的經修飾的TCR的CDR區中可W存在1、2、3、4、5、6、7、8個、或在某些實施例中9、10、11、12、13、14、15個更多個氨基酸取代。取代可W在CDR中Va和/或W區中。（參看例如Muller,1998,《結構（StrucUire)》6:1153-1167)。[0125]在一個實施例中，提供了一種多核巧酸，其編碼經修飾的TCR或其抗原結合片段。在其它相關實施例中，多核巧酸可W是編碼經修飾的TCR的多核巧酸的變異體。多核巧酸變異體與編碼本文所述的經修飾的TCR的多核巧酸序列可W具有實質一致性。舉例來說，多核巧酸可W是使用本文所述的方法(例如，使用標準參數的BLAST分析，如下文所描述），與參考多核巧酸序列（例如編碼本文所述的TCR的序列）相比包含至少70%序列一致性、優選至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高序列一致性的多核巧酸。本領域的技術人員將認識到，運些值可W適當地調整，W便通過考慮密碼簡并、氨基酸類似性、閱讀框架定位等，確定由兩個核巧酸序列編碼的蛋白質的相應一致性。[0126]典型地，多核巧酸變異體將含有一個或多個取代、添加、缺失和/或插入，優選使得由變異的多核巧酸編碼的TCR的結合親和力相對于由本文具體闡述的多核巧酸序列編碼的抗體并不實質上降低。[0127]當比較多核巧酸序列時，如果如下文所描述，兩個序列中的核巧酸的序列當經比對W獲得最大對應性時相同，那么兩個序列被稱為"一致的"。兩個序列之間的比較典型地通過在比較窗口比較序列W鑒別和比較局部區的序列類似性來進行。如本文所用，"比較窗口"是指至少約20個、通常30到約75個、40到約50個鄰接位置的片段，其中在兩個序列經最優比對之后，序列可W與具有相同數目的鄰接位置的參考序列相比較。[0128]用于比較的序列的最優比對可W使用默認參數，使用生物信息學軟件的Lasergene套件中的Megalign程序（DNASTAR公司，威斯康星州麥迪遜(Madison,WI))來執行。此程序體現了W下參考文獻中描述的若干比對方案=Dayhoff，M.0.(1978)用于檢測遠緣關系的蛋白質-基質的進化變化的模型（Amodelofevolutionarychangeinproteins-M曰tricesfordetectingdistentrel曰tionships).D曰yhoff,M.0.(編）蛋白質序列和結構地圖集(AtlasofProteinSequenceandShucture),國家生物醫學研究基金會（化tionalBiomedicalResearch!^undation),華盛頓哥倫比亞特區（WashingtonDC)第5卷，增刊3,第345-358頁;胎inJ.，比對和系統發育的通用方法化nifiedApproachtoAlignmentandF*hylogenes),第626-645頁（1990);《酶學方法》第183卷,學術出版公司(AcademicPress,Inc.),加利福尼亞州圣地亞哥（SanDiego,CA);Higgins,D.G.和化a巧，P.M.,CABIOS5:151-153(1989);Myers，E.W.和MullerW.,CABIOS4:11-17(1988);Robinson，E.D.，《組合療法（Comb.Theor)》l1:105(1971);Santou，N.化S，M.，《分子生物學與進化(Mol.Bio1.Evo1.)M:406-425(1987);Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.，《數值分類法-數值分類法的原理與實踐（NumericalTaxonom}f-thePrinciplesandPracticeofNumericalTaxonomy)》，弗里曼出版社（FreemanPress),加利福尼亞州舊金山（SanFrancisco,CA)(1973);WHbur，W.J.和Lipman，D.J.，《美國國家科學院院刊》80:726-730(1983)。[0129]或者，用于比較的序列的最優比對可W通過Smith和Waterman,Add.A化.Math2:482(1981)的局部一致性算法、通過化edleman和Wunsch,《分子生物學雜志（J.Mol.Biol.)》48:443(1970)的一致性比對算法、通過化arson和Lipman，《美國國家科學院院刊》85:2444(1988)的類似性方法檢索、通過運些算法的計算機化實施方案(威斯康星遺傳學軟件包，遺傳學計算機組(GeneticsComputerG;roup，GCG),575ScienceDr.,威斯康星州麥迪遜中的GAP、BEST門T、BLAST、FASTA和TFASTA)或通過檢查來執行。[0130]適用于確定序列一致性百分比和序列類似性的算法的一個優選實例是化AST和BLAST2.0算法，其分別描述于Altschul等人，《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》25:3389-3402(1977)和Altschul等人，《分子生物學雜志》215:403-410(1990)中。BLAST和BLAST2.0可W例如W本文所述的參數使用W確定兩種或更多種多核巧酸之中的序列一致性百分比。用于進行化AST分析的軟件通過美國國家生物技術信息中屯、（NationalCenterforBiotechnologyInformation)公開可用。在一個說明性實例中，對于核巧酸序列，累積得分可W使用參數M(-對匹配殘基的獎勵得分;始終〉0)和N(錯配殘基的懲罰得分;始終<0)計算。當累積比對得分從其達到的最大值降低量X;累積得分因一次或多次負分殘基比對的累積而變成0或低于0;或到達任一序列的末端時，中斷字命中點在各方向上的延伸。BLAST算法參數W、T和X確定比對的靈敏度和速度。化ASTN程序（對于核巧酸序列）使用如下默認參數:字長(W)是11，并且期望值(E)是10,并且化0SUM62計分矩陣（參看化nikoff和化nikoff,《美國國家科學院院刊》89:10915a989))比對(B)是50，預期值化)是10，M=5，N=-4，并且比較兩條鏈。[0131]在某些實施例中，"序列一致性百分比"通過在至少20個位置的比較窗口比較兩個最優比對序列確定，其中比較窗口中的多核巧酸序列部分與用于兩個序列的最優比對的參考序列（其不包含添加或缺失)相比可W包含20%或更少、通常5到15%或10到12%的添加或缺失（即，間隙）。百分比通過W下方式計算:確定兩個序列中存在的一致核酸堿基的位置數得到匹配位置數，將匹配位置數除W參考序列中的總位置數（即，窗口大小），并且將結果乘WlOO得到序列一致性百分比。[0132]本領域的普通技術人員應了解，作為遺傳密碼簡并的結果，存在許多編碼如本文所述的TCR的核巧酸序列。運些多核巧酸中的一些與編碼結合到例如相同抗原的經修飾的TCR的天然或初始多核巧酸序列的核巧酸序列具有最小序列一致性。盡管如此，本發明明確地涵蓋由于密碼子使用差異而改變的多核巧酸。在某些實施例中，具體涵蓋已經經過密碼子優化W用于哺乳動物表達的序列。[0133]用于克隆、DNA分離、擴增和純化；用于設及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制核酸內切酶等的酶促反應的標準技術;和各種分離技術是本領域的技術人員已知并且通常利用的技術。多種標準技術描述于Sambrook等人（1989)《分子克隆(MolecularCloning)》,第二版，冷泉港實驗室（ColdSpring化rborLaboratoiT),紐約普萊恩維尤（Plainview,New化'1〇;131113*13等人（1982)《分子克隆》，冷泉港實驗室，紐約普萊恩維尤;￥11(編）（1993)《酶學方法》218,第I部分;Wu(編）（1979)《酶學方法》68;Wu等人(編）（1983)《酶學方法》100和101;Grossman和Moldave(編）《酶學方法》65;MiIler(編）（1972)《分子遺傳學實驗化xperimentsinMolecularGenetics)》，冷泉港實驗室，紐約冷泉港（ColdSpringHarbor,NewYork);01d和Primrose(Igsi)《基因操縱原理（PrinciplesofGeneManipulation)》，加利福尼亞大學出版社（UniversityofCaliforniaPress),伯克利(Berkeley);Schleif和Wensink(1982W分子生物學實用方法（PracticalMethodsinMolecularBiology)》；Glover(編）（1985WDNA克隆（DNACloning)》第巧PII卷，I化出版社，英國牛津（Oxford，UK);Hames和Higgins(編）（1985パ核酸雜交（NucleicAcidHybridization)》，I化出版社，英國牛津；W及Setlow和HolIaender(1979)《基因工程：原理和方法（GeneticEngineering=PrinciplesandMethods)》，第1-4卷，普雷納姆出版社(PlenumPress),紐約(NewYork)中。縮寫和命名在使用時被視為本領域中標準的并且常用于專業雜志(例如本文引用的那些）中。[0134]核巧酸序列之間的同源性可W通過DNA雜交分析確定，其中雙鏈DNA雜交體的穩定性與出現的堿基配對程度相關。高溫和/或低鹽含量的條件降低雜交體的穩定性，并且可W改變W防止具有低于所選同源性程度的序列退火。舉例來說，對于具有約55%G-C含量的序列，40-50°C、6XSSC(氯化鋼/巧樣酸鋼緩沖液)和0.1%SDS(十二烷基硫酸鋼)的雜交和洗涂條件指示約60-70%同源性，50-65°C、1XSSC和0.1%SDS的雜交和洗涂條件指示約82-97%同源性，并且52°C、0.1XSSC和0.1%SDS的雜交和洗涂條件指示約99-100%同源性。廣泛范圍的用于比較核巧酸和氨基酸序列（并且測量同源性程度）的計算機程序也是可用的，并且提供市售和自由軟件的來源的清單見于Ausubel等人（1999)中。容易獲得的序列比較和多序列比對算法分別是局部比對檢索基本工具(BasicLocalAlig皿entSearchTool,BLASTKAltschul等人，1997)和ClustalW程序。BLAST在因特網上在ncbi.nlm.n化.gov可用并且Clus1:alW的版本在.ebi.ac.址可用。[0135]工業微生物菌株(例如，黑曲霉、無花果曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、里氏木霉、米黑毛霉、乳酸克魯維酵母、己斯德畢赤酵母、釀酒酵母、大腸桿菌、枯草芽抱桿菌或地衣芽抱桿菌）、昆蟲（果蛹）、哺乳動物（例如，中國倉鼠卵巢細胞系，CH0)或植物物種（例如，芥花、大豆、玉米、±豆、大麥、黑麥、小麥）可W用作用于重組產生TCR蛋白質的宿主細胞。在某些實施例中，高親和力TCR蛋白質或可溶蛋白質的異源表達中的第一步驟，表達構筑體被組裝W包括TCR或可溶TCR編碼序列和控制序列，例如啟動子、增強子和終止子。還可W包括其它序列，例如信號序列和可選標記。為了實現TCR的細胞外表達，表達構筑體可W包括分泌信號序列。在實施例中，如果需要細胞質表達，那么信號序列不包括于表達構筑體上。在實施例中，啟動子和信號序列在宿主細胞中起作用并且提供TCR或可溶TCR蛋白質的表達和分泌。可W包括轉錄終止子W確保高效轉錄。增強表達或蛋白質純化的輔助序列也可W包括于表達構筑體中。[0136]根據本發明可W使用各種啟動子(轉錄起始調節區）。適當啟動子的選擇可W取決于所提議的表達宿主。來自異源來源的啟動子只要其在所選宿主中起作用就可W使用。[0137]啟動子選擇還取決于膚或蛋白質產生的所要效率和水平。誘導型啟動子（例如化C)通常用W顯著增加大腸桿菌中的蛋白質表達水平。蛋白質的過度表達可能對宿主細胞有害。因此，宿主細胞生長可能受限。誘導型啟動子系統的使用使得宿主細胞可在誘導基因表達之前培養到可接受密度，因此促進更高產物產率。[0138]根據本發明可W使用各種信號序列。可W使用與TCR編碼序列同源的信號序列。或者，還可W使用已經被選擇或設計用于在表達宿主中高效分泌和加工的信號序列。舉例來說，適合信號序列/宿主細胞對包括用于在枯草芽抱桿菌中分泌的枯草芽抱桿菌sacB信號序列，和用于己斯德畢赤酵母分泌的釀酒酵母Q-交配因子或己斯德畢赤酵母酸性憐酸酶地Ol信號序列。信號序列可W通過編碼信號膚酶裂解位點的序列直接連接到蛋白質編碼序列，或通過由通常少于十個密碼子組成的短核巧酸橋連接，其中橋確保下游TCR序列的正確閱讀框架。[0139]已經針對真核蛋白質表達系統鑒別了用于增強轉錄和轉譯的元件。舉例來說，將花挪菜花葉病毒(CaMV)啟動子1000bp定位于異源啟動子的任一側上可W使植物細胞中的轉錄水平提高10到400倍。表達構筑體還應該包括適當轉譯起始序列。修飾表達構筑體W包括Kozak共有序列用于恰當轉譯起始可W使轉譯水平提高10倍。[0140]通常利用選擇性標記，其可W是表達構筑體的一部分或從其分離(例如，由表達載體攜載），使得標記可W整合于不同于相關基因的位點處。實例包括賦予抗生素抗性的標記(例如，對于大腸桿菌宿主細胞賦予氨節西林抗性的bla、賦予多種多樣的原核和真核細胞W卡那霉素抗性的nptll)或允許宿主生長于基本培養基上的標記(例如，HIS4使得己斯德畢赤酵母或化S-釀酒酵母能夠在不存在組氨酸的情況下生長）。可選標記具有其自身的轉錄和轉譯起始和終止調節區W使得標記可獨立表達。如果抗生素抗性用作標記，那么用于選擇的抗生素的濃度將取決于抗生素而變化，通常范圍介于10到60化g抗生素/mL培養基。[0141]表達構筑體通過利用已知重組DNA技術(Sambrook等人，1989;Ausubel等人，1999)組裝。限制酶消化和連接是用W連接DNA的兩個片段的基本步驟。DNA片段的末端可能需要在連接之前修飾，并且運可W通過填充突出端、用核酸酶(例如，ExoIII)使片段的末端部分缺失、定點誘變或通過PCR添加新堿基對來實現。多連接子和銜接子可W用W促進所選片段的連接。表達構筑體典型地在利用大腸桿菌的多輪限制、連接和轉化的各階段中組裝。眾多適用于構筑表達構筑體的克隆載體在本領域中已知UZAP和pBLUESCRIPTSK-I，Stratagene,加利福尼亞州拉荷亞(；LaJolIa,CA);祀T,NovagenInc威斯康星州麥迪遜-引用于Ausubel等人，1999中）并且特定選擇對于本發明并不重要。克隆載體的選擇將受經選擇用于將表達構筑體引入宿主細胞中的基因轉移系統影響。在每一階段結束時，所得構筑體可W通過限制、DNA序列、雜交和PCR分析來分析。[0142]表達構筑體可W轉化到宿主中作為線性或環狀的克隆載體構筑體，或可W從克隆載體移出并且按原樣使用或引入到遞送載體上。遞送載體促進所選宿主細胞類型中表達構筑體的引入和維持。表達構筑體通過多種已知基因轉移系統中的任一種（例如，天然感受態、化學介導的轉化、原生質體轉化、電穿孔、生物彈射擊轉化、轉染或結合）引入宿主細胞中(Ausubel等人，1999;Sambrook等人，1989)。基因轉移系統取決于所用的宿主細胞和載體系統而選擇。[0143]舉例來說，表達構筑體可W通過原生質體轉化或電穿孔而引入釀酒酵母細胞中。釀酒酵母的電穿孔容易實現，并且產生與原生質球轉化相當的轉化效率。[0144]在除配位體結合部位W外的位點處與TCR蛋白質特異性地反應的單克隆或多克隆、優選單克隆抗體可W通過本領域中已知的方法制備，并且許多是市售的。參看例如化rlow和Lane(1988)《抗體：實驗室手冊（Antibodies:ALaboratoiTManual)》，冷泉港實驗室；Goding(1986)《單克隆抗體：原理和實踐(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice)》，第2版，學術出版社(AcademicPress),紐約；和Ausubel等人（1999)《最新分子生物學實驗方法匯編（CurrentProtocolsinMolecularBiology)》，約翰?威利父子公司（JohnWiley&Sons,Inc.),紐約。[0145]對特定標祀配位體具有特異性的呈細胞結合或可溶形式的TCR適用作例如用于篩選生物樣品（例如細胞、組織樣品、活檢物質、體液等)或用于檢測測試樣品中標祀配位體的存在的診斷探針。TC則寸常通過共價或非共價連接提供可檢測信號的物質而標記。適合標記包括(但不限于)放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、巧光劑、化學發光劑、磁性粒子等。另外，TCR可W偶合到針對第二結合分子的配位體:舉例來說，TCR可W經生物素化。結合到標祀細胞或分子的TCR的檢測然后可W通過結合可檢測抗生蛋白鏈菌素（巧光、放射性、化學發光或其它可檢測分子連接的抗生蛋白鏈菌素，或其中存在發色底物的酶可用于的抗生蛋白鏈菌素)來實現。描述待共價結合到scTCR的此類標記和/或毒性化合物的使用的美國專利包括(但不限于)第3,817,837號、第3,850,752號、第3,927，193號、第3,939,350號、第3，996，345號、第4，277，437號、第4，275，149號、第4，331，647號、第4，：348，376號、第4，361，544號、第4,468,457號、第4,444,744號、第4,640,561號、第4,366,241號、第RE35,500號、第5,299,253號、第5,101,827號、第5,059,413號。[0146]經標記的TCR可W使用對于所使用的標記適當的監測裝置或方法檢測。可W使用巧光顯微術或巧光激活細胞分選術，其中標記是巧光部分，并且在標記是放射性核素時，可W使用例如T計數、放射自顯影或液體閃爍計數，限制條件為所述方法對于要分析的樣品和所用的放射性核素是適當的。另外，可W利用二級檢測分子或粒子，其中存在識別TCR的部分的可檢測分子或粒子，所述部分在不存在如本文提到的MHC組分的情況下不是標祀配位體的結合位點的一部分。本領域知曉適用于原位診斷成像的化合物;參看例如美國專利第5，101，827號、第5,059,413號。適用于體內療法和/或成像的放射性核素包括111銅、97鋼、US艦、1"艦、I23艦、67嫁、99得。毒素包括尤其白喉毒素、藍麻毒素和藍麻子毒素，限制條件為在TCR-毒素復合物結合到細胞后，毒性部分內化，使得其可W發揮其細胞毒性作用。免疫毒素技術為本領域所熟知，并且適合毒性分子包括(但不限于)化學治療藥物，例如長春地辛(Vindesine)、抗葉酸劑（例如甲氨蝶嶺）、順銷（Cisplatin)、絲裂霉素、蔥環霉素(anthrocycline)(例如道諾霉素（daunomycin)、道諾比星（daunorubicin)或阿霉素(adriamycin));和細胞毒性蛋白質，例如核糖體失活蛋白質，例如，白喉毒素、美洲商陸抗病毒蛋白質、相思豆毒素、藍麻毒素、假單胞菌外毒素A或其重組衍生物。一般來說，參看例如Olsnes和Pihl(1982)《藥物療法(Pharmac.Ilier.)》25:355-381;和《用于癌癥檢測和療法的單克隆抗體(MonoclonalAntibodiesforCancerDetectionandTherapy)》，Baldwin和Byers編，第159-179頁，學術出版社，1985。[0147]已經公開了TCR分子的通式結構W及制備和使用(包括結合到膚:主要組織相容性復合物)方法。參看例如PCT/US98/04274、PCT/US98/20263、W099/60120。[0148]醫藥組合物和治療劑[0149]對特定標祀配位體具有特異性的TCR適用于治療被認為罹患與特定抗原相關的疾病(例如，寶生性疾病或病癥，例如癌癥）的動物和哺乳動物，包括人類。可W根據本文所述的方法治療的癌癥的類型的實例包括(但不限于)維爾姆斯氏腫瘤(Wilms't皿or)、膀脫癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、淋己瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤、非小細胞肺癌、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、膜臟癌、前列腺癌、腎癌、皮膚癌、小細胞肺癌和睪丸癌。[0150]治療產品可W使用本文展示的物質制備。治療產品的有效量是在受試者中產生可測量效果的最小劑量。治療產品容易由本領域的普通技術人員制備。在一個實施例中，本發明的TCR直接投與到患者。在一個實施例中，本發明的TCR連接到陽G或免疫球蛋白恒定區，如本領域中已知。此實施例延長了血清清除。在一個實施例中，TCR連接到化學治療劑或藥物W便將藥物遞送到標祀細胞，例如癌細胞。在一個實施例中，TCR連接到生物效應分子，例如細胞因子(Tayal和Kalra(2008)《歐洲藥理學雜志化urJ陸3^113。〇1)》，579，1-12)。在一個實施例中，TCRW抗腫瘤活性連接到細胞因子，例如化-2、化-12或TNFa(Wong等人(2011)《蛋白質工程、設計與選擇》，24,373-83)。在一個實施例中，TCR連接到免疫抑制性細胞因子，例如IL-IO或IL-13(Stone等人(2012)《蛋白質工程》）。在一個實施例中，TCR連接到另一抗原結合分子W形成雙特異性藥劑(Miller等人（2010)《蛋白質工程、設計與選擇》，23，549-57;lliakur和Lum(2010)《分子治療學當前觀點（CurrOpinMol化6')》，12,340-9)。在一個實施例中，雙特異性分子由TCR連接到單鏈Fv(例如抗CD3)組成(Bargou等人(2008)《科學》，321，974-7;Liddy等人(2012)《自然?醫學》，18，980-7)，W交聯T細胞和病變細胞。在一個實施例中，TCR連接到TCR信號傳導域（例如CD3)W形成嵌合抗原受體（Porter等人(2011)《新英格蘭醫學雜志(N^iglJMed)》，365,725-33;Sadelain等人(2009)《免疫學當前觀點》，21，215-23;Stroncek等人（2012)《轉化醫學雜志（JIYanslMed)》，10，48)。投藥的運些方法和其它方法(例如靜脈內）在本領域中已知。適用劑量可W由本領域的普通技術人員確定。[0151]TCR組合物可W通過本領域中已知的任何方式調配。其典型地可W制備為可注射劑，尤其用于靜脈內、腹膜內或滑膜投藥(途徑由特定疾病決定）；或調配物，用于鼻內或口服投藥，呈液體溶液或懸浮液形式。還可W制備適用于在注射或其它投藥之前溶解或懸浮于液體中的固體形式。制劑還可W例如經乳化，或蛋白質/膚封裝于脂質體中。[0152]活性成分通常與任選的醫藥添加劑(例如賦形劑或載劑)混合，所述醫藥添加劑是醫藥學上可接受的并且與活性成分相容。適合賦形劑包括(但不限于）水、生理鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等和其組合。scTCR于可注射劑、氣霧劑或經鼻調配物中的濃度通常在0.05到5mg/ml范圍內。特定有效劑量的選擇是已知的并且由本領域的普通技術人員在無過度實驗的情況下進行。類似劑量可W投與到其它粘膜表面。[0153]另外，必要時，可W包括scTCR的疫苗可W含有微量的醫藥添加劑，例如輔助物質，例如潤濕或乳化劑、pH緩沖劑和/或增強疫苗有效性的佐劑。可能有效的佐劑的實例包括(但不限于）：氨氧化侶;N-乙酷基-胞壁酷基-心蘇氨酷基-D異谷氨酷胺（thr-MDP);N-乙酷基-正-胞壁酷基-1^-丙氨酷基-D-異谷氨酷胺(CGP11637,稱為nor-MDP);N-乙酷基胞壁酷基-心丙氨酷基-D-異谷氨酷胺酷基-k丙氨酸-2-(1'-2二棟桐酷基-Sn-甘油-3?基憐酷氧基)-乙胺(CGP19835A，稱為MTP-陽）；和RIBI，其在2%角整締/T識e班@80乳液中含有S種從細菌提取的組分:單憐酷脂質A、二霉菌酸海藻糖和細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。還可W使用如本領域中已知的此類額外調配物和投藥模式。[0154]本發明的TCR和/或具有與TCR可變區類似(大于90%-致性)的一級結構并且維持對于標祀配位體的高親和力的結合片段可W調配成中性或鹽形式的疫苗。醫藥學上可接受的鹽包括(但不限于)用無機酸(例如，鹽酸或憐酸)和有機酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸或馬來酸)形成的酸加成鹽（用膚的游離氨基形成）。用游離簇基形成的鹽也可W來源于無機堿，例如，鋼、鐘、錠、巧或鐵氨氧化物;和有機堿，例如，異丙胺、=甲胺、2-乙基氨基-乙醇、組氨酸和普魯卡因（procaine)。[0155]用于治療用途的TCRW與劑量調配物相容的方式投與，并且根據本領域已知的內容，其量和方式例如是預防和/或治療有效的。待投與的量，其通常在每劑量約100到20，000yg蛋白質范圍內，更通常在每劑量約1000到l〇,〇〇〇yg蛋白質范圍內。類似組合物可W使用經標記的TCRW類似方式投與W用于成像，W便例如檢測標祀配位體所結合的細胞。所需投與的活性成分的確切量可W取決于醫生或獸醫的判斷，并且可W為每個個體所特有，但此類確定在此類執業醫生的技能范圍內。[0156]TCR產物可W在單一劑量中；在二劑量時程(例如間隔二到八周）中；或在多劑量時程中給出。多劑量時程是其中主要治療過程可W包括1到10個或更多個單獨劑量、接著是視需要在后續時間間隔投與W維持和/或加強反應的其它劑量的時程。[0157]除非另外陳述，否則所描述或例示的組分的每種調配物或組合可W用W實踐本發明。物質的具體名稱預期是例示性的，因為已知本領域的普通技術人員可W按不同方式命名相同物質。當在本文中描述化合物，方式為例如在化學式或化學名稱中不規定化合物的特定異構體或對映異構體時，所述描述預期包括個別或W任何組合描述的化合物的每種異構體和對映異構體。本領域的普通技術人員將了解，除具體例示的那些W外的方法、標祀配位體、生物活性基團、起始物質和合成方法可W用于不借助于過度實驗而實踐本發明。任何此類方法、標祀配位體、生物活性基團、起始物質和合成方法的所有本領域已知的功能等效物預期包括于本發明中。每當在說明書中給出范圍（例如溫度范圍、時間范圍或組成范圍）時，所有中間范圍和子范圍W及所給出范圍中所包括的所有個別值預期都包括于本發明中。[0158]確切配方、投藥途徑和劑量可W由個別醫生鑒于患者的病況選擇(參看例如Fingl等人，《治療學的藥理學基礎（ThePharmacologicalBasisofHierapeutics)》，1975,第1章第頂）。[0159]應注意，主治醫生會了解如何和何時因毒性或器官功能障礙而終止、中斷或調整投藥。反之，主治醫生還會了解在臨床反應不充足(排除毒性)時將治療調整到更高水平。處理所關注病癥時的投與劑量的量值將隨待治療的病況的嚴重程度和投藥途徑而變化。病況的嚴重程度可W例如部分通過標準預后評估方法評估。此外，劑量和可能劑量頻率也將根據個別患者的年齡、體重和反應而變化。獸醫學中也可W使用與上文論述的程序相當的程序。[0160]取決于所治療的特定病況和所選的祀向方法，此類藥劑可W經調配和全身或局部地投與。調配和投藥的技術可W見于Alfonso和Gennaro(1995)中。適合途徑可W包括例如口服、直腸、經皮、陰道、經粘膜或腸道投藥;腸胃外遞送，包括肌肉內、皮下或髓內注射，W及銷內、靜脈內或腹膜內注射。[0161]對于注射，本發明的藥劑可W于水溶液中，優選于生理學相容的緩沖液(例如漢克溶液化anks'solution)、林格氏溶液(Ringer'Ssolution)或生理鹽水緩沖液）中調配。對于經粘膜投藥，在調配物中使用適于待滲透的屏障的滲透劑。此類滲透劑通常是本領域中已知的。[0162]醫藥學上可接受的載劑用W將本文公開用于實踐本發明的化合物調配成適用于全身性投藥的劑量的用途屬于本發明的范圍內。通過恰當選擇載劑和適合制造實踐，本發明的組合物、尤其調配成溶液的組合物可W在腸胃外，例如通過靜脈內注射而投與。適當化合物可W容易使用本領域中熟知的醫藥學上可接受的載劑調配成適用于口服投藥的劑量。此類載劑使本發明的化合物能調配成片劑、丸劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，用于由待治療的患者口服攝取。[0163]預期細胞內投與的藥劑可W使用本領域的普通技術人員熟知的技術投與。舉例來說，此類藥劑可W封裝到脂質體中，并且然后如上文所述投與。脂質體是具有水性內部的球形脂質雙層。在脂質體形成時存在于水溶液中的所有分子都并入水性內部中。脂質體內含物受外部微環境保護，并且因為脂質體與細胞膜融合，所W被高效遞送到細胞的細胞質中。另外，由于其疏水性，因此小有機分子可W直接細胞內投與。[0164]適用于本發明中的醫藥組合物包括其中活性成分W有效實現預期目的量包含在內的組合物。有效量的確定完全在本領域的技術人員的能力范圍內，尤其根據本文所提供的詳細公開內容。[0165]除了活性成分之外，運些醫藥組合物可W含有有助于將活性化合物加工成可W在醫藥學上使用的制劑的適合醫藥學上可接受的載劑，包含賦形劑和助劑。經調配用于口服投藥的制劑可W呈片劑、糖衣藥丸、膠囊或溶液形式，包括經調配用于延遲釋放或僅在藥物到達小腸或大腸時釋放的制劑。[0166]本發明的醫藥組合物可W按本身已知的方式制造，例如，借助于常規混合、溶解、粒化、糖衣藥丸制備、懸浮、乳化、封裝、包覆或凍干工藝。[0167]用于腸胃外投藥的醫藥調配物包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的懸浮液可W制備成適當的油性注射懸浮液。適合的親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，例如芝麻油;或合成脂肪酸醋，例如油酸乙醋或甘油=醋;或脂質體。水性注射懸浮液可W含有增加懸浮液粘度的物質，例如簇甲基纖維素鋼、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，懸浮液還可W含有適合的穩定劑或提高化合物的溶解度W允許制備高度濃縮溶液的試劑。[0168]用于口服用途的醫藥制劑可W通過W下方式獲得:將活性化合物與固體賦形劑組合，任選地研磨所得混合物，和在必要時添加適合助劑之后，加工顆粒的混合物，獲得片劑或糖衣藥丸忍。具體來說，適合的賦形劑是填充劑，例如糖，包括乳糖、薦糖、甘露糖醇或山梨糖醇;纖維素制劑，例如玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、上豆淀粉、明膠、黃著膠、甲基纖維素、徑丙基甲基纖維素、簇甲基纖維素鋼和/或聚乙締化咯燒酬(PVP)。必要時，可W添加崩解劑，例如交聯聚乙締化咯燒酬、瓊脂或海藻酸或其鹽(例如海藻酸鋼）。[0169]糖衣藥丸忍具有適合包衣。出于此目的，可W使用濃縮糖溶液，其可W任選地含有阿拉伯膠、滑石、聚乙締化咯燒酬、卡波莫凝膠(carbopolgel)、聚乙二醇和/或二氧化鐵、漆溶液和適合的有機溶劑或溶劑混合物。染料或顏料可W添加到片劑或糖衣藥丸包衣中W鑒別或表征活性化合物劑量的不同組合。[0170]可W經口使用的醫藥制劑包括由明膠制成的推入配合膠囊(push-fitcapsule)W及由明膠和例如甘油或山梨糖醇的塑化劑制成的軟密封膠囊。配合插入膠囊可W含有活性成分與例如乳糖的填充劑、例如淀粉的粘合劑和/或例如滑石或硬脂酸儀的潤滑劑W及任選的穩定劑的混雜物。在軟膠囊中，活性化合物可W溶解或懸浮于適合液體(例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇）中。另外，可W添加穩定劑。[0171]治療方法[0172]高親和力TCR和包含高親和力TCR的醫藥組合物可W用W例如治療患有癌癥、月中瘤、惡性腫瘤或寶生性疾病或病癥的患者。在一個實施例中，治療患有癌癥的患者的方法包含投與本文所述的高親和力TCR。在另一實施例中，高親和力TCR對存活素具有特異性。在一個實施例中，TCR包括包含SEQIDNO:1中闡述的氨基酸序列的Va。在另一實施例中，TCR包括包含SEQIDNO:2中闡述的氨基酸序列的Va。在一個實施例中，高親和力TCR是包含SEQIDN0:3中闡述的氨基酸序列的單鏈TCR。在另一實施例中，高親和力TCR是包含SEQIDNO:4中闡述的氨基酸序列的單鏈TCR。在另一實施例中，高親和力TCR與治療劑(例如，化學治療劑)組合投與。在又一實施例中，高親和力TCR結合到生物活性基團。[0173]本發明的另一方面提供了一種用于將T細胞過繼轉移到有需要的患者的方法，其包含投與表達本文所述的高親和力TCR的T細胞。在一個實施例中，T細胞已經用編碼對存活素具有特異性的高親和力TCR的多核巧酸轉染。在一個實施例中，TCR包括包含SEQIDNO:1中闡述的氨基酸序列的Va。在另一實施例中，TCR包括包含SEQIDN0:2中闡述的氨基酸序列的Va。在一個實施例中，高親和力TCR是包含SEQIDNO:3中闡述的氨基酸序列的單鏈TCR。在一個實施例中，高親和力TCR是包含SEQIDN0:4中闡述的氨基酸序列的單鏈TCR。[0174]實例[0175]W下實例進一步描述了本發明的非限制性實例。[017W實例1[0177]經工程化W獲得對膚/HLA-A2抗原的更高親和力的TCR[0178]用W發現或產生單鏈TCRW獲得提高的親和力和穩定性的通用策略展示于圖1中。所述方法包括六個步驟，如所說明：[0179]1)將來自識別所關注的MH邱良制抗原膚的T細胞克隆的Va和VPTCR基因克隆成單鏈TCR形式W用于呈現。在本發明中，將來自與存活素抗原反應性的一種人類T細胞克隆的TCR基因（來自DeloresSchendel,!"IiomasBlankenstein和WolfgangUckert;參看例如Leisegang等人(2010)《臨床研究雜志(JClinInvest)》.120(11),3869)克隆為單鏈形式(W-連接子-Va)，并且引入酵母呈現載體中用于表達于酵母表面上。與存活素抗原反應性的野生型TCR的進一步描述參看US2012/0128704。[0180]2)針對具有抗W抗體的穩定化變異體，產生易錯庫和進行FACs或磁珠選擇。因為單鏈Va和WTCR通常由于穩定化恒定區的失去而不穩定，所W產生易錯誘變庫W針對使得可穩定表達于酵母表面上的穩定化突變選擇，但可W使用其它呈現形式，包括(但不限于）隧菌體和哺乳動物呈現。隧菌體呈現載體和克隆產生了1〇11的庫大小，而酵母呈現載體和同源重組步驟產生了l〇w的庫大小(Benatuil等人(2010)《蛋白質工程、設計與選擇》，23,155-9)。各種方法已經用于選擇變異體，包括與固定化配位體的基于親和力的結合（隧菌體呈現)或抗原情況下的磁粒選擇(酵母呈現），或經標記的膚-MH討亢原情況下的巧光激活細胞分選術(酵母呈現）。在本實例中，利用針對識別折疊表位的TCRVP的抗體，巧光激活細胞分選術(FACS)或磁珠選擇用W分離具有改進的抗體結合的變異體。[0181]3)評估從易錯庫的選擇中分離的scTCR克隆的熱穩定性，并且針對親和力成熟的模板，選擇穩定化變異體，并且進行測序。典型地，鑒別促進增加的酵母表面水平和更大溶液穩定性的單一位點突變。[0182]4)將穩定化scTCR序列用作用于通常在CDRla、CDR3a、CDR3f3中產生CDR庫的模板，但還可W使用其它區，包括(但不限于)CDRl0、CDR2a、CDR20和HV4。在本發明中，通過使用磁珠選擇和/或巧光激活細胞分選術(FACS)，針對改進的與膚:MHC的結合從CDR庫選擇酵母呈現變異體，但可W使用利用其它方法的選擇，包括(但不限于）隧菌體呈現情況下的淘選或哺乳動物呈現情況下的磁性選擇或FACS。[01削5)評估從CDR庫的選擇中分離的scTCR克隆的與膚:MHC的特異性結合，所述scTCR克隆針對所述膚:MHC工程化。從酵母克隆捶救質體，并且對其測序。[0184]6)如果需要進一步的親和力提高，那么步驟5中所選擇的scTCR克隆可W用作用于在不選擇突變的其它環或區（例如CDRla、CDR3a、CDR3f3)中產生額外庫的模板，但還可W使用其它區，包括(但不限于)CDRie、CDR2a、CDR2f3和HV4。運些步驟中的每一個的實例進一步描述于下文中。[01化]實例2[01化]人類TCRA6的分析，其使用Va2,與化x:HLA.A2復合[0187]TCR都采用類似Ig折疊和對接角，并且P邱MHC的TCR識別完全由CDR環上的特定殘基介導(Garcia等人(2009)《自然?免疫學》，10，143-7;Marrack等人(2008)《免疫學年鑒》，26,171-203;Rudol地等人(2006)《免疫學年鑒》，24,419-66)。盡管存活素TCR的晶體結構在本發明提出時不可用，但展示了使用與存活素TCR相同的Va2域的A6:Tax膚:HLA-A2復合物(PDB:1A07)(Garboczi等人（1996)《自然》，384,134-141)。復合物的側視圖顯示，含有六個CDR的可變域的末端對接到化x:HLA.A2分子上，結合位點的中屯、區定位于膚化X上（圖2A)。晶體結構不包括恒定區a,但恒定區有助于使全長構筑體穩定化。上文所述的在步驟2中選擇的穩定化突變通常在框架區中選擇，例如va/ve相間或化/Va或邱/ve相間的接合點在全長TCR中的存在處。[018引展示了除了六個CDR環W外，TCR"被去除"的^x=HLA.A2復合物的俯視圖（圖2B)。此圖顯示，TCR在膚-M肥上采用對角線位置，運是現在對于所有TCR:膚-M肥結構都觀察到的發現。在此方向上，兩個CDR3環定位于膚上，而來自CDRl和CDR2環的各種殘基主要與MHC分子的螺旋相互作用。出于步驟4和6中的親和力成熟的目的，運些環通常被祀向用于產生親和力成熟庫，但可W使用其它區。[0189]實例3[0190]存活素TCR的酵母呈現[0191]為了針對提高的穩定性(步驟2)或提高的親和力(步驟5)進行選擇，有必要使用如下呈現系統，其中可W分別針對與識別構象表位的抗體或膚:MHC配位體的結合，[0192]篩選TCR突變體的庫。S種呈現系統已經用于使TCR工程化W獲得更高親和力，并且可W用于此過程:酵母呈現、隧菌體呈現和T細胞(哺乳動物細胞)呈現。替代性呈現方法(例如核糖體、RNA、DNA和CIS呈現)也可能適用于此過程。在所有運些情況下，將對于抗原具有低親和力的野生型TCR克隆到系統中，并且用作用于使TCR工程化W針對膚:MHC配位體具有增強的穩定性和親和力的模板。運些系統中的任一種可W應用于此處描述的方法，其中單一TCR被用作具有增強的結合性質的TCR的庫和選擇的模板。[0193]在本實例中，酵母呈現被用作平臺（圖3)。存活素TCR被用作用于經由易錯誘變使突變穩定化的模板，并且從選擇中分離的穩定化克隆被用作親和力成熟的模板。[0194]實例4[01M]穩定化存活素TCR，Surv-K2的易錯庫構筑和選擇[0196]如先前所描述(Richman等人(2009)《分子生物學方法(MethodsMolBiol)》，504，323-350)利用獲自協作者(稱為存活素71)的存活素反應性TCR作為模板，產生存活素易錯庫。通過組合經線性化的PCT302載體、存活素易錯PCR產物和感受態邸Y100酵母細胞，將人類存活素易錯庫引入酵母呈現載體中。通過在電穿孔之后接種限制稀釋等分試樣的酵母對所得庫進行判斷，并且其含有約8.25XIO6個獨立克隆。針對與識別人類V的0、抗hV的OFITCIgG(貝克曼庫爾特(BeckmanCoulter))的抗體的結合，經由FACS根據表4選擇庫。[0197]表4.分選條件[019引[0[0200]使用熱變性研究，我們鑒別了此抗體識別ve2〇上的折疊表位(數據未展示）。使用AlcxaFluor3M88山羊抗小鼠IgG(生命技術(XifeTechnologies))二級抗體擴增信號。[0201]在3次迭代分選期間，V的0陽性染色群體出現（圖4A)。在第3次分選之后，分離被稱為Surv-K2的克隆，其具有改進的V的0巧光（圖4B)DSurvK2克隆被用作親和力成熟的模板。[020。實例5[0203]具有增強的與存活素:HLA.A2、Surv-K2.4.1和Surv-K2.4.6的結合的兩種存活素TCR的CDR3a庫構筑和選擇[0204]從易錯PCR庫的選擇中分離的穩定化Surv-K2克隆被用作用于經由重疊延伸剪接(SOE)產生跨越5個殘基的CDR3a庫的模板。因此通過組合經線性化的PCT302載體、Surv-K2CDR30庫PCR產物和感受態EBYlOO酵母細胞，將人類Surv-K2CDR3ascTCR庫引入酵母呈現載體中。通過在電穿孔之后接種限制稀釋等分試樣的酵母對所得庫進行判斷，并且其含有約2.98XIO7個獨立克隆。根據表5使用磁性柱連續S次并且使用FACS-次，對Surv-K2CDR3a庫進行分選。[02化]表5.分選條件[0黑1[0207]在使用磁珠的兩次分選之后，適中陽性染色群體開始出現（圖5A)。在第四次分選之后分離克隆Surv-K2.4.1和Surv-K2.4.6DSurv-K2.4.1和SurvK2.4.6展示增強的與SurvT2M(LMLGEFLKL，沈QIDN0:5)/HLA-A2的結合（圖5B)。[020引實例6[0209]高親和力存活素TCR，Surv-K2.4.1的結合分析[0210]為了評估從CDR3a庫的選擇中分離的Surv-K2.4.1克隆的結合，將呈現511'乂-K2.4.1的酵母用SurvT2M(LMLGEFLKL，SEQIDNO:5)/HLA-A2單體在6.4nM、32nM、160nM、8(K)nM和化M下滴定，并且通過流式細胞術分析(圖6A)。使用非線性回歸分析將各值標準化，并且確定279±44.5nM的Kd,3pp(圖6B)。[0211]實例7[0212]獲得針對存活素抗原的提高的親和力的TCR的序列分析[0213]測定穩定化scTCR克隆K2和從親和力成熟庫中分離的存活素特異性化2.4.1和K2.4.6)高親和力單鏈變異體的序列。如圖7中所示，來源于酵母呈現庫的兩種高親和力克隆的CDR區中存在突變。圖7中的加下劃線的位置指示起因于針對穩定化突變的易錯庫選擇的突變。框中的位置展示選自CDR庫的親和力增強性突變。[0214]實例8[0215]T細胞中的K2.4.ITCR的體夕慌性[0216]為了評估T細胞中的K2.4.ITCR的活性，將CD8T細胞從AAD轉基因小鼠中分離。然后將運些T細胞用抗CD3/抗CD28珠子活化24小時。將T細胞用PMP71載體反轉錄轉導，所述載體含有K2.4.ITCR的Va和0域連接到鼠類2CTCR的Ca和邱域（圖8A)。為了證實K2.4.ITCR的表達，轉導后48小時將T細胞用濃度是20nM的Sur^2M:HLA-A2四聚體染色（圖8B)dK2.4.1轉導的T細胞(黑色)展示與模擬轉導的T細胞(灰色)相比增加的SurvT2M:HLA-A2結合，證實了高親和力TCR的表面表達。然后將T細胞在1:化:T下與外源地負載有滴定濃度的存活素膚的T2細胞一起培育。表達K2.4.ITCR的T細胞在SurvT2M膚存在下活化并且當用稱為WTl(RMFPNAPYL，SEQIDNO:14)的對照膚呈遞時不活化，表明此TCR在CD8T細胞中是活性并且特異性的。腳7]實例9[0218]存活素、Surv-K2.4.1和Surv-K2.4.6TCR的治療形式[0219]現在眾所周知，較高親和力TCR可W按各種形式用于祀向表達相應抗原的細胞。因此，顯而易見的是，由上文展示的工程化策略產生的TCR可W按可溶形式使用或按TCR基因療法形式用于過繼T細胞療法，如圖9中所說明。[0。0]材料和方法[0。1]抗體、膚:HLA-A2、MACS和流式細胞術試劑[0222]用W檢測酵母表面表達的抗體包括：抗HA表位標簽（克隆HA.11;科文斯(Covance))、抗hV03FITC抗體（克隆CH92;貝克曼-庫爾特（Beckman-Coulter))、抗hVe3.巧11'(：抗體(克隆8。10;賽默科技）、抗的的0抗體(克隆化1^.4;貝克曼-庫爾特）、產生于我們的實驗室的抗Va2單克隆抗體(數據未展示）、山羊抗小鼠IgMAPC(生命技術）、山羊抗小鼠IgGF(ab'）2AIexaFIuor貨.647二級抗體（英杰）、抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白（SA:PE，BDPharmingen)和MACS微珠（MiltenylBiotec)。[0223]在賓州州立大學醫學院（PennStateUniversityCollegeofMedicine)(美國賓夕法尼亞州赫胥（Hershey,PA,USA))的大分子核屯、設施（MacromolecularCoreFacility)，通過標準F-moc(N-(9-巧基）甲氧幾基）化學，合成結合到HLA-A2Su;rvT2M:LMLGEFLKL(SEQIDNO:5)錯定殘基2的膚（經從T到M的修飾W獲得改進的HLA-A2結合）(Andersen等人，2001，《癌癥研究（CancerResearch)》61,5964-5968)。對于FACS和流式細胞術分析，使用重組可溶二聚HLA-A2:Ig融合蛋白（BD?Dime巧）。另外，將通過在UV光存在下將UV可裂解膚換成另一HLA.A2限制膚產生的單體化A.A2-生物素試劑用于流式細胞術和MACS選擇（Rodenko等人（2006)《自然實驗手冊（化tProtoc)》，l，1120-1132;Toebes等人(2006)《自然?醫學》，12,246-251)。[0。4]SCTv于酵母呈現載體中的克隆和表達[02巧]使TCR可變區片段（scTv)表達于酵母呈現質體pCT302(Ve-l^-Va)中（Boder和Wittrup(2000)《酶學方法》，328，430-444)，所述質體含有允許生長于化P培養基中的半乳糖誘導性AGA2融合體。SCTv基因的誘導包括使經轉化的邸YlOO酵母細胞在選擇培養基中生長到生長停滯期，接著轉移到含半乳糖的培養基。由金斯瑞(Genscript)(美國新澤西州皮斯卡塔威(Piscataway，NJ,USA))合成模板存活素WTl單鏈TCR基因，其在構筑體的Va2域中具有F49S突變(Aggen等人(2011)《蛋白質工程、設計與選擇》，24，361-372)。[0226]將存活素特異性TCR基因從CTL克隆（針對存活素的TCR基因，來自DeloresSchendel,ThomasBlankenstein和WoIfgangUckert;例如Leisegang等人（2010)《臨床研究雜志》.120(11)，3869)中分離，由金斯瑞合成基因，克隆為單鏈形式(W-連接子-Va)，引入酵母呈現載體中用于表達于酵母表面上。SCTv由可變組成含有通過連接子區GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQIDNO:7)連接化OO等人（1992)《美國國家科學院院刊》，89，4759-4763;Weber等人(2005)《美國國家科學院院刊》，102,19033-19038;Aggen等人(2011)《蛋白質工程、設計與選擇》，24,361-372)。將SCTv引入PCT302的Mie巧肋hoi限制位點中。[0227]b變SCTv酵母呈現庫的產生、呈現和選擇[0。引易錯PCR用W產生隨機突變，如先前所描述(Richman等人（2009)《分子免疫學》，46,902-916)。使用重疊延伸剪接（SOE)PCR產生一次跨越4-5個相鄰密碼子的CDRl和3庫化OTton等人(1990)《生物技術》，8，528-535)。[0229]對于SurvCDR3a庫，利用W下引物對產生PreSOEPCR產物：5'-GGCAGCCCCATAAACACACAGTAT-3'（剪接化）（SEQIDNO:8)和5'-CACAGCGCACAGATAGGTAGC-3'(SEQIDNO:10)W及5'-CTGATTCAGCTACCTATCTGTGCGCTGTGNNSNNSNNSNNSNNSATGTTTGGCGATGGTACTCAGCTGGTTGTG-3'（SEQIDNO:11)和5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'（T7)(SEQID^:9)。對每個相應？'6506與17和剪接化一起進行50￡PCR。[0230]通過將易錯或SOEPCR產物與Nhe巧日趾ol消化pCT302-起電穿孔，通過在EBYlOO酵母中同源重組來制備酵母庫化Odon等人(1990)《生物技術》，8,528-535)。將庫于含半乳糖的培養基(SG-CAA)中誘導48小時，用ImL1%PBS/BSA洗涂，并且用抗體或膚:MHC試劑W圖4A、5A、6A、8A和9A中指示的濃度染色。洗涂（Iml，1%PBS/BSA)細胞，并且使用FACSAria(碧迪生物科學（BDBioscience))高速分選儀或經由MACSLS柱在Qua化oMACS?分離器(MiltenylBiotec)上選擇大多數巧光細胞。為了測試經分離的克隆的熱穩定性，在染色方案之前將酵母在高溫下培育30分鐘(數據未展示）。[0231]高親和力克隆的分離和染色[0232]在選擇之后，通過接種限制稀釋液分離庫克隆。使群落擴增并且于含半乳糖的培養基（SG-CAA)中誘導48小時，用ImL1%PBS/BSA洗涂，并且用各種濃度的膚/HLA.A2DimerX、山羊抗小鼠IgGF(ab'）2AlexaFluor某647二級抗體或各種濃度的UV交換膚/HLA.A2、SA-陽染色。將細胞洗涂（Iml，1%PBS/BSA)，并且在AccuriC6流式細胞儀上進行分析。[0233]使用巧moprep?酵母質體MiniprepII(巧moResearch)回收質體，并且經由熱休克轉化到亞克隆Efficiency?DH5a?感受態細胞(英杰）中而將其引回大腸桿菌中。使大腸桿菌細胞擴增，并且使用QIApr邱SpinMiniprep試劑盒(凱杰(Qiagen))分離質體。通過桑格測序(Sangersequencing)對個別克隆的序列進行測定。[0234]關于W引用的方式并入和變化形式的聲明[0235]本文引用的所有參考文獻，例如包括已頒發或授予的專利或等效物的專利文件；專利申請案公開;和非專利文獻文件或其它原始材料，特此W全文引用的方式并入本文中，如同個別地W引用的方式并入一般，其程度使得每個參考文獻至少部分不會與本申請中的公開內容不一致(例如，將部分不一致的參考文獻除了參考文獻的部分不一致部分W外W引用的方式并入）。[0236]本說明書中提及的所有專利和公開都指示本發明所屬領域的技術人員的技能水平。本文引用的參考文獻W全文引用的方式并入本文中，用W指示在一些情況下到其提交日為止的現有技術水平，并且預期在需要時此信息可W在本文中用W排除（例如，放棄)現有技術中的特定實施例或者使用現有技術水平中的方法或材料而不具體包括本文公開內容中的方法或材料。舉例來說，當要求化合物時，應理解，現有技術中已知的化合物，包括本文所公開的參考文獻(尤其參考的專利文件）中公開的某些化合物，并不打算包括于權利要求中。[0237]當在本文中使用馬庫什(Markush)群組或其它分組時，所述群組的所有個別成員W及所述群組的所有可能組合和子組合預期個別地包括于本發明中。[023引在本文中使用術語。包含（。0111口1'136/。0111口1'1363/。0111口1'136(1/。0111口1'13；[]1邑)"時，其欲解釋為規定所提及的所陳述特征、整數、步驟或組分的存在，但不排除一個或多個其它特征、整數、步驟、組分或其群組的存在或添加。還預期涵蓋如下的本發明的單獨實施例，其中術語"包含(comp;rising/comp;rise(SVcomprised)"任選地替換成文法上類似的術語，例如"由……組成"或"基本上由……組成"，W便因此描述未必共同延伸的其它實施例。為清楚起見，如本文所用，"包會'與"具有"、"包巧'、"含嘗'或"特征為'同義，并且是包括性或開放性的并且不排除額外未列出的要素或方法步驟。如本文所用，"由……組成"排除權利要求要素中未規定的任何要素、步驟、組分或成分。如本文所用，"基本上由……組成"不排除不會實質上影響權利要求的基本和新穎特征(例如，不影響活性成分）的材料或步驟。在本文中各情況下，術語"包含"、"基本上由……組成"和"由……組成"中任一者可W替換成其它兩個術語中的任一者。可W適合地在不存在本文未具體公開的任何要素、限制的情況下實踐本文說明性地描述的公開內容。[0239]已經參考各種特定和優選實施例與技術來描述本發明。然而，應理解，在保持在本發明的精神和范圍內的同時，可W進行許多變化和修改。本領域的普通技術人員將了解，除本文具體描述的那些W外的組合物、方法、裝置、裝置元件、材料、任選特征、程序和技術可W用于不借助于過度實驗而實踐如本文廣泛公開的本發明。預期本發明涵蓋本文所述的組合物、方法、裝置、裝置元件、材料、程序和技術的所有本領域已知的功能等效物;和其部分。每當公開范圍時，預期涵蓋所有子范圍和個別值。本發明不受所公開的實施例限制，所述實施例包括圖中展示或說明書中例示的任何實施例，其作為實例或說明給出并且不具限制性。本文提供的一些參考文獻W引用的方式并入本文中，用W提供關于本發明的額外起始物質、額外合成方法和額外分析方法和額外用途的細節。[0240]本領域的技術人員將容易了解，本發明非常適于實施所提及的目標和獲得所述目的和優勢W及其中固有的那些。本文所述的如目前代表優選實施例的組合物W及方法和輔助方法是例示性的并且預期不為對本發明的范圍的限制。本領域的技術人員將想到其中的變化和其它用途，所述變化和用途涵蓋于本發明的精神內。[0241]參考文獻[0242]1.AddoM.M.,DraenertR.,RathodA.,VerrillC.L.,DavisB.T.,GandhiR.T.,RobbinsG.K.,BasgozN.O.,StoneD.R.,CohenD.E.,JohnstonM.N.,FlynnT.,WurcelA.G.,RosenbergE.S.,AltfeldM.和Wa化erB.0.(2007)完全分化的HIV-I特異性CDSW效應細胞在受控制中比在進行性HIV-I感染中更頻繁地檢測到（FulIyDifferentiatedHIV-ISpecificCD8+TEffectorCellsAreMoreFrequentlyDetectableinControlledthaninProgressiveHlV-lInfection).《公共科學圖書館?綜合(PLoS0肥）》2，e321。[0243]2.AggenD.H.,ChervinA.S.,InsaidooF.K.,PiepenbrinkK.,H.,BakerB.M.和KranzD.M.(2011)允許表達穩定單鏈T細胞受體的人類可變區的鑒別和工程化(Identificationandengineeringofhumanvariableregionsthatallowexpressionofstablesingle-chainTcellreceptors).《蛋白質工程、設計與選擇(ProteinEngineering,Design,feSelection)》24,361-72。[0244]3.AnikeevaN.,MareevaT.,LiuW.和SykulevY.(2009)寡聚T細胞受體能否用作檢測受感染細胞上的病毒膚表位的工具（CanoligomericT-cellreceptorbeusedasatooltodetectviralpeptideepitopesoninfectedcells)?《臨床免疫學(ClinImmunol)))130,98-109〇[0245]4.ArmstrongK.M.,PiepenbrinkK.H?和BakerB.M.(2008)版-MHC復合物的構象變化和T細胞受體識別夷活性（ConformationalchangesandflexibilityinT-cellreceptorrecognitionofpeptide-MHCcomplexes)?《生物化學雜志（BiochemJ)M15,183-96。[0246]5.AshfieldR.和JakobsenB.K.(2006)制備高親和力T細胞受體:一類新靴向治療劑(Makinghigh-affinityT-cellreceptors:anewclassoftargetedtherapeutics).!Drugs9,554-9〇[0247]6.Bargou民.，LeoE.,ZugmaierG.,KlingerM.,GoebelerM.,KnopS.，Noppeney民.，ViardotA.，HessG.,SchulerM.,EinseleH.,BrandiC.,WolfA.，KirchingerP.,KlappersP.,SchmidtM.，民iethmulIerG.,ReinhardtC.,BaeuerleP.A.和KuferP.(2008)癌癥患者的通過極化劑量的T細胞接合抗體的腫瘤消退（TumorregressionincancerpatientsbyverylowdosesofaTcell-engagingant化ody).《科學（Science)〉〉321，974-7。[024引T.BenatuilL.,PerezJ.M.，BelkJ?和HsiehC.M.(2010)-種改進的用于產生極大人類抗體庫的酵母轉化方法（Animprovedyeasttransformationmethodfor化egenerationofverylargehumanantibodylibraries).《蛋白質工程、設計與選擇〉〉23，155-9。[0249]8.BirdR.E.,HardmanK.D.,JacobsonJ.W.,JohnsonS.,KaufmanB.M.,LeeS.M.，LeeT.,PopeS.H.,RiordanG.S?和WhitlowM.(1988)單鏈抗原結合蛋白質(Single-chainantigen-bindingproteins).((^4^))242,423-426〇[0巧0]g.BoderE.T?和Wittr叫K.D.(1997)用于篩選組合多版庫的酵母表面呈現(Yeastsurfacedisplayforscreeningcombinatorialpolypeptidelibraries).《自然?生物技術(NatBiotechnol)〉〉15,553-557。[0巧1]10.BoderE.T.和WittrupK.D.(2000)用于蛋白質表達、親和力和穩定性的定向進化的酵母表面呈現（Yeastsurfacedisplayfordirectedevolutionofproteine邱ression,affinity,andstability)?《酶學方法（MethodsEnzymol)〉〉328,430-44D[0巧2]11.BoonT?和OldL.J.(1997)癌癥腫瘤抗原（Cancertumorantigens)?《免疫學當前觀點（CurrOpinImmunol)〉〉9,681-3D[0253]12.BorbulevychO.Y.，San化anagopolanS.M.,HossainM?和BakerB.M.(2011)癌癥基因療法中所用的TCR經由不同機理與MART-l/Melan-A腫瘤抗原交叉反應(TCRsusedincancergenetherapycross-reactwithMA民T-l/Melan-Atumorantigensviadistinctmechanisms).《免疫學雜志（JImmunol)〉〉187,2453-63D[0巧4]13.BrowerV.(1997)Enbrel的III期加強了在RA中的展望[新聞]^nbrel'SphaseIIIreinforcesprospectsinRA[news]).《自然?生物技術〉〉15,1240。[0巧日]14.BulekA.M.,ColeD.K.,SkoweraA.,DoltonG.,GrasS.,MaduraF.,FullerA.,MilesJ.J.,GostickE.,PriceD.A.,DrijfhoutJ.W.,Knight民.民.，HuangG.C.,LissinN.,MolloyP.E.,WooldridgeL.,JakobsenB.K.，民ossJohnJ.，PeakmanM.，RizkallahP.J.和SewellA.K.(2012)在I型糖尿病中通過CD8(+)T細胞殺死人類目細胞的結構基石出(StructuralbasisforthekillingofhumanbetacellsbyCD8(+)Tcellsintypeldiabetes).《自然?免疫學（NatImmunol)〉〉13,283-9〇[0巧6]15.CheeverM.A.,AllisonJ.P.,FerrisA.S.,FinnO.J.,HastingsB.M.，HechtT.T.,MellmanI.,PrindivilleS.A.,VinerJ丄.，WeinerL.M.和MatrisianL.M.(2009)癌癥抗原的優先排序：用于加速轉譯研究的國家癌癥研究所樣板工程（Theprioritizationofcancerantigens:anationalcancerinstitutepilotprojectforthe過cceler過tio打oftr過打si過tio打過Irese過rch).〈〇|各石開(^Cli打Csocer民es)〉〉15,5323-37。[0257]le.ChervinA.S.,AggenD.H.,RasemanJ.M?和KranzD.M.(2008)使用T細胞呈現系統使較高親和力T細胞受體工程化（EngineeringhigheraffinityTcellreceptorsusingaTcelldisplaysystem).《免疫學方、法雜'志（JImmunolMethods)))339,175-84。[0258]17.QiervinAS，StoneJD，SotoCM，EngelsB，SchreiberH，RoyEJ和KranzDM.(2013)用^檢查過繼T細胞反應的具有多樣結合性質的T細胞受體庫的設計(DesignofT-cellreceptorlibrarieswithdiversebindingpropertiestoexamineadoptiveT-cellresponses)?《基因療法（Gene11161^.)))20(6):634-440[0巧9]18.Co化yD.W.,KelloggB.A.,GraffC.P.,YeungY.A.，SwersJ.S?和WittrupK.D.(2004)通過酵母表面呈現使抗體親和力工程化化ngineeringantiibodyaffinitybyyeastsurfacedisplay)?《酶學方法〉〉388,348-58〇[0260]19.DavisM.M.和BjorkmanP.J.(1988)T細胞抗原受體基因和T細胞識別(T-cellantigenreceptorgenesandT-cellrecognition).《自然〉〉334,395-402。[0261]20.DavisM.M.,BonifaceJ.J.,ReichZ.,LyonsD.,HamplJ.,ArdenB?和QiienY.(1998)通過a目T細胞受體的配位體識別(XigandrecognitionbyalphabetaTcellrec邱tors).《免疫學年鑒（AnnuRevImmunol)〉〉16,523-544〇[0262]21.DingY.H.,BakerB.M.,GarbocziD.N.,BiddisonW.E?和WileyD.C.(1999)產生極不同的T細胞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