融合蛋白的制作方法

融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種包含p75N?TR(NBP)部分和免疫球蛋白部分的p75NTR神經營養因子結合蛋白(NBP)?Fc融合蛋白。在某些實施方案中，p75NTR(NBP)?Fc融合蛋白用于治療疼痛和/或疼痛癥狀。
【專利說明】融合蛋白
[000。發明背景
[0002]神經營養因子、神經營養生長因子(NGF)、腦衍生神經營養因子(m)NF)、神經營養 因子3(NT-3)和神經營養因子4/5(NT-4/5)通過4種受體：低親和力p75神經營養受體 (P75NTR)和高親和力酪氨酸激酶受體化kA、TrkB和化kC發揮作用。低親和力受體P75NTR結 合并且被全部4種神經營養因子激活并且已經報道獨立于其他受體發揮作用。但是，更選擇 性地激活化k受體，即，NGF是化kA的選擇性配體，抓NF是TrkB的配體，并且NT-3、NT-4/5是 化kC的配體。此外已經報道，當P75NTR蛋白和Trk蛋白共表達時，它們形成改變兩種受體的 信號傳導的復合物化Uang和Reichar化，2003，生物化學年評(Annu Rev Biochem.)72:609-42)。實際上，已經提出P75NTR促進每種神經營養因子對其相應Trk受體的選擇性。
[0003 ] P75NTR是腫瘤壞死因子受體超家族(TNFR-SF)的成員并且是運個超家族中充分表 征的第一個成員。運個超家族(在人類中由大約30個基因編碼）由配體結合結構域定義，所 述配體結合結構域由首先在P75NTR中鑒定的40氨基酸富含半脫氨酸結構域(CRD)的一個或 多個（一般4個）重復序列組成（Johnson等人，1986細胞（Cell )47:545-554 ;Radeke等人， 1987自然(化化re) 325:593-597)。與之相反，全部TNFR-SF家族成員的胞內結構域不共有序 列基序。因此，TNFR-SF蛋白的信號傳導機制大幅度變動。
[0004] P75NTR結構的不尋常特征是存在借助跨膜結構域內部的半脫氨酷殘基形成的二 硫鍵連接的P75NTR二聚體。運個二硫鍵是P75NTR進行有效神經營養因子依賴性信號傳導所 需要的并且在胞內和胞外結構域的形成中發揮重要作用(Vilar等人，2009神經元(Neuron) 62:72-83)。神經營養因子在生理學上作為非共價締合的二聚體存在(Bothwell和化OOter， 1977生物化學雜志(J Biol Chem. )252(23) :8532-6),分布半壽期為大致5分鐘（Tria等人， 1994實驗神經學化邱Neurol.) 127(2): 178-83)。神經營養因子依賴性P75NTR激活包含神 經營養因子二聚體與P75NTR二聚體的兩個胞外結構域的C畑2-4締合化e和Garcia,2004科 學(Science) 304:870-875)。最近的研究支持一種模型，其中神經營養因子結合造成P75NTR 二聚體的兩個胞外結構域移動靠得更近，迫使胞內結構域W該二硫鍵為中屯、的蝸牛錯樣 (snail-tong-like)運動展開并允許胞內結構域與信號傳導銜接蛋白NRIF和TRAF6締合 (ViIar等人，2009細胞科學雜志（J Cell Sci )122:3351-3357 ,Vilar等人，2009神經元 (Neuron) 62:72-83)。W前尚未在其他TNFR-SF家族成員中或任何其他膜蛋白中描述跨膜結 構域內二硫鍵，如P75NTR中存在的那些。
[0005] p75NTRW類似于刻缺蛋白（Notch)和0-淀粉樣前體蛋白（0-amyloid precursor protein)的切割賴性信號傳導途徑的方式依次接受a-分泌酶活性和丫-分泌酶活性和基質 金屬蛋白酶(MMP)的蛋白酶剪切，釋放其胞內結構域(ICD)至細胞質中（Jung等人，2003生物 化學雜志（J Biol 化em)，278:42161-42169;Kanning等人，2003神經科學雜志（J Neuro-sci)23:5425-5436)Dp75NTR ICD通過運條途徑的胞質釋放促進相關NRIF的信號傳導 化enchappa等人，2006神經元(Neuron)SO :219-232)。在a-分泌酶活性和丫-分泌酶活性和 MMP的蛋白酶剪切后，P75NTR胞外結構域的作用未得到充分理解。
[0006] 已經記錄，NGF和其他神經營養因子(BDNF、NT-3和NT-4/5)在病理學例如因骨關節 炎、膜腺炎、類風濕性關節炎、銀屑病、搔癢癥和多發性硬化所致的疼痛中發揮重要作用 (Wannabe等人，2008神經研究雜志（J化urosci Res. )86(16) :3566-74);Raychau化Uri等 人，2011關節炎風濕病(Arthritis )63(11) :3243-52;Ba;rthel等人，2009關節炎研 究療法（A;rth;ritis Res Hier. 11)(3) =RSSilYuzzi等人，2011 細胞死亡分化（Cell Death Differ. )18:948-58;McDonald等人，2011 當今藥物化學（Curr Med 化em. )18:2:34-44; Yamaoka等人，2007皮膚病學科學雜志（J Dermatol Sci. )46(1) :41-51)。證實針對任何神 經營養因子;NGF或抓NF、NT-3和NT-4/5的選擇性抗體顯著地減少疼痛。另外，還已經證實針 對神經營養因子受體P75NTR化k A、化k B或Trk C的抗體在疼痛模型中有效(Orita S等 人，2010 整形外科研究雜志（J Orthop Res.)28:1614-20;Svensson P 等人，2010 疼痛 (化in. )148:473-80; Iwakura等人，2010手外科學美國卷（J 化nd Surg Am. )35:267-73; Cirilio等人，2010細胞分子神經生物學（Cell Mol Neurobiol. )30:51-62;Pezet等人， 2010疼痛（Pain. )90:113-25;化yashi等人，2011 疼痛雜志（J Pain. )12:1059-68;Chu等人， 2011 疼痛(Pain. )152:1832-7;Ueda等人，2010藥學科學雜志（J Pharmacol Sci. )112:438-43;加 i Iardi 等人，2010 骨（Bone. )48:389-98 ; Fukui 等人，2010 整形外科研究雜志（J Odhop Res . )2010; 28: 279-83) dF址Ui等人(2010)在一個疼痛模型中（坐骨神經擠壓后的 機械性異常疼痛）用抗P75NTR抗體治療后顯示疼痛相關性終點方面的顯著功效。從運項研 究得出結論，用P75NTR抑制性抗體治療減少CGRP和P75NTR表達，導致顯著減少疼痛。
[0007]本發明設及一種P75NTR神經營養因子結合蛋白（NBP)-Fc融合蛋白。我們描述了運 種分子的親和力和體內動力學，W及動物模型中治療疼痛的有效性。p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白可用于治療疼痛和其他神經營養因子相關性疾病，如銀屑病、濕疹、類風濕性關節炎、 膀脫炎、子宮內膜異位癥和骨關節炎。
[000引發明概述
[0009] 根據本發明的第一方面，提供一種P75NTR神經營養因子結合蛋白（NBP)-Fc融合蛋 白，所述融合蛋白包含：
[0010] (a)p75NTR(NBP)部分;和
[0011] (b)免疫球蛋白化部分。
[0012] 優選地，p75NTR(NBP)部分和化部分經接頭連接。更優選地，接頭包含式Gx的膚，其 中X是1、2、3、4、5或6。
[0013] 在根據本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的特別優選的實施方案中，P75NTR (NBP)是人p75NTR(NBP)。在根據本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的另一個特別優選的實 施方案中，Fc是人Fc。
[0014] 在又一個優選的實施方案中，本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列或由SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列組成。在另一個優選的實 施方案中，本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白包含SEQIDN0.15中所述的氨基酸序列或由 SEQ ID NO. 15中所述的氨基酸序列組成。
[0015] 在一個優選實施方案中，根據本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白W通過表面等離 子體共振在20°C所測量的約O.OlnM至約50nM之間的結合親和力化d)與NGF、BDNF、NT3或 NT4/5的任一者結合。
[0016] 在本發明的第二方面，根據本發明任何其他方面提供如所述那樣的p75NTR(NBP)- Fe融合蛋白用于治療疼痛或疼痛癥狀。
[0017] 在本發明的第S方面，提供編碼根據本發明第一方面或第二方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的核酸分子，所述核酸分子任選地還包括編碼信號序列。
[0018] 在本發明的第四方面，提供一種用于轉染細胞、可選地轉染哺乳動物細胞的復制 型表達載體，所述載體包含根據本發明的第=方面的核酸分子。
[0019] 優選地，該復制型表達載體是病毒載體。
[0020] 在本發明的第五方面，提供一種攜帶本發明的第=方面的核酸分子的宿主細胞。
[0021] 在本發明的第六方面，根據本發明第=方面的核酸分子或根據本發明第四方面的 載體用于治療疼痛或疼痛癥狀。
[0022] 疼痛或疼痛癥狀包括但不限于:急性疼痛;慢性疼痛;炎性疼痛;傷害性疼痛;神經 病理性疼痛(neuropathic pain);痛覺過敏；異常性疼痛(allodynia);中樞性疼痛；癌疼 痛；術后疼痛；內臟疼痛;肌肉骨骼疼痛；屯、臟或血管疼痛；頭部疼痛，包括偏頭痛；口面疼 痛，包括牙疼痛和背痛。疼痛的治療包括，但不限于，預防疼痛和/或疼痛癥狀、改善疼痛和/ 或疼痛癥狀、控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發生率，或延遲疼痛和/ 或疼痛癥狀形成或進展。
[0023] 在第屯方面，提供根據第一方面或第二方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或根據 第S方面或第四方面的核酸或載體，其中p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或核酸分子或載體組合 中與第二藥理活性化合物組合時分別、依次或同時使用。
[0024] 在第八方面，本發明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據本發明任何 方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據本發明任何方面的核酸分子或載體，和藥學上可接 受的載體和/或賦形劑。
[0025] 優選地，藥物組合物用于W下任一種或多種情況:預防疼痛和/或疼痛癥狀、改善 疼痛和/或疼痛癥狀、控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發生率或延遲疼 痛和/或疼痛癥狀形成或進展。
[00%]在本發明的又一個方面，提供一種試劑盒;其包含：
[0027] (a)根據本發明任何方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據本發明任何方面的核 酸分子或載體，或根據第八方面的藥物組合物;和
[0028] (b)用于針對W下任一種或多種情況向個體給藥有效量的所述p75NTR(NBP)-Fc融 合蛋白、核酸分子、載體或藥物組合物的說明書:預防或治療疼痛和/或疼痛癥狀或用于緩 解疼痛和/或疼痛癥狀、控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發生率，或延 遲疼痛和/或疼痛癥狀形成或進展。
[0029] 在本發明的又一個方面，提供一種治療和或預防個體中疼痛和/或疼痛癥狀的方 法，所述方法包括向所述個體給藥治療有效量根據本發明任何方面的p75NTR(NBP) -Fe融合 蛋白或根據本發明任何方面的核酸分子或載體，任選地進一步包括藥學上可接受的載體， 或者根據本發明第八方面的藥物組合物。
【附圖說明】
[0030] 圖1.根據本發明的P75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0.1)。。分泌 酶切割位點和丫分泌酶切割位點W粗體顯示。IgGlFc部分W斜體顯示。
[0031] 圖2.圖4中所述的核酸序列（SEQ ID NO.4)的翻譯產物（SEQ ID NO.2)，從起始密 碼子至終止密碼子。
[0032] 圖3.根據本發明的優選的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO. 3) JgGlFc部分W斜體顯示。p75NTR(NBP)部分和Fc部分之間的接頭序列加下劃線顯示。
[0033] 圖4.從5'克隆位點至3'克隆位點的完整產物基因的核酸序列(SEQ ID NO.4)
[0034] 圖5.p75-NTR(NBP)-Fc融合蛋白變體：l:p75_NTR-p75-NTR序列（SEQ ID N0.6);2: 市售p75-NTR-Fc融合蛋白（SEQ ID NO. 7); 3: p75_Fc-Fc序列相對于IgGlza的Lonza恒定區 被修飾的市售p75-NTR-Fc融合蛋白（SEQ ID N0.8);4:p75_Fc_C222S-Fc序列相對于IgGlza 的Lonza恒定區被修飾及位置222處額外半脫氨酸突變成絲氨酸的市售P75-NTR-FC融合蛋 白（沈Q ID ^.9);5:口75_。(3_64別-變體1，提出的具有4殘基甘氨酸接頭的口75-腫1?斗(3融合 蛋白（SEQ ID N0.10);6:p75_Fc_G4Sxl-變體2,所提出的具有單個四甘氨酸絲氨酸接頭的 P75-NTR-FC融合蛋白（SEQ ID N0.11);7:p75_Fc_G4Sx2-變體3,提出具有兩個四甘氨酸絲 氨酸接頭的p75-NTR-Fc融合蛋白（SEQ ID N0.12);8:IgGlza的Lonza恒定區（SEQ ID NO.13)。
[0035] 在運個比對結果中，一種格式方案用來突出顯示推定性受體、Fc-融合蛋白和Fc恒 定區之間具有相似性的區域:加框的類型用來顯示變體蛋白和P75-NTR之間序列相同的區 域;單下劃線用來顯示全部化-融合蛋白和Lonza IgGlza化之間序列相同的區域;斜體用 來顯示在P75-NTR和化恒定區交界處的接頭區域;雙下劃線和粗體類型用來顯示接頭區域 外部序列不相同的位置，在等同于親本P75-NTR Fc-融合蛋白中222的位置處。
[0036] 圖6:p75NTR-Fc在MIA誘導的曬齒動物OA模型中顯著減少疼痛。沖<0.1并且*沖< 0.05
[0037] 圖7:根據本發明的優選的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO. 15) JgGlFc部分W斜體顯示。p75NTR(NBP)部分和化部分之間的接頭序列加下劃線顯 /J、- O
[003引發明詳述
[0039] 根據本發明的第一方面，提供一種P75NTR神經營養因子結合蛋白（NBP)-Fc融合蛋 白，所述融合蛋白包含：
[0040] (a)p75NTR(NBP)部分;和
[0041 ] (b)免疫球蛋白化部分。
[0042] 優選地，p75NTR(NBP)部分和化部分經接頭連接。更優選地，接頭包含式Gx的膚，其 中X是1、2、3、4、5或6。
[0043] 在根據本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的特別優選的實施方案中，P75NTR (NBP)是人p75NTR(NBP)。在根據本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的另一個特別優選的實 施方案中，Fc是人Fc。
[0044] 在又一個優選的實施方案中，本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列或由SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列組成。在另一個優選的實 施方案中，本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白包含SEQIDN0.15中所述的氨基酸序列或由 SEQ ID NO. 15中所述的氨基酸序列組成。
[0045] 優選地，P75NTR神經營養因子結合蛋白p75NTR(NBP)是聚乙二醇化的，進一步優選 地它是糖基化的。
[0046] 本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白優選地與NGF、抓NF、NT3或NT4/5的任一者或多 者W約0.OlnM至約50nM之間的結合親和力化d)結合。在一些優選的實施方案中，結合親和 力化d)在約 0.0111]\1和約0.111]\1、0.化]\1、0.511]\1、111]\1、1.511]\1、化]\1、2.511]\1、化]\1、3.511]\1、411]\1、 4.5nM、5nM、5.5nM、6nM、6.5nM、7nM、7.5nM、8nM、8.5nM、9nM、9.5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、 30nM、35nM、40nM、45nM或50nM的任一者之間，如針對NGF、抓NF、NT3或NT4/5的體外結合測定 法中如本文所述那樣測量，優選地通過表面等離子體共振在2(TC測量。在一些其他的優選 實施方案中，結合親和力化d)是或小于約250pM、300pM、350pM、400pM、450pM、500pM、550pM、 600口]?、6509]\1、7009]\1、7509]\1、8009]\1、8509]\1、9509]\1或1碰的任一者，如采用神經營養因子在 p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的體外結合測定法中如本文所述那樣測量，優選地通過表面等離 子體共振在20°C所測量。在又一個更優選的實施方案中，結合親和力化d)是約0.3nM或約 InM,如采用神經營養因子在p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的體外結合測定法中如本文所述那 樣測量，優選地通過表面等離子體共振在20°C所測量。
[0047] 優選地，本發明的p75NTR(NBP)-化融合蛋白用于治療疼痛或疼痛癥狀的用途。不 希望受任何具體理論約束，發明人認為通過實現前述神經營養因子NGF、抓NF、NT3或NT4/5 的功能活性(定義為調節或者上調或下調神經營養因子的功能活性），例如，前述神經營養 因子因其與其相應受體相互作用而產生的功能活性，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白實現治療疼 痛或疼痛癥狀的效力。
[004引優選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白實現抓NF的功能活性，如通過W下任一者的功 能測定法所評估:神經元和突觸的生長和分化、神經元細胞培養中的存活和分化、Trk信號 傳導、體外或體內刺激軸突增生。
[0049] 優選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白實現NGF的功能活性，如通過測量NGF與化kA結 合和TrkA激活所評估，如經典神經元存活測定法（如在Cowan等人，神經科學年鑒 (Annu.Rev.Neurosci . )2〇01 ;24:55I-GOO中提供）中所展示。
[0050] 優選地，p75NTR( NBP)-化融合蛋白實現NGF的功能活性，如通過測量NT3與內源性 Trk受體結合和內源性Trk受體活性激活所評估，如在化k受體憐酸化、促分裂原活化蛋白激 酶憐酸化報道分子測定法或細胞存活和神經突延展測定法中所展示。
[0051 ] 優選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白實現NT4/5的功能活性，如通過測量NT4/5體外 或體內憐酸化和激活測定法所評估，例如，在髓銷堿性蛋白(MBP)憐酸化測定法或可選地在 體內在血管內皮生長因子（VEGF)/堿性成纖維細胞生長因子誘導的血管發生 (angiogenesis)的基質膠血管發生測定法中所評估。
[0化2] 優選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白與神經營養因子NGF、NT3、抓NF和NT4/5中一者 或多者的接觸殘基結合，如化和Garcia(2001)科學(Science), 301，第870-805頁中所顯示。
[0053] 優選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白是可溶的，優選地可溶于水性溶液中，優選地可 溶于生物流體如血清、血漿、血液中。
[0054] 如本文所用，術語"Fe"或"免疫球蛋白化"或"Ig Fe"理解為意指免疫球蛋白鏈恒 定區的簇基端部分，優選地免疫球蛋白重鏈恒定區的簇基端部分，或其部分。優選地，免疫 球蛋白化包含1) CHl域、CH2域和C冊域，任選地連同免疫球蛋白較鏈區，2 )邸1域和C肥域，任 選地連同免疫球蛋白較鏈區，3 )CH1域和CH3域，任選地連同免疫球蛋白較鏈區，4)CH2域和 CH3域，任選地連同免疫球蛋白較鏈區或5)選自但不限于CH1、CH2和CH3的兩個或更多個結 構域的組合，任選地與免疫球蛋白較鏈區組合。優選地，免疫球蛋白Fc至少包含免疫球蛋白 較鏈區、CH2結構域和C冊結構域，和任選地CHl結構域。優選地，免疫球蛋白Fc包含具有W下 同種型的免疫球蛋白的Fc或Fc部分或由其組成，所述同種型包括但不限于IgG、IgM、IgA、 1邑0、1旨6，進一步優選地1旨61、1旨62、1旨63、1旨64、1旨41、1旨42、31旨4，更優選地1旨61、1旨62或 IgG4，最優選地IgGl。任選地，免疫球蛋白Fe還包含了起到使補體固定或抗體依賴性細胞毒 性最小化或改善與Fe受體結合的親和力的氨基酸突變、缺失、置換或化學修飾。
[0055] 進一步優選地，免疫球蛋白化包含W下任一者或由其組成：（a)CH2域或其部分和 CH3域或其部分，（b)CH2域或其部分，或（c)CH3域或其部分，其中免疫球蛋白化或其部分具 有W下同種型，所述同種型包括但不限于1邑6、1邑1、1邑4、1曲、1巧、進一步優選地1邑61、1邑62、 I gG3、I gG4、I gA 1、I gA2、SI gA、更優選地 I gG 1、I gG2或 I gG4，最優選地 I gG 1。
[0056] 優選地，免疫球蛋白化包含免疫球蛋白重鏈的簇基末端區域或由其組成，并且可 W包含來自IgGJgA或I曲抗體同種型的CH2域和/或C冊域或其部分，或來自IgM或I巧的C肥 域和/或C冊域和/或CH4域或其部分。優選地，免疫球蛋白化包含化片段或由其組成，所述化 片主要段包含CH3和小部分的CH2,如通過胃蛋白酶消化免疫球蛋白可衍生。優選地，免疫球 蛋白化包含完整Fe區或由其組成，所述完整化區包含C肥和C冊，額外地與較鏈區連接，所述 較鏈區是在完整免疫球蛋白中連接CHl區和C肥區的重鏈短片段，如可W通過木瓜蛋白酶消 化免疫球蛋白產生。優選地，免疫球蛋白較鏈區包含較鏈區或較鏈區的部分或由其組成，所 述較鏈區或較鏈區的部分源自IgG、優選人IgG,更優選地選自但不限于IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4,最優選IgGl,或可選地是前述較鏈區實施方案的物種變體或等位變體。所述較鏈區或 免疫球蛋白較鏈區的部分可W位于Fe區的C或N末端處，優選地在N末端處。
[0057] 根據本發明的一個優選實施方案，免疫球蛋白Fe優選地包含免疫球蛋白的化或化 的部分或由其組成，所述免疫球蛋白在CH2區中包含野生型序列的減少化效應子功能的一 個或多個氨基酸突變。優選地，運些突變是A330、P331至S330、S331(氨基酸編號相對于野生 型IgGl序列，其中CH2區域處于人重鏈IgGl恒定區中[歐洲免疫學雜志化ur.J. Immunol.) (1999)29: 2613-2624]。優選地，免疫球蛋白化是糖基化并且在生理抑高度帶電，因此有助 于增溶p75NTR(NBP)dFc區還允許通過抗Fe酶聯免疫吸附測定巧LISA)檢測p75NTR(NBP)，例 如出于診斷目的。本發明的p75NTR(NBP)優選地在正常糖基化位點處使Ig Fe糖基化的細胞 中合成。
[0化引優選地，免疫球蛋白化包含人免疫球蛋白化區或由其組成。
[0059]根據本發明，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白優選地顯示出有利的生物學特性:改善的 p75NTR(NBP)溶解度和/或p75NTR(NBP)穩定性和/或改善的p75NTR(NBP)血清半壽期。改善 的溶解度是合乎需要的，旨在p75NTR(NBP)的生物利用率在給藥時最大化并且可W確定并 實施p75NTR(NBP)的精確劑量。改善的溶解度有利于克服聚集體問題，所述聚集體是不想要 的，在體內遞送時造成疼痛并且導致潛在的炎癥。改善的血清半壽期具有W下優點:促進在 治療使用期間為實現遞送的p75NTR(NBP)的等同治療作用或維持治療作用所要求的劑量水 平減少或給藥頻率減少。在血液或血清中延長的半壽期和更高的穩定性具有如下優點：允 許較少頻率給藥和/或較低給藥水平的劑量方案，因此減少體內潛在毒性或副作用。在運種 情況下，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白在其治療作用方面更強有力和/或在循環中更穩定。所得 的較低或較少給藥頻率在最小化與p75NTR(NBP)給藥可能相關的任何潛在毒性作用或副作 用方面是有利的。p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的分子量還超過單獨的p75NTR(NBP)增加，運具 有W下優點：當靜脈內給藥時，該分子將充分留在血液循環中，從而降低滲透至非目的部位 (例如中樞神經系統）的風險，并且產生適于在祀向的組織中停留或濃縮的分子。
[0060] 優選地，與單獨的p75NTR(NBP)相比，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白顯示改善的P75NTR (NBP)溶解度和/或改善的p75NTR(NBP)穩定性和/或改善的血清半壽期。優選地，改善的溶 解度是在水性溶液(如水）中的、優選地含有賦形劑如緩沖劑和/或鹽、優選地在生理pH、優 選地在抑5至抑8之間、優選地在約抑7時的溶解度，或是在生物流體如血清或血液中的 溶解度。優選地，改善的穩定性是在一段時間范圍內、在一個儲存時間期間或在冷凍和融化 后p75NTR(NBP)蛋白的活性或結構完整性因變性、氧化、片段化或聚集效應所致的穩定性。 結構穩定性可W由變性、氧化、團集或聚集的標準計量判定，可W通過本文中公開的結合測 定法或功能測定法測量活性的穩定性，測量蛋白質血清半壽期的方法是已知的。
[0061 ]優選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可W從多種哺乳動物宿主細胞W高水平表達W 提供單一種類并且可W有效地通過親和層析純化，例如通過與金黃色葡萄球菌 (Staphylococ州S aureus)蛋白A結合來純化。優選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可W二聚 化，并且優選地，與單獨的p75NTR(NBP)相比，二聚體對于神經營養因子NGF、抓NF、NT3或 NT4/5具有增加的親和力。更緊密的結合具有更高效力和更高治療功效的優點，如通過 p75NTR(NBP)效果所判定，例如，如通過本文中公開的神經營養因子功能測定法所測定。更 高的效力具有如下益處:p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可W按較低劑量使用W實現相同的治療 功效，因此減少體內潛在毒性或副作用。
[0062] 優選地，本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白具有約或大于W下任一者的體內半壽 期：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、 54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、 104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、 142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、 180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208或210小時+/-1小時， 本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白進一步優選地具有約或大于24小時的體內半壽期。
[0063] 本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白進一步優選地具有約或大于W下任一者的體 外半壽期：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、 50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、 100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、 138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、 176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208或210日+/-1日，本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白進一步優選地具有約或大于6日的體外半壽期。優 選地在約生理pH、在緩沖的水性溶液，優選地在20°C或37 °C測量穩定性。
[0064] 根據前述優選實施方案，體內半壽期優選地是在大鼠中的半壽期或在人類中的半 壽期，更優選地是在人類中的半壽期。優選地，在體內給藥例如通過靜脈內或皮下注射后， 從本發明p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的血清測量水平確定半壽期。
[0065] p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的p75NTR(NBP)和免疫球蛋白化部分可W由接頭連接。 接頭優選地包含一個或多個氨基酸或由其組成或者包含具有如下個氨基酸的多膚序列或 由其組成:優選地約1至約25個氨基酸、優選地1、2、3、4、5、6、7、8或9個氨基酸的任意個氨基 酸、進一步優選地約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 個氨基酸的任一 個氨基酸，最優選地13個氨基酸。
[0066] 優選地，接頭包含缺少任何穩定二級結構如a螺旋、0鏈、310螺旋和Pi螺旋、多聚脯 氨酸螺旋、a折疊的氨基酸的多膚序列或由其組成。優選地，接頭區域包含限定柔性或動態 或非結構化多膚如柔性環、隨機卷曲或柔性轉角的氨基酸的多膚序列或由其組成，經常發 現運類非結構化多膚連接大蛋白質分子中的二級結構區域。
[0067] 優選地，接頭是如下氨基酸的多膚序列，所述氨基酸包含p75NTR(NBP)中大于或約 50 %的甘氨酸和/或丙氨酸和/或絲氨酸，進一步優選地包含p75NTR(NBP)中大于或約55 %、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的甘氨酸和/或丙氨酸和/或絲氨酸。 接頭區域優選地包含如下氨基酸的多膚序列或由其組成，所述氨基酸包含甘氨酸和絲氨酸 二者，優選地甘氨酸的比例大于絲氨酸的比例，接頭區域優選地包含柔性接頭或由其組成。
[0068] 不希望受任何具體理論約束，發明人認為，柔性接頭克服或防止空間位阻，其中與 單獨的p75NTR(NBP)相比時，所述空間位阻可能干擾p75NTR(NBP)-Fc融合物的前述神經營 養因子結合能力或生物活性。因此，接頭區域優選地允許p75NTR(NBP)部分和免疫球蛋白化 部分之間的柔性并且與單獨的游離或天然p75NTR(NBP)相比，允許保留或改善P75NTR (NBP)-Fc融合蛋白的前述生物活性，如使用如本文所述的結合測定法通過與神經營養因子 的結合所測定。
[0069] 進一步優選地，接頭是免疫上惰性的，從而它不觸發補體介導的溶解，不刺激抗體 依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)，不活化小膠質細胞或T細胞。優選地，接頭區域在運些活 性的一種或多種活性方面減弱。
[0070] 進一步優選地，接頭包含從結構分析或結構預測中已知或預測為柔性或動態或非 結構化多膚或缺少穩定二級結構的多膚或由其組成。
[0071 ]最優選地，接頭包含式Gx的膚或由其組成，其中X是1、2、3、4、5或6。
[0072] 本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白還可W包含蛋白酶剪切位點，所述剪切位點任 選地間插在p75NTR(NBP)部分和免疫球蛋白化部分之間。該蛋白酶剪切位點可W位于接頭 中或接頭與p75NTR(NBP)部分或/和免疫球蛋白化部分的交界處。p75NTR(NBP)可W任選地 在配制和或為治療目的給藥之前從免疫球蛋白Fc部分切下。
[0073] 備選地，本發明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可W經工程化W移除蛋白酶剪切位 點。在一個優選實施方案中，可W移除a分泌酶切割位點和丫分泌酶切割位點。在一個特別 優選的實施方案中，移除序列GSSQPWTRGTTDNDIEGR MD(SEQ ID N0.5)。
[0074] 在其他的優選實施方案中，可W改變p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白中的某些氨基酸W 改善特性如產率或溶解度。一個特別優選的實施方案是將位置222處的半脫氨酸殘基變成 絲氨酸殘基，發現所述改變在制造該蛋白質期間從C冊細胞表達時減少蛋白質的聚集。
[0075] 優選地，接頭和/或免疫球蛋白化部分不損害或不明顯損害p75NTR(NBP)部分：
[0076] (a)對神經營養因子NGF、抓NF、NT3或NT4/5的功能活性的影響（定義為調節或上調 或下調神經營養因子的功能活性），
[0077] (b)針對NGF、抓NF、NT3或NT4/5中任一者的結合親和力，結合親和力在約O.lnM至 約50nM之間，
[007引 （C)與神經營養因子NGF、NT3、抓NF和NT4/5每一者、優選地與人NGF、NT3、抓NF和 NT4/5結合的能力。
[0079] 根據本發明的另一個方面，提供編碼根據第一方面或第二方面的p75NTR(NBP)-Fc 融合蛋白的核酸分子。優選地，該核酸分子用于治療疼痛。
[0080] 根據本發明的一個優選實施方案，該核酸分子還可W包含編碼信號序列，優選地 P75NTR信號序列的區域，例如DNA或RNA序列。
[0081] 根據本發明的另一個方面，提供一種用于轉染細胞的可復制表達載體，所述載體 包含第=方面的核酸分子，優選地該載體是病毒載體。優選地，該載體用于治療疼痛的用 途。
[0082] 進一步根據本發明的W上方面，提供一種表達本發明的核酸分子或載體W產生或 分泌p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的方法。優選地，該方法包括將核酸分子或載體引入細胞并 且在其中表達所述核酸W產生或分泌p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白。優選地，將核酸分子或載 體體外引入細胞中，可選地體內引入。優選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的表達是體外表 達，任選地進一步分離并純化，備選地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的表達優選地是體內表 達，體內表達優選地構成基因治療。優選地，載體是可復制表達載體，任選地用于轉染哺乳 動物細胞，優選地，載體是病毒載體。
[0083] 根據本發明的另一個方面，提供一種攜帶第=方面或第四方面的核酸分子或載體 的宿主細胞，優選地，細胞是哺乳動物細胞。
[0084] 根據本發明的另一個方面，提供用于治療疼痛或疼痛癥狀的p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白，或用于治療疼痛或疼痛癥狀的核酸或載體。疼痛或疼痛癥狀可W包括但不限于：
[0085] (a)急性疼痛和/或自發性疼痛，
[0086] (b)慢性疼痛和或持續性疼痛，
[0087] (C)炎性疼痛，包括W下任一種:關節炎疼痛、因骨關節炎或類風濕性關節炎產生 的疼痛、因炎性腸病、銀屑病和濕疹產生的疼痛，
[0088] (d)傷害性疼痛，
[0089] (e)神經性疼痛，包括痛苦的糖尿病性神經病或與瘤疹后神經痛相關的疼痛，
[0090] (f)痛覺過敏，
[0091] (g)異常性疼痛，
[0092] 化）中樞性疼痛、中樞性中風后疼痛、因多發性硬化產生的疼痛、因脊髓損傷產生 的疼痛或因帕金森病或癒痛產生的疼痛，
[0093] (i)癌癥疼痛，
[0094] (j)術后疼痛，
[0095] 化）內臟疼痛，包括消化道內臟疼痛和非消化道內臟疼痛，因胃腸(GI)素亂所致的 疼痛、因功能性腸病癥(FBD)產生的疼痛、因炎性腸病（IBD)產生的疼痛、因痛經、盆腔疼痛、 膀脫炎、間質性膀脫炎或膜腺炎產生的疼痛，
[0096] (1)肌肉骨骼疼痛、肌痛、纖維肌痛、脊柱炎、血清陰性(非類風濕性)關節病、非關 節風濕病、抗肌萎縮蛋白病、糖原分解、多發性肌炎、化脈性肌炎，
[0097] (m)屯、臟或血管疼痛、因屯、絞痛(angina)、屯、肌梗死、二尖瓣狹窄、屯、包炎、雷諾氏 現象、硬皮病(scleredoma)、硬皮病或骨骼肌局部缺血所致的疼痛，
[0098] (n)頭部疼痛，其包括偏頭痛、有先兆偏頭痛、無先兆偏頭痛、化集性頭痛、緊張型 頭痛。
[0099] (O) 口面疼痛，其包括牙疼痛、飄額肌筋膜疼痛或耳鳴，或
[0100] (P)背痛、滑囊炎(menstrual pain)、月經疼痛、偏頭痛、牽涉痛、蘭叉神經痛、超敏 (hypersensitisation)、因脊柱創傷和/或變性或腦卒中（stroke)產生的疼痛D
[0101] 疼痛的治療包括，但不限于，預防疼痛和/或疼痛癥狀、改善疼痛和/或疼痛癥狀、 控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發生率，或延遲疼痛和/或疼痛癥狀形 成或進展。
[0102] 根據本發明的另一方面，提供根據第一方面或第二方面或其優選實施方案的 p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或根據第蘭方面和第四方面的核酸分子或載體，其中P75NTR (NBP)-Fc融合蛋白或核酸分子或載體在組合中與第二藥理活性化合物組合時分別、依次或 同時使用。優選地，組合的第二藥理活性化合物可W包括但不限于：
[0103] ?阿片類鎮痛藥，例如嗎啡（morphine)、海洛因 （hero in)、氨嗎啡酬 (hydromorphone)、鞋嗎啡酬（OX ymorphone)、左啡諾（Ievorphanol)、左洛啡焼 (Ievallorphan)、美沙酬（methadone)、賊替晚（meperidine)、芬太尼（fentanyl)、可卡因 (cocaine)、可待因（codeine)、雙氨可待因（diihydrocodeine)、鞋考酬（0巧codone)、氨可酬 化y虹ocodone)、右丙氧芬（propo巧phene)、納美芬（nalmefene)、締丙嗎啡（nalorphine)、 納洛酬（naloxone)、納曲酬（naltrexone)、下丙諾啡（buprenoi'phine)、布托啡諾 (butorphanol)、納布啡(na化uphine)或噴他佐辛（pentazocine);
[0104] ?非醬體抗炎藥（NSAID)，例如阿司匹林、雙氯芬酸（diclofenac)、二氣尼柳 (diflusinal)、依托度酸（etodolac)、芬布芬（fenbufen)、非諾洛芬（fenoprofen)、氣苯柳 (fIufenisal)、氣比洛芬（flurbiprofen)、布洛芬（ibuprofen)、嘲噪美辛（indomethacin)、 酬洛芬（ketoprofen)、酬咯酸（ketorolac)、甲氯芬那酸（meclofenamic acid)、甲芬那酸 (mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、薰了美酬（nabumetone)、薰普生（naproxen)、尼 美舒利（nimesulide)、硝基氣比洛芬（nitrof Iurbiprofen)、奧沙控秦（olsalazine)、奧沙 普秦（oxaprozin)、保泰松（phenylbutazone)、f?羅昔康（piroxicam)、柳氮(6黃fI比晚 (sulfasalazine)、舒林酸（sulindac)、托美了（tolmetin)或佐美酸（zomepirac);
[010日]?己比妥類鎮靜劑，例如異戊己比妥（amobarbital)、阿普比妥（aprobarbital)、 仲下己比妥（butabarbital)、布他比妥(butabital)、甲苯比妥(mephobarbital)、美沙比妥 (me t harb i tal )、美索比妥（me thohexital)、戊己比妥（pentobarbital)、苯己比妥 (phenobai'tital)、司可己比妥（secobarbital)、他布比妥（ta化Utal)、塞米樂（theamylal) 或硫噴妥（thiopental);
[0106] ?具有鎮靜作用的苯二氮草（b e n Z O d i a Z e P i n e )，例如氯氮幕 (chlordiazepoxide)、氯控孽酉堇(CIorazepate)、地西泮(diaz邱am)、氣西泮(f Iurazepam)、 勞控西泮（Iorazepam)、奧沙西泮（oxazepam )、替馬西泮（temazepam)或SP坐侖 (triazolam);
[0107] ?具有鎮靜劑作用的Hi掉抗劑，例如苯海控明（diphenhydramine)、fl比控明 (pyrilamine)、異丙嗦（promethazine)、氯苯那敏（chIorpheniramine)或氯環利嗦 (chlorcyclizine);
[0108] ?鎮靜劑，如格魯米特（glutethimide )、甲丙氨醋（meprobamate )、甲唾酬 (methaqualone)^^^^if tk#(dichloralphenazone)；
[0109] ?骨骼肌松弛藥、例如己氯芬（baclofen)、卡立普多（carisoprodol)、氯P坐沙宗 (chlorzoxazone)、環苯扎林（cyclobenzaprine)、美索己莫(methocarbamol)或鄰甲苯海控 明（orphrenadine);
[0110] ? MWDA受體掉抗齊I」，例如右美沙芬（dextromethoi'phan) (( + )-3-H-N-甲基嗎啡 喃）或其代謝物右啡焼(dextrorphan)(( + )-3-H-N-甲基嗎啡喃）、氯胺酬(ketamine)、美金 巧Ij (memantine)、fl比咯并唾嘟奎寧（pyrroloquinoline quinine)、順-4-(麟醜甲基）-2-賊晚 簇酸、布地品（budipine)、EN-323UMorphiDex帶，嗎啡和右美沙芬（dextromethOTphan) 的組合制劑）、托化醋（topiramate)、奈控美生(neramexane)或培凈福太(perzinfotel)，包 括NR2B掉抗劑，例如艾芬地爾Qfe叩rodil)、曲索羅地(traxoprodil)或（-)-(R)-6-{2-[4-(3-氣苯基)-4-鞋-1-賊晚基]-1-?乙基-3,4-二氨-2(1H)-唾嘟酬；
[0111] ? Q-腎上腺素能藥，例如多沙蜂嗦（doxazosin)、坦索羅辛（tamsulosin)、可樂定 (clonidine)、脈法辛（guanfacine)、右美托咪定（dexmetatomidine)、莫達非尼 (111〇(13爭111。）、或4-氨基-6,7-二甲氧基-2-(5-甲焼-亞礦醜氨基-1，2,3,4-四氨異唾嘟-2-基)-5-(2-化晚基)唾蜂嘟；
[0112] ? S環抗憂郁藥，例如地昔帕明（desipramine)、丙米嗦（imipramine)、阿米替林 (amitriptyline)或去甲替林(nortriptyline);
[0113] ?抗驚厥藥，例如卡馬西平、控莫S嗦（lamotrigine)、托fI比醋（topiratmate)或丙 戊酸鹽（valproate);
[0114] ?速激版(NK)掉抗齊I」，特別地是NK-3、NK-2或NK-I掉抗劑，例如（aR，9R)-7-[3,5- 雙(S氣甲基）芐基]-8,9,10,11-四氨-9-甲基-5-(4-甲基苯基)-7H-[l，4]二氮雜環辛并 [2，1-容][1，7]-薰晚-6-13-二酬（了八1(-637)、5-[[(2民，35)-2-[(1民)-1-[3,5-雙(蘭氣甲基） 苯基]乙氧基-3-(4-氣苯基)-4-嗎嘟基]-甲基]-1,2-二氨-3H-1，2,4-SP坐-3-酬(MK-869)、 阿瑞化坦（aprepitant)、控奈匹坦（Ianepitant)、達匹坦（dapitant)或3-[ [2-甲氧基-5-(蘭氣甲氧基)苯基]-甲氨基]-2-苯基賊晚(2S，3S);
[011日]?毒葦堿掉抗劑，例如奧昔布寧（oxybutynin)、托特羅定（tolterodine)、丙賊維 林（propiverine)、曲司氯饋（tropsium chloride)、達非那新（darifenacin)、索利那辛 (soIifenacin)、替米維林（temiverine)和異丙托饋（ipratropium);
[0116] ?C0X-2選擇性抑制劑，例如塞來考昔（celecoxib)、羅非考昔（rofecoxib)、帕瑞 考昔（parecoxiLb)、伐地考昔（valdecoxib)、地控考昔（deracoxiib)、依托考昔（etoricoxib) 或魯米考昔（lumiracoxiLb);
[0117] ?煤焦油鎮痛藥，尤其樸熱息痛(paracetamol);
[0118] ?神經安定藥，如氣賊利多（droperidol)、氯丙嗦（chlorpromazine)、氣賊晚醇 (haloperidol)、奮乃靜（perphenazine)、硫利達嗦（thioridazine)、美索達嗦 (mesoridazine)、S氣控嗦（trifluoperazine)、氣奮乃靜（fIuphenazine)、氯氮平 (clozapine)、奧氮平（olanzapine)、利培酬（risperidone)、齊控西酬（Ziprasidone)、唾硫 平（quetiapine)、舍嘲噪（sertindole)、阿立賊 P坐（aripiprazole)、索奈賊 口坐 (sonepiprazole)、布南色林（blonanserin)、伊潘立酬（iloperidone)、贓羅匹隆 (perospirone)、雷氯必利（raclopride)、佐替平（ZOtepine)、聯苯蘆諾（bifeprunox)、阿塞 那平（asenapine)、魯拉西酬（Iuras idone)、氨橫必利（amisulpr ide)、己拉皮利酬 (balaperidone)、帕林朵（palindore)、依利色林（邱Iivanserin)、奧沙奈坦（osanetant)、 利莫納班(rimonabant)、美蘭納坦(mecline;rtant)、Miraxi〇n夠或沙立佐坦（sarizotan);
[0119] ?香草素受體(vanilloid receptor)激動劑（例如樹膠脂毒素(resinferatoxin) 或括抗劑（例如辣椒平（capsazepine));
[0120] ? 0-腎上腺素能藥如普糞洛爾（propranolol);
[0121 ] ?局部麻醉藥如美西律(mexiletine);
[0122] ?皮質類固醇如地塞米松（dexamethasone);
[012引 ? 5-HT受體激動劑或括抗劑，特別地5-HTiB/iD激動劑如依立曲坦(eletriptan)、舒 馬曲坦（sumatriptan)、那拉曲坦（naratriptan)、佐米曲坦（zolmihiptan)或利扎曲坦 (rizatriptan)；
[0124] ? 5-HT2A雙體括抗劑如R( + )-a-(2,3-二甲氧基-苯基)-1-[2-(4-氣苯乙基）]-4-贓 晚甲醇(MDk100 907);
[01巧]?膽堿能（煙堿)鎮痛藥，如異丙克蘭（ispronicline)(TC-1734)、化)-N-甲基-4-(3-化晚基)-3-下締-1-胺(RJR-2403)、（R)-5-(2-日丫下晚基甲氧基)-2-氯化晚(ABT-594)或 尼古下；
[0126] ?化巧多飯（Tramado愼）；
[0127] . PDEV抑制劑，如5-[2-乙氧基-5-(4-甲基-1-贓嗦基-橫酷基)苯基]-1-甲基-3-正丙基-1,6-二氨-7H-化挫并[4,3-d]喀晚-7-酬（西地那非（sildenafil))、（6R，12aR)-2， 3，6，7，12，12a-六氨-2-甲基-6-(3，4-亞甲二氧苯基)-化嗦并[2 '，1' ： 6，1 ]-化晚并[3，4-b ] 嗎隙-1,4-二酬（IC-351或他達拉非（tadalafil))、2-[2-乙氧基-5-(4-乙基-贓嗦-1-基-1-橫酷基）-苯基]-5-甲基-7-丙基-3H-咪挫并[5，1-門[1，2,4]立嗦-4-酬（伐地那非 (￥曰'(16]1曰門1))、5-(5-乙酷基-2-了氧基-3-11比晚基）-3-乙基-2-(1-乙基-3-日丫了晚基）-2, 6- 二氨-7H-化挫并[4,3-d]喀晚-7-酬、5-(5-乙酷基-2-丙氧基-3-化晚基)-3-乙基-2-(1-異丙基-3-日丫下晚基)-2,6-二氨-7H-化挫并[4,3-d]喀晚-7-酬、5-[2-乙氧基-5-(4-乙基贓 嗦-1-基橫酷基川比晚-3-基]-3-乙基-2-[2-甲氧乙基]-2,6-二氨-7H-化挫并[4,3-d]喀晚- 7- 酬、4-[(3-氯-4-甲氧芐基）氨基]-2-[(25)-2-(徑甲基川比咯燒-1-基]-N-(喀晚-2-基甲 基)喀晚-5-甲酯胺、3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6,7-二氨-IH-化挫并[4,3-d]喀晚-5-基)-N-[2-( 1-甲基[I比咯燒-2-基）乙基]-4-丙氧基苯橫酷胺；
[01 巧]?大麻素（cannabinoid);
[0129] ?促代謝型谷氨酸鹽亞型1受體(mGluRl)括抗劑；
[0130] ?血清素再吸收抑制劑，如舍曲林（sertraline)、舍曲林代謝物-去甲基舍曲林、 氣西汀（f Iuoxetine)、諾氣西汀（norf IuoxetineK氣西汀去甲基代謝物）、氣伏沙明 (fluvoxamine)、帕羅西汀(paroxetine)、西獻普蘭山;[1日109招111)、西獻普蘭代謝物-去甲基 西獻普蘭（(16311161：1171。；[1日10口抑111)、艾司西獻普蘭（63。；[1日10口^111)、(1,1-芬氣拉明（(1,1-fenfluramine)、非莫西汀（femoxetine)、伊福西汀（ifoxetine)、氯基度硫平 (cyanodothiepin)、利托西汀（Iitoxetine)、達泊西汀（dapoxetine)、奈法挫酬 (nefazodone)、西文氯胺（cericl amine)和曲挫酬（trazodone);去甲腎上腺素 (noradrenalineK去甲腎上腺素 （norepinephrine ))再吸收抑制劑，如馬普替林 (maprotiline)、洛非帕明（Iofepramine)、米氮平（mirtazepine)、徑丙替林 (oxaprotiline)、非挫拉明（fezolamine)、托莫西汀（tomoxetine)、米安色林(mianserin)、 安非他酬（buproprion)、安非他酬代謝物-?安非他酬化ydroxyb叫roprion)、諾米芬辛 (nomifensine)和維洛沙秦(ViIoxazine)( VivalaiT貨）、.特別地是選擇性去甲腎上腺素再 吸收抑制劑如瑞波西汀(reboxetine)、尤其(S，S)-瑞波西汀；
[0131] ?血清素-去甲腎上腺素再吸收雙重抑制劑，如文拉法辛（venlafaxine)、文拉法 辛代謝物O-去甲基文拉法辛（〇-desmethylvenlafaxine)、氯米帕明（clomipramine)、氯米 帕明代謝物-去甲基氯米帕明（desmethylclomipramine)、度洛西汀（duloxetine)、米那普 侖(milnacipran)和丙咪嗦（imipramine);
[0132] .誘導型一氧化氮合酶（iNOS)抑制劑，如S-[2-[(l-亞氨乙基)氨基]乙基]-心同 型半脫氨酸、S-[2-[(l-亞氨乙基)氨基]乙基]-4,4-二氧代半脫氨酸、S-[2-[(l-亞氨乙 基)氨基]乙基]-2-甲基-k半脫氨酸、（2S，5Z)-2-氨基-2-甲基-7-[(l-亞氨乙基)氨基]-5-庚締酸、2-[[(lR，3S)-3-氨基-4-徑-1-(5-嚷挫基）下基]硫代]-5-氯-3-化晚甲臘；2-[[(13,35)-3-氨基-4-徑-1-(5-嚷挫基)-下基]硫代]-4-氯苯臘、（25,41〇-2-氨基-4-[[2-氯-5-(S氣甲基）苯基]硫代]-5-嚷挫下醇、2-[[(13,35)-3-氨基-4-徑-1-(5-嚷挫基）下 基]硫代]-6-(S氣甲基)-3-化晚甲臘、2-[[(lR，3S)-3-氨基-4-徑-1-(5-嚷挫基）下基]硫 代]-5-氯苯臘、N-[4-[2-(3-氯節氨基）乙基]苯基]嚷吩-2-甲脈或脈基乙基二硫酸；
[0133] ?乙酷膽堿醋酶抑制劑，如多奈贓齊(donepezil);
[0134] ?前列腺素 E2亞型4(EP4)括抗劑，如N-[({2-[4-(2-乙基-4,6-二甲基-IH-咪挫并 [4,5-c]化晚-1-基）苯基]乙基}氨基）-幾基]-4-甲基苯橫酷胺或4-[(lS)-1-({[5-氯-2-(3-氣苯氧基川比晚-3-基]幾基}氨基）乙基]苯甲酸；
[0135] ?白S締 B4括抗劑;如1-(3-聯苯基-4-基甲基-4-?-苯并二氨化喃-7-基)-環戊 燒簇酸(CP-105696)、5-[2-(2-簇乙基)-3-[6-(4-甲氧苯基)-祀-己締基]氧苯氧基]-戊酸 (0N0-4057)或DPC-I1870，
[0136] ? 5-脂加氧酶抑制劑，如齊留通^11611*〇11)、6-[(3-氣-5-[4-甲氧基-3,4,5,6-四 氨-2H-化喃-4-基])苯氧甲基]-1-甲基-2-哇諾酬(ZD-2138)或2,3,5-S甲基-6-(3-化晚基 甲基）、1，4-苯釀(CV-6504);
[0137] ?鋼通道阻滯劑，如利多卡因（Iidocaine);或
[013引 ? 5-HT3括抗劑，如昂丹司瓊(ondansetron);
[0139] W及它們藥學上可接受的鹽和溶劑化物。
[0140] 根據本發明的又一個方面，提供一種治療、預防、緩解、控制、減少個體中疼痛形成 或進展或任何前述疼痛和/或疼痛癥狀的發生率或延遲疼痛形成或進展或任何前述疼痛 和/或疼痛癥狀的方法，所述方法包括向個體給藥有效量的根據第一方面或第二方面或其 優選實施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據第=方面和第四方面的核酸分子或載體。
[0141] 本發明適用于人類醫學和獸醫醫學領域。優選地，個體是哺乳動物，例如伴侶動物 如馬、貓或犬或家畜如羊、牛或豬。最優選地，個體是人。
[0142] 根據本發明的第八方面，提供一種用于治療、預防、緩解、控制、減少疼痛形成或進 展或任何前述疼痛和/或疼痛癥狀的發生率或延遲疼痛形成或進展或任何前述疼痛和/或 疼痛癥狀的組合物，所述組合物包含根據第一方面或第二方面或其優選實施方案的P75NTR (NBP)-Fc融合蛋白，或根據第S方面和第四方面的核酸分子或載體和藥學上可接受的載體 和/或賦形劑。
[0143] 優選地，制備根據第一方面或第二方面或其優選實施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白或根據第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物用于或適于口服、舌 下、頰部、局部、直腸、吸入、透皮、皮下、靜脈內、動脈內、肌內、屯、內、骨內、皮內、腹膜內、經 粘膜、陰道、玻璃體內、關節內、關節周、局部或皮內給藥。
[0144] 優選地，制備根據第一方面或第二方面或其優選實施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白、或根據第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物是用于或適 于疼痛發作之前和/或期間和/或之后給藥或用于或適于運類用途。
[0145] 優選地，制備根據第一方面或第二方面或其優選實施方案的p75NTR(NBP)-Fc或根 據第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物用于或適于每周1次至 7次之間給藥，進一步優選地每月1次至4次之間給藥、進一步優選地每6個月時間1次至6次 之間給藥，進一步優選地每年1次至12次給藥。優選地，將藥物意在或制備意在W包括但不 限于W下的時間外周地給藥:每日1次、每2、3、4、5或6日1次、每周1次、每2周1次、每3周1次、 每月1次、每2個月1次、每3個月1次、每4個月1次、每5個月1次、每6個月1次、每7個月1次、每8 個月1次、每9個月1次、每10個月1次、每11個月1次或每年1次。
[0146] 進一步優選地，將根據第一方面或第二方面或其優選實施方案的p75NTR(NBP)-Fc 融合蛋白或根據第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物意在或 制備意在通過包括但不限于W下的一個或多個途徑外周地給藥：口服、舌下、經頰地、局部、 直腸、通過吸入、經皮、皮下、靜脈內、動脈內或肌內、通過屯、內給藥、骨內、皮內、腹膜內、經 粘膜、陰道、玻璃體內、表皮、關節內、關節周或局部途徑。
[0147] 優選地，制備根據第一方面或第二方面或其優選實施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白，或根據第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物用于或適于 W約0.05mg/ml至約200mg/ml之間的濃度；優選地在W如下任一個濃度：約0.05mg/ml、 0.Img/ml、0.5mg/ml、Img/ml、5mg/ml、1Omg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、 85mg/ml、90mg/ml、95mg/ml、lOOmg/ml、IlOmg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、lSOmg/ ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml 或 200mg/ml+/-約 10 % 誤差，最優選地在獸醫 應用中W約3mg/ml及人類中Wo. Img/ml給藥。
[0148] 優選地，制備根據第一方面或第二方面或其優選實施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合 蛋白或根據第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物用于或適于 W約0 . Img/kg至約200mg/kg體重之間的濃度;優選地在W如下任一個濃度：約0.5mg/kg、 Img/kg、5mg/kg、lOmg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/ kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、7〇mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、 95mg/kg、lOOmg/kg、11Omg/kg、120mg/kg、130mg/kg、140mg/kg、150mg/kg、160mg/kg、170mg/ kg、180mg/kg、190mg/kg或約200mg/kg體重+/-約10 %誤差，最優選地在獸醫應用中W約 lOmg/kg及人類中Wo. 3mg/kg給藥。
[0149 ]根據本發明的第九方面，提供一種試劑盒，其包含：
[0150] (a)根據第一方面或第二方面或其優選實施方案的p75NTR(NBP)-化融合蛋白，或 根據第=方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥物組合物;和
[0151] (b)針對W下任一種或多種情況向個體給藥有效量的所述p75NTR(NBP)-Fc融合蛋 白、核酸分子、載體或藥物組合物的說明書:預防或治療疼痛和/或疼痛癥狀或用于緩解疼 痛和/或疼痛癥狀、控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發生率，或延遲疼 痛和/或疼痛癥狀形成或進展。
[0152] 該試劑盒可W包含一個或多個容器，所述容器含有本文所述的p75NTR(NBP)-Fc融 合蛋白、核酸、載體或藥物組合物，和根據本發明任何方法和用途的使用說明書。試劑盒還 可W包含選擇適于治療的個體的描述，所述選擇基于鑒定該個體是否具有疼痛或疼痛癥狀 或面臨具有運種疼痛或疼痛癥狀的風險。用于給藥藥物組合物的說明書可W包含信息，如 關于預期治療的劑量、給藥方案和給藥途徑。
[0153] 根據本發明的又一個方面，提供根據第一方面或第二方面或其優選實施方案的 p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據第S方面和第四方面的核酸分子或載體或第八方面的藥 物組合物用于W下任一種或多種情況:預防或治療病狀或病狀的癥狀或緩解該病狀或該病 狀的癥狀、控制該病狀或該病狀的癥狀、減少該病狀或該病狀的癥狀發生率，或延遲該病狀 或該病狀的癥狀形成或進展，所述病狀與神經營養因子NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5的任一種或 多種相關。
[0154] -NGF(神經生長因子）與至少兩類受體P75NTR和化kA(-種參與軸突生長、支化和 伸長的跨膜酪氨酸激酶)結合。與NGF相關的病狀和癥狀是已知的。NGF在炎性病癥和疼痛中 表達并與之相關[蛋白質序列NP_002497.2，NP_038637]。另外，已經顯示NGF在許多屯、血管 疾病如冠狀動脈粥樣硬化、肥胖癥、2型糖尿病和代謝綜合征中W及在多發性硬化中發揮作 用。降低的NGF血漿水平（W及另外降低的抓NF血漿水平）已經與急性冠狀動脈綜合征和代 謝綜合征相關。NGF還與各種精神病癥相關，如癡呆、抑郁、精神分裂癥、孤獨癥、Rett綜合 征、神經性厭食和神經性貪食，并且還已經設及阿爾茨海默病和神經變性病的形成。還已經 顯示NGF加速傷口愈合，并且存在它可W用于治療皮膚潰瘍和角膜潰瘍的證據，已經顯示它 減少神經變性并在大鼠中促進外周神經再生。
[01W] -m)NF(腦衍生神經營養因子)是在神經系統發育期間支持神經元存活和生長的神 經營養因子[蛋白質序列肥_001137277.1、肥_001041604]。抓^結合細胞表面受體化48和 P75NTR并且還調節a-7煙酸受體的活性。與抓NF相關的病狀和癥狀是已知的。已經顯示抓NF 在生理疼痛和病理疼痛傳遞方面、特別在其中發現BDNF合成大大增加的急性疼痛、炎性疼 痛和神經性疼痛的模型中發揮重要作用;還已經顯示抓NF在慢性疼痛病狀W及其他病狀如 濕疹和銀屑病中上調。在抑郁、精神分裂癥、強迫性障礙、阿爾茨海默病、亨廷頓病病、Rett 綜合征和癡呆W及神經性厭食和神經性貪食中觀察到BDNF的下調。
[0156]-神經營養因子-4(NT-4)，也稱作神經營養因子-5(NT-5)，是優勢地經P75NTR受體 和化kB受體傳導信號并促進外周感覺交感神經神經元存活的神經營養因子。運種蛋白質的 成熟膚在檢查過的全部哺乳動物（包含人、豬、大鼠和小鼠）中是相同的[蛋白質序列NP_ 006170，NP_937833LNT-4大多由背根神經節(DRG)的神經元和椎旁和椎前交感神經節、脊 髓背角和腹角中的那些神經元合成，并且發現在許多組織（包括前列腺、胸腺、胎盤和骨骼 肌）中表達。與NT-4/5相關的病狀和癥狀是已知的。NT4/5中的缺陷與原發性開角型青光眼 的易患性相關。還已經顯示神經營養因子子4有助于乳腺癌細胞存活并且是抑制腫瘤生長 的祀。NT-4/5已知參與疼痛-信號傳導系統，如傷害性疼痛，還在皮膚慢性炎性病癥中觀察 到NT-4/5的上調，如皮炎、濕疹、異位性皮炎的癢疹病灶。在阿爾茨海默病、亨廷頓病病中觀 察到NT-4/5的下調。
[0157] -神經營養因子-3(NT-3)，是結構上與0-NGF、抓NF和NT-4相關并控制哺乳動物神 經元存活和分化及成體神經系統維持的神經營養因子，并且在人胎盤中表達時可W影響胚 胎中神經元的發育。與NT3相關的病狀和癥狀是已知的。通過基因打祀產生的NTF3-缺陷小 鼠顯示嚴重的肢體運動缺陷。NT-3通過化k受體進行信號傳導并促進神經和神經膠質細胞 的生長和存活[蛋白質序列NP_001096124.1和NP_032768]。人、小鼠和大鼠 NT-3的氨基酸序 列相同。已知NT3及其同族受體，酪氨酸激酶C(TrkC),調節神經性疼痛和傷害性疼痛和傷害 感受及本體感受機制，例如NT3表達在神經病理動物的小DRG細胞中增加。NT3表達還與神經 病如糖尿病性多發性神經病和HIV相關性神經病、大纖維神經病(包括萎縮)相關，它還參與 痛覺過敏(通常有害的刺激的闊值下降）、異常性疼痛(無害刺激變得有害）和自發性疼痛 (明顯缺乏刺激的情況下疼痛）的形成并且是肌肉疼痛的已知調節物。
[0158] 現在將參W下實施例描述本發明，其中提供所述實施例W說明而非限制本發明。 實施例
[0159] p75NTR-Fc序列的免疫原性計算機檢驗（In silico immunogenixy testing)
[0160] 目前利用重組DNA技術產生廣泛類型的生物藥物，包括新類別的基于單克隆抗體 (HiAb)的Fc(可結晶片段）的多功能治療性融合蛋白化Uang 2009生物技術新觀點（Curr Opin Biotechnol)，20(6)，692-9)。治療性蛋白與化結構域融合通過兩種不同方式延長分 子的血清半壽期，增強生物制藥的總體治療作用。首先，通過pH依賴的新生Fc受體(Fe化)結 合作用，再循環性Fc-融合物減少治療性蛋白在內體中的降解。其次，相對治療性分子，通過 添加 Fc-結構域和通過化-介導的與治療性蛋白二聚化增加分子大小有助于限制腎清除作 用。
[0161] 可W通過將兩個或更多個結構域直接連接在一起產生融合蛋白。但是，運可能在 所得的融合蛋白中導致不利的分子特性，如受損的生物活性(Bai等人，2005美國科學院院 刊（Proc.化tl. Acad. Sci.) 102 7292-7296)、蛋白質錯誤折疊（Zhao等人，2008蛋白質表達 和純化（Protein Expr. Purif . )61 ,73-77)或低產率（Amet等人，2009制藥研究 (Pharm. ReS.) 26，523-528)。可W在結構域之間插入接頭序列W解決運些潛在問題，但是必 須考慮幾種因素 W選出適宜的接頭。首先，接頭必須反映融合蛋白內部結構域的總體預期 功能。在一些情況下，結構域必須獨立地發揮作用，因此需要接頭柔性。相反，如果將結構域 固定，則可能需要剛性接頭。第二，接頭不得通過翻譯后修飾(PTM)向融合蛋白引入任何不 想要的官能性。最后，必須考慮接頭和接頭旁側區域的潛在免疫原性，因為接頭可W是不天 然存在于人體中的從頭設計序列。
[0162] 大部分治療性蛋白不同程度地具有免疫原性(Van Walle等人，2007生物治療專家 意見化邱ert Opin Biol Ilier. )7(3):405-18,Stas等人，2009抗體療法的免疫原性評價 (Immunogenicity assessment of antibody therapeutics.)劍橋大學出片反社（Cambridge University Press)，劍橋）并且甚至所謂全人類抗體治療藥可能含有免疫原性區域 化arding等人，2010單克隆抗體(MAbs. )2,256-265)。免疫原性是誘導Th(輔助T細胞(T-helper))反應的能力，其中獨特T細胞受體識別與抗原呈遞細胞上展示的HLA II類分子結 合的膚時，所述反應觸發。膚從抗原呈遞細胞內化的蛋白質生成，所述蛋白質隨后通過內體 切割途徑加工。僅對HLA II類分子具有足夠親和力的膚將呈遞在細胞表面上，并且或許可 能觸發化反應。
[0163] 因此，可W通過移除Th表位降低免疫原性潛力，一個稱作去免疫化的過程 (化amberlain 2002監管評估（The RegulatoiT Review)5,4-9!Baker和Jones2007藥物發 現和發現的新觀點（化rr.Opin Drug Discov.Devel. )10,219-227)。運通過W下方式實現： 預測治療性蛋白中的哪些膚可W與HLA II類分子結合并隨后引入置換消除或減少膚對HLA II類分子的結合親和力。
[0164] 存在幾個化A II類基因并且幾乎均具有高度多態性。另外，HLA II類分子由a和0 鏈組成，所述鏈各自衍生自不同基因，所述基因連同內在多態性一起進一步增加變異。具體 而言，每位個體表達基因：DRA/DRB、DQA/DQB和DPA/DPB。運些基因當中，僅DRA無多態性。此 外，'第二'DRB基因（DRB3、DRB4或DRB5)也可W是存在的，其產物也與DRA鏈結合。
[0165] 去免疫化期間，重點在于DR同種異型，已知W比DQ和DP更高的水平表達化aupeze 等人，1999 人類免疫學化 um. Immunol. )60,591-597, Gansbacher 和 Zier 1988 細胞免疫學 (Cell Immunol. )117,22-34，Berdoz等人，1987免疫學雜志（J.Immunol. )139，1336-1341， SUmz等人，1989免疫學雜志（J. Immunol. )143,3081-3086) eDR同種異型通常通過DRB基因 提到，因為DRA基因保持恒定，例如DRBl *01:01，其中數字是等位基因特異的。
[0166] 個體表位的嚴重性評定基于混雜標準，即與特定表位結合的HLA同種異型的數目， W及群體中同種異型的重要性(頻率)和HLA:膚復合物結合強度的定性評定。由于已經選擇 個體的T細胞群體不識別'自身膚'，所W可能篩選正在對下述膚去免疫化的蛋白質，所述膚 對應于正常情況下不應當誘導化反應的（已知）自身膚。盡管不知道哪些內源蛋白在T細胞 成熟期間內化并且因此產生自身膚，但是抗體屬于運些內源蛋白化irschmann等人，1995免 疫學雜志（J. Immunol.) 155,5655-5662,Verreck等人，1996免疫遺傳學（Immunogenetics) 43，392-397，化rding等人，2010單克隆抗體(MAbs.) 2，256-265)。
[0167] P75-NTR Fc-融合蛋白設計
[0168] P75-NTR Fc-融合蛋白的化部分的特定同種異型是IgG pCon載體IgGza(見上文）。
[0169] P75-NTR Fc-融合蛋白的設計按幾個階段推進：
[0170] ?確定化-融合蛋白中待使用的P75-NTR序列的確切結構。考慮幾種因素，包括：
[0171] Dp75-NTR Fc-融合物應當能夠結合幾種神經營養因子，至少包括NGF、抓NF、NT-3 和NT-4;必須在P75-NTR Fe-融合蛋白中保留柔性。
[0172] 。不想要的a-分泌酶切割位點存在于p75-NTR-Fc(SEQ ID N0.1)上的胞外結構域 中，運些切割位點必須從該序列移除，因為它們將受到切割并且因此減少p75-化產物在體 內的生物學活性和PK譜(PK profile)。原始的p75-Fc產物(參見SEQ ID NO. 1)含有a-分泌 酶切割位點并且與SEQ ID NO.3相比，半壽期和生物學活性（PK/PD)因此顯著減少（見下 文)。
[0173] 鑒定了適用于P75-NTR Fc-融合蛋白中連接胞外P75-NTR結構域和化的適宜實證 性接頭。排除了含有可能潛在參與翻譯后修飾(PTM)的位點的接頭序列。
[0174] 使用具有化區的適宜部分的所確定的P75-NTR構建體，使用不同的潛在接頭序列， W計算機方式構建P75-NTR Fc-融合蛋白的幾種變體。嘗試P75-NTR胞外結構域C末端、Fc較 鏈區和潛在接頭的結構建模和分析(參見表1)。
[0175] 使用化ibase?，對具有不同接頭序列的變體篩選潛在化表位。
[0176] 基于預測的免疫原性風險，提出表達的序列3p75-NTR Fc-融合蛋白（SEQ ID NO.3)。
[0177] Fc-融合蛋白序列分析
[0178] 13種目前可用的治療性Fc-融合蛋白的蛋白質序列從美國采用名稱化SAN)網址獲 得化ttp://www.曰m曰-曰ssn.org/曰m曰/pub/physici曰n-resources/medic曰l-science/)。在可 能的情況下，將蛋白質序列交叉參比并且相對于其他在線資源（如在線專利信息網址)檢 查。使用在線資源，研究級Fc-融合蛋白的蛋白質序列從其他商業供應商獲得。
[0179] 為了鑒定衍生多種化-融合蛋白的推定性親本序列，使用MAFFT，將化-融合蛋白序 列與自有Lonza IgG pCon載體的翻譯蛋白質產物比對化atoh等人,2002核酸研究(Nucleic Acids Res. )30,3059-3066)。比對的化-融合蛋白序列隨后在其中化-融合物開始匹配IgG 序列的位置處截短。為了確定IgG序列在何處開始，使用=個連續IgG殘基標準。
[0180]使用無 IgG序列的截短型Fc-融合蛋白序列，進行加 iprot數據庫（UniProt協會 (The UniProt Consodium) ,UniProt發布2012-09-0ct3,2012)自有副本的Blast檢索 (Altschul等人，1997核酸研究(Nucleic Acids Res. )253389-3402)，W鑒定匹配最接近的 蛋白質序列。每個Fc-融合蛋白序列隨后針對化iprot數據庫中存在的匹配最接近的序列和 匹配最接近的Lonza IgG pCon序列手工再比。隨后提取融合配偶體和化區之間的交界并且 產生兩個集合，一個集合針對13種治療性Fc-融合蛋白和一個結合針對市售Fc-融合蛋白。 隨后從運兩個集合限定接頭區域。
[0181] 市售化-融合蛋白序列集合隨后在其中相對于匹配最接近的Lonza IgG pCon序列 找到序列同一性的N末端位置處截短。隨后分選截短的序列并且生成無冗余序列集合。
[0182] Epibase?免疫概況分析
[0183] 使用Global集合中的85個HLA II類同種異型，對化-融合蛋白變體進行化ibase? 免疫概況分析。
[0184] 僅使用HLA結合作用預測，就免疫原性風險比較Fc-融合蛋白變體是非常困難的。 運是因為幾個重要因素未考慮：
[0185] ..結合膚可能不由加工裝置生成并且因此它將從未作為膚-HLA復合物由抗原 呈遞細胞暴露于化細胞。
[0186] ??膚-HLA復合物可能不被化細胞識別。
[0187] 鑒于運些考慮，可W使用化化ase?免疫概況分析在變體序列之間進行S個類型的 定量比較。首先，可W比較DRBl、DRB3/4/5、DQ和DP同種異型集合中每個集合的關鍵表位數 目，其中與相同組的多個同種異型結合的膚計為一個。運種表位計數顯示，每個集合內部獨 特表位的數目和變體之間的差異掲示完全移除或添加潛在化表位。
[0188] 由于許多表位，尤其雜亂表位，結合多個同種異型，獨特化表位計數的變化可能模 糊變體間免疫原性潛力的實際減少或增加。因此，第二定量比較是在全部化表位范圍內每 個HLA同種異型水平上，其中變體的每種同種異型的結合膚計數，連同血清型和群體頻率一 起，允許在血清型水平或同種異型水平比較。其=，表達最差情況下免疫原性風險的近似評 分可W如下計算：
[0189] 評分=I：(表位計數X同種異型頻率）
[0190] 從預測與給定同種異型結合的表位的數目和受影響同種異型的等位基因頻率計 算每個受影響同種異型的乘積。本研究中使用的全部受影響DRBl、DRB3/4/5、DQ和DP同種異 型的乘積。應當指出個體同種異型評分不是借此測量免疫原性風險的絕對度量，因為應當 考慮全部選擇的HFA同種異型(01?81、01^3/4/5、09和0口）。
[0191] 認為人抗體種系序列（如衍生自Lonza pCon IgG化的那些)無免疫原性，因為它 們存在于呈遞給人免疫系統的循環型抗體池中并且可W視為自身膚。類似地，認為P75-NTR 內在地無免疫原性，因為它在人體中天然表達。因此，從展示的計數評分和免疫原性評分排 除因完全從人抗體種系序列或從P75-NTR衍生的膚產生的關鍵表位。
[0192] 結構建模
[0193] 使用Lonza的建模平臺，生成所提出的P75-NTR Fc-融合蛋白的結構模型。基于其 序列同一性，W及模板結構的定性結晶學量值，如分辨率m埃(A)計），將P75-NTR和化部 分的候選結構性模板片段評分、排序并且從自有抗體數據庫和蛋白質數據庫(PDB)選出。
[0194] 生成結構性模板片段與P75-NTR Fc-融合蛋白的序列比對結果。模板片段連同序 列比對結果由MODEF陽R(Sal等人，1993分子生物學雜志（J.Mol. Biol )234,779-815)處理。 運個方案產生從所比對的結構性模板集合導出的構象性約束。通過共輛梯度法和模擬退火 優化法產生滿足運些約束的全體結構。基于衍生自蛋白結構評分的能量評分和滿足構象約 束，從運個全體選出一個或多個模型結構。檢查模型并且使用側鏈優化算法，將祀和模板之 間差異的位置的側鏈優化并使能量最小化。一套可視化和計算工具用來評估各結構的構象 變異性，W及結構域的核屯、堆積和局部堆積W選擇一個或多個優選的模型。
[01M] P75-NTR Fc-融合蛋白設計
[0196] 設計了P75-NTR Fc-融合蛋白的S個接頭變體。鑒于嘗試在最終Fc-融合蛋白中 P75-NTR區域內保留柔性的設計約束因素和避開不利的a分泌酶和丫分泌酶切割位點的要 求，將胞外P75-NTR序列在位置G237處截短。原始P75NTR-FC序列1 (SEQ ID NO. 1)在位置 A250處截短。已經在P75-NTR的胞外部分中位置241-242和位置244-245之間鑒定到a分泌酶 切割位點（Zampieri等人，2005生物化學雜志（J Biol化em)280,14563-71)并且已經通過 位置282的區域內的序列同源性推斷出一個推定性丫分泌酶切割位點。從序列1的PK/PD顯 而易見，與序列3(SEQ ID NO.3)相比，序列USEQ ID NO. 1)的PK和生物學活性顯著減少。從 運些實驗得出結論，a分泌酶位點和丫分泌酶位點促成體內活性減少。
[0197] 為變體所選擇的接頭的關鍵要求是Fc-融合蛋白中允許融合配偶體的柔性W避免 引入能夠造成PTM的任何殘基并維持低免疫原性風險。
[019引存在兩類可用于連接P75-NTR至Fc恒定區的接頭，實證性接頭和衍生自天然蛋白 質的接頭。衍生自天然蛋白質的接頭可能引入能夠造成不利PTM的位點并且歸因于其性質， 可能具有更大的引入免疫原性的風險。出于運些原因，期待對實證性接頭進一步研究并且 可W將它們廣義地劃分為柔性或剛性。下文列出重復單元實證性接頭的序列，連同它們的 柔性分類：
[0199] ? (G4S)廣柔性
[0200] ? Gx-柔性
[0201] ? A(EAAAK)XA-剛性(SEQ ID NO. 14)
[020^ ? (PA)X-剛性
[0203] 鑒于需要柔性W確保與最終Fc-融合蛋白中的多個神經營養性配體（至少包括 NGF、抓NF、NT3和NT4)結合，僅考慮柔性接頭。
[0204] 基于運些考慮，構建=種變體:一種使用聚甘氨酸接頭的變體和兩種使用四甘氨 酸絲氨酸接頭的變體。變體均將原始P75-NTR序列中的G209(表達的蛋白質，參見序列3(SEQ ID NO. 3))視為接頭序列的部分。此外，變體在與原始P75-NTR Fe-融合蛋白序列USEQ ID NO. 1)中位置222等同的位置含有半脫氨酸至絲氨酸突變。圖5中顯示變體的接頭區域。
[0205] 使用化化ase?，分析圖1中所示的每種變體和其余序列的免疫原性潛力。下文在表 1中顯示影響Global集合中85種HLA II類同種異型的關鍵表位的預測免疫原性評分。另外， 表1中還顯示受非關鍵表位影響的同種異型的數目信息。
[0206] 表1:總結計算的關鍵表位評分
[0207]
[0208] 基于預測的免疫原性和缺少能夠PTM的任何位點，變體l(p75_Fc_G4xl)具有S種 變體的最佳特征并且產生W便體內檢驗。
[0209] 序列 1(沈Q ID N0.1)和序列3(沈Q ID N0.3)p75NTR-Fc對NGF的親和力
[0210] Biacore忍片W其中蛋白A胺法偶聯于流動小室1和2的實驗制備。測量與捕獲的 p75-Fc結合的NGF的單循環動力學。
[0211] 忍片表面的結合容量(Rmax)取決于配體(融合蛋白）的固定化水平。對于動力學研 究，建議50RU-100RU的Rmax。通過使用p75-Fc和NGF的分子量，可W計算融合蛋白的所需固定 水平。
[0212] Rmax= (NGF分子量/融合蛋白分子量)x固定化水平X化學計量比率:50 = (13,500/ 102,000)x固定化水平XI。
[0213] 因此，要求的固定化水平=(102,000/13,500)x 50 = 378RU。在單一循環動力學之 前，將序列USEQ ID N0.1)和序列3(SEQ ID N0.3)p75NTR-化和NTR-化固定在蛋白A忍片 上。
[0214]使用手工運行，序列化75-Fc(SEQ ID NO.3)捕獲到蛋白A忍片的流動小室2上直至 約380抓的所需水平實現。運個過程用22秒注射W流速IOiil/分鐘和序列化75-Fc(SEQ ID N0.3)濃度10iig/ml進行，運導致418RU融合蛋白捕獲到蛋白A表面上。
[0別引在第一種情況下，現聯lOnM、5nM、2.5nM、1.25nM和0.625nM的NGF濃度。測試運些濃 度，因為融合蛋白的Kd近似處于運個NGF濃度范圍內部。
[0216] 單一循環動力學方法設及：
[0217] -W30iil/分鐘注射0.625nM NG巧禍獲的p75-Fc上持續120秒 [0別引-隨后W1.25nM，隨后2.5nM、5nM和IOnM注射NGF，重復運個過程
[0219] -在已經注射NGF終濃度后，通過使運行緩沖液化BS-EP)在忍片流過，進行600秒解 離相。
[0220] 一旦完成，通過按30iil/分鐘注射IOmM甘氨酸HCl，pH2持續60秒，使忍片再生恢復 其蛋白A表面。
[0221] 隨后通過按流速IOiil/分鐘WlOiig/ml濃度注射38秒，將序列USEQ ID N0.1)p75-Fc捕獲到忍片上。運實現430RU所需水平。隨后重復上文描述的單一循環動力學法。
[0222] 數據分析
[0223] 按W下方式使用Biacore T200評價軟件VI，分析融合蛋白-NGF結合數據：
[0224] -記錄NGF與流動小室2上的融合蛋白結合(Fe = 2)和NGF在對照流動小室1上流過 (Fc = I;單獨的蛋白A)的數據。
[0。引-來自化=1的數據隨后從化=2扣除W產生"2-r結合數據。
[0226] -隨后從全部2-1結合數據扣除注射OnM(單獨的皿S-EP運行緩沖液)時2-1結合數 據W控制整個實驗期間基線的任何漂移。
[0227] -最后，數據則擬合于1:1結合模型W計算結合特征，包括結合速率化a)、解離速率 化d)和親和力化D)。
[022引-
[0229] 與捕獲的序列1(沈Q ID N0.1)和序列3(沈Q ID N0.3)p75-Fc融合蛋白結合的NGF 的單一循環動力學數據
[0230] 兩種融合蛋白與NGF的結合特征均是400pM(SEQ ID N0.1)和360pM(SEQ ID NO. 3)。從運些研究顯而易見，序列3(SEQ ID NO. 3)對NGF具有比序列USEQ ID NO. 1)更大 的親和力。
[0231] 序列1(沈Q ID N0.1)和序列3(沈Q ID N0.3)p75NTR-Fc的體內藥物代謝動力學
[0232] 運項研究中使用抵達時重120g-150g的雄性Wistar大鼠（來自英國查爾斯河 (化arles River UK))。每只動物在抵達時受到檢查并且外觀顯得健康。將它們隨機分配至 兩個籠子之一并且按尾上印記的刺青，對每只大鼠分配一個獨特識別編號。在第0日啟動研 究前，動物適應于動物設施至少10天。
[0233] 一旦大鼠已經適應其環境，則將它們轉移至其中實施全部體內流程的儲藏室/流 程室。如1986年內政部動物（科學流程）法案（Home Office Animals(Scientific ProceduresMct)中推薦，通過設定成產生12小時光照-黑暗循環(07:00開燈，19:00關燈） 的巧光燈，對動物給予照明。調節各房間的空氣并且常規測量空氣溫度(2rc+/-2°c)和相 對濕度。
[0234] 大鼠采食照射的膳食(科學的動物食品與工程學(Scientific Animal Food and 化gineering)，Augy，法國）并且整個研究期間可隨意獲得高壓滅菌水。檢查每個批次的膳 食并且常規篩查組成和污染物。將筑窩材料和籠子高壓滅菌并且每個籠子獨立通風（IVC系 統)。
[0235] 研究如此設計，從而存在如表2中所概述的5個處理組。
[0236] 表2:處理組
[0238] 在第2、4、6、8、12和15日在大致相同的時間（早10點-11:30點），從大鼠尾靜脈取得 血液樣品并制備血漿。
[0239] 從尾靜脈對血液采樣
[0240] 將大鼠置于設定在38°C的加溫盒中持續最少5分鐘但不超過10分鐘，W引起尾靜 脈血管舒張并且促進出血。將大鼠束縛于適宜的大小限位器(restrainer)中，使用無菌23 號針頭穿刺尾靜脈并且允許血液流入CB300微量采血管(Sarste化16，444)。在全部時間點 從每只大鼠采集最少I(K)山和最多30化1的血液。選擇不同部位W反復采樣并且大鼠在整個 手術期間平靜。大鼠良好耐受反復血液采樣，無渺紫跡象。采集的血液用來制備血漿。
[0241] 來自屯、臟的最終血液樣品
[0242] 在異氣燒麻醉藥作用下通過屯、臟穿刺，用Terumo Iml注射器和23號針頭取得最終 血液樣品（termina 1 b 1 ood samp 1 eS)。隨后通過頸椎脫白法處死動物。采集的血液用來制 備血清。
[0243] 血漿制備
[0244] 將含有來自尾靜脈的血液的微量采血管溫和地顛倒幾次W確保與抗凝血劑(鐘-EDTA)良好混合。采血管隨后置于冰上，之后W2700X g離屯、10分鐘，并且將血漿等分入聚丙 締管(每個時間點每只動物兩份等分試樣，例外是在第2日，此時僅制備一個等分試樣）。全 部血漿樣品立即冷凍并膽存在-80°C直至需要。
[0245] 血清制備
[0246] 允許在第15日通過屯、臟穿刺采集的血液在室溫在聚丙締管中凝固2小時至3小時 (最長3小時）。隨后將凝固的血液W4000X g離屯、5分鐘并且將血清等分到聚丙締管(每只動 物兩份等分試樣）。血清樣品立即冷凍并膽存在-80°C。
[0247] 血漿p75NTR-Fc的測定
[0248] 使用針對p75NTR(R&D Systems)和IgGlFc ELISA(R&D Systems)的改良化ISA作為 確定完整P75NTR-FC總血漿濃度的手段，測量血漿P75NTR-FC。
[0249] 測定序列1(沈Q ID N0.1)和序列3(沈Q ID N0.3)p75NTR-Fc的藥物代謝動力學。
[0巧0]
["i-u I J 二口 k巴
[0巧2] 與序列3(沈9 10側.3)相比，通過移除序列1(沈9 10側.1)975饑'1?斗(3的〇分泌酶 切割位點和丫分泌酶切割位點，則顯著地改善P75NTR-FC的PK及隨后改善效力，如慢性治療 后通過疼痛評分所評估。序列1 (SEQ ID NO. 1 )p75NTR-Fc的a分泌酶切割位點和丫分泌酶切 割位點使得運種化合物不適合作為治療疼痛和與神經營養因子生物學有關的其他病變(例 如呼吸道疾病)的體內藥物。
[0巧3] 序列3(569 10^.3)是穩定的，與序列1(569 10^.1)相比，具有改善的?1(/抑特 征和更大的神經營養因子親和力。
[0254] ?75饑'3斗。(沈9 10備.3)有鎮痛性。
[0巧5] 運項研究的目的是研究口75卿3斗(3(569 10顯.3)長期暴露對大鼠中艦乙酸單鋼 (MIA)所致骨關節炎(OA)的疼痛效力的影響。
[0256] 先前，我們還已經證實，可W通過使用雙足平衡測痛儀（incapacitance tester) 測量靜態承重進行自發性疼痛的評定并且運種與膝部組織病理學相關。使用疼痛新治療藥 的臨床前研究已經因其引起數據偏倚的能力受到批評。為了解決運個問題，隨機選擇左膝 和右膝用于誘導0A，并且因每日執行體內任務的全部操作員不知道每個膝部的狀態。一般 從文獻得知，OA的誘導僅在右膝實施，但是在此前研究中，我們發現無論使用什么時間點或 MIA劑量，在左膝與右膝中誘導OA之間無恒定差異。
[0巧7] MIA的制備
[0258] 按0.3mg/50]il ETF-PBS(用于每次關節內注射的體積）制備MIA，運等同于6mg/ml 母液。稱量出302mg MIA并溶解于中50.3ml ETF-PBS。提前一天制備MIA并且避光膽存在4°C 直至需要。
[0巧9] 動物
[0260]運項研究中使用抵達時重110g-130g的44只雄性Wistar大鼠（來自英國查爾斯 河）。每只動物在抵達時受到檢查并且外觀顯得健康。將它們隨機分配至兩個籠子之一并且 按尾上的刺青，對每只大鼠分配一個獨特識別編號。在第0日啟動研究前，動物適應于動物 設施至少10天。一旦大鼠已經適應其環境，則將它們轉移至其中實施全部體內流程的儲藏 室/流程室。如1986年內政部動物(科學流程)法案中推薦，通過設定成產生12小時光照-黑 暗循環(07:00開燈，19:00關燈)的巧光燈，對動物給予照明。調節各房間的空氣并且常規測 量空氣溫度(2 rc+/-2 °C)和相對濕度。
[0261] 大鼠采食照射的膳食(科學的動物食品與工程學，Augy,法國）并且可隨意獲得高 壓滅菌水。檢查每個批次的膳食并且常規篩查組成和污染物。將筑窩材料和籠子高壓滅菌 并且每個籠子獨立通風（IVC系統）。
[0262] 實驗設計
[0263] 研究如此設計，從而存在5組動物:對照人抗體(n = 6)、0.3mg/kg P75NTR-FC (SEQ ID N0.3)、lmg/kg p75NTR-Fc(沈Q ID N0.3)、3mg/kg p75NTR-Fc(沈Q ID N0.3)和3mg/kg PG-007(輝瑞他尼珠單抗(Tanezumab)的生物仿制藥抗NGF抗體）。
[0264] 每5天通過皮下注射給藥抗體和975饑'3斗(3(5日9 10^.3)，持續25天。
[0265] 在第-2日清晨，測量體重和從尾靜脈取得基線血液樣品。在大致相同的時間，在 第-1日，測量基線靜態承重。在第0日，再次在大致相同的時間，將全部大鼠用相應的抗體或 P75NTR-FC融合蛋白處理。S小時后，向全部動物給予關節內注射0.3mg MIA至一個膝部 化TF-PBS注入對側膝部）。
[0%6] 處理的隨機化
[0267] 在啟動本研究之前，將大鼠稱重并且每個籠兩只大鼠隨機分配至處理組，從而每 個組中動物的平均體重大致相等。除每只大鼠分配特定處理組之外，還實施進一步隨機化， 從而將每只大鼠的左膝或右膝用MIA注射(來自每只大鼠的對側膝部用ETFPBS注射）。使用 Mac用微軟Excel (版本14.1.1)中的隨機數字發生器生成處理組分配和每只大鼠的哪個膝 部接受治療。不接觸動物的員工實施隨機化流程和分配。
[0268] 對每只動物標記兩個7ml聚丙締小瓶W指示左膝或右膝（總計88個小瓶）。兩個人 (一個人評定并檢查主要隨機化工作薄并且一個人等分關節內注射用溶液)準備運88個小 瓶。等分過程依次實施，從而首先灌裝MIA小瓶，接著剩下的小瓶用ETF-PBS灌裝(運是用于 每只動物的對側膝部小瓶）。在整個體內研究期間，科學家不知道全部動物的處理狀態。
[0269] 動物手術
[0270] 膝部的關節內注射
[0271] 全部大鼠均使用Boyles裝置，通過吸入異氣燒麻醉。剔除每只動物的兩個膝部上 的毛發并且膝部用乙醇擦拭。使用0.5ml無菌Becton Dickinson Micro-Fine膜島素注射器 連同隨附的27號（27G)針頭，用ETF-PBS中的SOiil 0.3mg MIA或單獨ETF-PBS經骸初帶內注 射每只膝部。
[0272] 自發性疼痛的評定
[0273] 通過使用雙足平衡測痛儀(林頓儀器化inton Instruments),英國）測量左后肢和 右后肢的承重，測定每只動物的自發性疼痛。將大鼠置于雙足平衡測痛儀上適當大小的有 機玻璃動物盒中，從而它們后足坐在分離的傳感器上。盒的大小允許大鼠在不擠壓的情況 下舒適地坐下，但是類似地不允許它有足夠空間轉身。一旦大鼠坐穩并平靜，記錄每個肢體 的承重5秒并且記錄W克計由雙后肢發出的平均力量。在每個時間點測定每只大鼠后爪的 重量分布5次(我們事先已經展示其正確性），并且計算5個讀數的均數。通過右側肢體的重 量除W雙后肢的總重量，將各個承重數據換算成重量分布。
[0274] MIA誘導OA后的自發性疼痛測量
[0275] 使用雙足平衡測痛儀測量經過后肢的重量分布，評定自發性疼痛。在基線和在MIA 處理后的3周實施評定。
[0276] 數據在圖6中顯示并且作為總重量對后肢的比例顯示。
[0277] 對于從未用過藥的動物，后肢上重量比例之間不存在統計顯著差異并且理論期望 值是0.5。
[0278] 對于對照抗體處理的動物，與未處理的肢體相比，在處理的肢體上存在統計顯著 更少的重量(39%與61%)。在用抗NGF抗體(PG-007他尼珠單抗生物仿制藥3mg/kg)處理的 動物和用P75NTR-FC(沈Q ID N0.3)按0.3mg/kg和Img/kg處理的那些動物中，在處理的后肢 體上重量比例之間不存在統計(P<〇.01)顯著差異并且理論期望值為〇.5(雙后肢之間均勻 分布)在測量的任何時間點。與相應的對照相比，3mg/kg的P75NTR-FC(SEQ ID NO.3)的鎮痛 作用甚至更統計顯著(P<〇.05)。
[02巧]從運些研究顯而易見，P75NTR-化（SEQ ID NO.3)在OA的MIA大鼠模型中具有鎮痛 性。p75NTR-Fc(SEQ ID NO.3)的鎮痛作用比針對抗NGF抗體(PG-007:生物相似的輝瑞抗NGF 抗體他尼珠單抗)在相似劑量皮下3mg/kg時觀察到的鎮痛作用更大。
[0280] P75NTR-FC分子序列3和序列15對各個神經營養因子的親和力的改善在意料之外 [0%1]從文獻和現有技術普遍認為，對p75神經營養因子受體的親和力低并且對全部神 經營養因子具有約InM的相似親和力（IcMm等人，2012實驗細胞研究化XP Cell Res)318 (11): 1221-8)。另外，阿波羅生命科學（Apollo Life Sciences)(分子及其嵌合分子US 20090232808A1)的現有技術進一步例示p75神經營養因子受體對各種神經營養因子的親和 力的相似性。"NGF是一種作為427個氨基酸糖蛋白合成的I型膜蛋白，運種糖蛋白包含一個 28氨基酸信號膚。NGFW相等的親和力結合全部神經營養因子"。
[0282] 從Biacore等離子體共振研究中，我們已經證實使用GGG接頭間隔團與人IgGlFc偶 聯的序列3和序列15的結合親和力顯著變化。
[0283] 表3:序列3和序列15對每種神經營養因子的Biacore親和力 「W841
[0285] 降低等電點（pi):
[0286] 序列3和在阿波羅生命科學(Apollo Life Science)現有技術中公開的那些序列 理論上具有4.11的pi。然而，運兩類分子顯著糖基化，導致實際上Pl處于3-4范圍內。
[0287] 序列15具有4.23的理論Pl并且比其他P75NTR較少糖基化。從而，Pl處于4-5范圍 內。運提供勝過序列3和阿波羅生命科學現有技術中先前公開的序列的顯著優點(配制改善 和分子結構的變異性較小，原因在于糖基化位點和糖基化數量的變異）。
[0288] 本發明在范圍方面不受本文中描述的具體實施方案限制。實際上，除了本文描述 的那些修改之外，本發明的各種修改將因前文描述和附圖是本領域技術人員顯而易見。運 類修改意在落入所附權利要求的范圍內。另外，如果適宜，本文所述的全部實施方案將視為 與任何和全部其他一致性實施方案廣義適用和與之可組合。
[0289]本文中援引多種出版物是，其公開內容通過引用的方式完整并入。
【主權項】
1. 一種P75NTR神經營養因子結合蛋白（NBP)-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含： (a) p75NTR(NBP)部分；和 (b) 免疫球蛋白Fc部分。2. 根據權利要求1所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述p75NTR(NBP)部分和Fc部 分經接頭連接。3. 根據權利要求2所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述接頭包含式Gx的肽，其中X 是1、2、3、4、5或 6。4. 根據權利要求1至3中任一項所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述p75NTR (NBP)是人 p75NTR(NBP)。5. 根據權利要求1至4中任一項所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述Fc是人Fc。6. 根據任何一項前述權利要求所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含 SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列或由SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列組成。7. 根據權利要求1至5中任一項所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含 SEQ ID NO. 15中所述的氨基酸序列或由SEQ ID NO. 15中所述的氨基酸序列組成。8. 根據任何一項前述權利要求所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述p75NTR (NBP)以通過表面等離子體共振在20°C所測量的約O.OlnM至約50nM之間的結合親和力(Kd) 與NGF、BDNF、NT3或NT4/5的任一者結合。9. 根據任何一項前述權利要求所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，用于治療疼痛或疼痛 癥狀的用途。10. -種核酸分子，所述核酸分子編碼根據權利要求1至8中任一項所述的p75NTR (NBP)-Fc融合蛋白，任選地還包括編碼信號序列。11. 一種可復制表達的載體，所述載體用于轉染細胞、任選地用于轉染哺乳動物細胞， 所述載體包含根據權利要求10所述的核酸分子。12. 根據權利要求11所述的可復制表達的載體，其中所述載體是病毒載體。13. -種宿主細胞，所述宿主細胞攜帶根據權利要求10所述的核酸分子。14. 根據權利要求10所述的核酸分子或根據權利要求11或12中任一項所述的載體，用 于治療疼痛或疼痛癥狀的用途。15. 根據權利要求1至8或權利要求9中任一項所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或根據 權利要求10至14中任一項所述的核酸或載體，其中所述p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或核酸分 子或載體在組合中與第二藥理活性化合物組合時分別、依次或同時使用。16. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據權利要求1至8或權利要求9中任一項所 述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據權利要求11至14所述的核酸分子或載體，和藥學上可 接受的載體和/或賦形劑。17. -種試劑盒，所述試劑盒包含： (a) 根據權利要求1至8或權利要求9中任一項所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根據 權利要求10至14所述的核酸分子或載體，和 (b) 針對以下任一種或多種情況向個體給藥有效量的所述p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白、 核酸分子、載體或藥物組合物的說明書:預防或治療疼痛和/或疼痛癥狀或用于緩解疼痛 和/或疼痛癥狀、控制疼痛和/或疼痛癥狀、減少疼痛和/或疼痛癥狀的發生率，或延遲疼痛 和/或疼痛癥狀形成或進展。18. -種治療和或預防個體中疼痛和或疼痛癥狀的方法，所述方法包括向所述個體給 藥治療有效量的根據權利要求1至8或權利要求9中任一項所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白 或根據權利要求10至14所述的核酸分子或載體，任選地進一步包括藥學上可接受的載體。
【文檔編號】C07K14/705GK105873943SQ201480060027
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年9月18日
【發明人】S·韋斯特布魯克
【申請人】利維塞普特有限公司