生存素導向的癌癥疫苗治療的制作方法

生存素導向的癌癥疫苗治療的制作方法
【專利摘要】本發明涉及治療有效的截短的生存素及其作為疫苗在脂質體制劑中的治療應用，其中所述生存素片段優選是葡萄糖酸化的(gluconoylated)，并且所述脂質體制劑引發體內抗腫瘤活性。更具體地，本發明涉及一種癌癥疫苗，其包含人生存素的片段，該片段與脂質佐劑聯合特別有效。更具體地，本發明涉及脂質體疫苗遞送系統，該系統包含有活性的截短的生存素分子作為腫瘤抗原，和手性陽離子脂質(例如R?DOTAP)作為佐劑，其為該脂質體制劑的部分，其中，所述脂質體藥物遞送系統在其脂質和佐劑組分、物理或物理化學參數，和釋放的截短的生存素分子的最終療效方面得到最優化。最后，本發明涉及一種提高體內CD4+/CD8+T細胞應答，由此得到提高的抗腫瘤活性的方法，所述方法通過提供包含所述截短的優選葡萄糖酸化的生存素的脂質體制劑進行。
【專利說明】
生存素導向的癌癥疫苗治療
技術領域
[0001] 本發明設及治療有效的截短型生存素（survivin)及其作為疫苗在脂質體制劑中 的治療應用，其中所述生存素片段優選是葡萄糖酸化的（gluconoylated)，并且所述脂質體 制劑引發體內抗腫瘤活性。更具體地，本發明設及一種癌癥疫苗，其包含人生存素的片段， 該片段與脂質佐劑聯合特別有效。更具體地，本發明設及脂質體疫苗遞送系統，該系統包含 截短型生存素分子作為腫瘤抗原，和手性陽離子脂質(例如R-D0TAP)作為佐劑，其為該脂質 體制劑的部分，其中，所述脂質體藥物遞送系統在其脂質和佐劑組分、物理或物理化學參 數，和釋放的截短型生存素分子的最終療效方面得到最優化。最后，本發明設及一種提高體 內CD4VCD8+T細胞應答，由此得到提高的體內抗腫瘤活性的方法，所述方法通過提供包含所 述截短的優選葡萄糖酸化的生存素的脂質體制劑進行。
[0002] 發明背景
[0003] 調亡是細胞自毀的遺傳程序，已經表明調亡的抑制是通過延長細胞的生命周期 (運有利于轉化突變的累積)的癌癥形成中設及的重要機制。
[0004] 生存素，一種抑制細胞調亡并屬于調亡蛋白的抑制劑（IAP)家族的蛋白質，于1997 年被Al tier i及其同僚發現并表征（參見例如WO 98/22589 ; Ambros ini等，Nature Medicine.917-921,1997;Adida等，American Journal of Pathology,152,43-49,1998; Cirino等,J Clinical Investigations,99,2446-2451,1997;Adida等,The Lancet,351, 882-883,1998)O
[0005] 生存素(survivin)是16.5kDa的胞質蛋白，其包含單一BIR和高度荷電的簇基末端 卷曲區域，而不是RING指，其在B細胞前體中轉換時抑制由生長因子（化-3)抽回 (WitMrawal)所誘導的調亡。生存素在多種實體瘤和血液惡性病中過表達，同時顯示在最 終分化的成人組織中具有有限的表達。已在人轉錄組中鑒定出約40個基因，其在全部癌癥 中但不在附近正常組織中過表達。在運40個基因中，生存素基因（BIR巧)被鑒定為人癌癥中 第四最常見的過表達腫瘤相關抗原(Velcules州等，Nat Genet 23(4) :387-8,1999)。
[0006] 生存素是142個氨基酸(aa)的蛋白質，其由Birc5基因（調亡基因抑制劑家族的成 員)編碼。人生存素的氨基酸序列由沈Q ID NO: 1表示
[0007] N--MGAP化PPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACWERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC
[0008] FKELEG肥PD 孤PI邸服KH SSGCAFLSVK KQF邸LTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK
[0009] 邸EF邸TAKK VRRAIE化AA MD-C.
[0010] 大多數人類癌癥中，生存素的過表達表明腫瘤進展中的調亡抑制的一般作用，運 是由如下觀察結果證實的概念:在結腸直腸和膀脫癌W及成神經細胞瘤的情況中，生存素 的表達與不利預后相關聯。相反，在正常成人組織中檢測不到生存素。運些特點使生存素有 資格作為合適的TAA，用于診斷和治療目的。
[0011] 生存素在大多數人類癌癥中高度過表達，包括結腸直腸癌(67%)、非小細胞肺癌 (96%)、乳腺癌(90%)、前列腺癌(83%)、腎細胞癌(79%)、卵巢癌(87%)、膀脫癌(88%)、 子宮內膜癌(83%)等。在全部上述那些腫瘤中，生存素表達的增加與較差的臨床結果相關。
[0012] 癌癥中生存素蛋白的表達與較差預后、診斷時晚期疾病、對于治療的較高級別的 抗性，和較高復發率相關聯。生存素在確定細胞分裂和調亡之間的平衡方面具有多種功能。 首先，生存素 W細胞周期依賴性方式(G2-M檢驗點）表達，并且顯示與有絲分裂紡鍵體相互 作用W促進細胞周期的進展。第二，生存素通過干擾脫冬酶-9加工和下游效應物脫冬酶(例 如，脫冬酶-3)的活化，由此抑制線粒體調亡通路，來抑制調亡。第=，在細胞應激反應過程 中，生存素與分子伴侶熱激蛋白90相互作用，W促進細胞存活。癌癥中生存素的過表達，W 及其在促進癌細胞的存活和持續生長方面的胞內作用，使得生存素成為免疫治療的一個具 有吸引力的目標。此外，已在腫瘤微環境中的增殖內皮細胞中鑒定到生存素表達，運顯示了 治療型疫苗接種的另一個目標。
[0013] 隨著對于"免疫系統在生物學表現和癌癥發展中起主要作用"的理解的遞增，人們 對于"在癌癥治療中采用疫苗接種"的概念產生了興趣。癌癥疫苗開發的過程從對于抗原、 制劑和免疫方案的選擇到對其效果的評估。與預防性疫苗(其通常旨在產生高水平的保護 性抗體)不同，治療性疫苗旨在引發有力的T細胞應答，其能夠介導腫瘤細胞的毀滅或至少 停止其生長。治療性疫苗開發過程中的首要挾擇是關于待用的抗原類型。目前已鑒定了數 百種T細胞限定的腫瘤抗原。第二挾擇有關將抗原遞送至免疫系統的載劑的選擇。存在的相 對較大多樣的可能性包括裸DNA、mRNA、重組蛋白、合成的膚、重組病毒或細菌載體或樹突細 胞(其離體荷載抗原）。本發明一般設及基于蛋白質的治療性癌癥疫苗，并且具體設及生存 素導向的癌癥疫苗。
[0014] 許多治療性的、基于蛋白質或基于膚的癌癥疫苗的策略是將腫瘤抗原優先遞送至 適應性免疫系統的主要組織相容性復合物類物質，運隨后誘導能夠W抗原特異性方 式識別和裂解腫瘤細胞的抗原特異性CD8+T細胞。運在基于膚的疫苗中通過下述方法得W 實現:采用引發來自CD4+輔助T細胞的不充分的細胞因子支持的可能限制，將抗原性庫限制 至MHC I類膚。在過去十年間，已經發現了由生存素衍生的相當大量的MHC I/II類膚(參見 例如US 6,245,523;EP 2 092 938;和EP 2 359 841)。運些發現強力表明，生存素作為腫瘤 排斥抗原前體，TRAP，其由細胞加工成具有TRA功能性的膚。然而，相應的生存素衍生的9-至 15-聚體膚的免疫原性通常低于全長生存素。
[0015] 在治療性癌癥疫苗中，將全長腫瘤抗原呈遞給免疫系統的好處之一在于，可能在 接種疫苗的宿主中誘導加強的體液W及CD4+和CD8+T細胞應答(Davis等，PNAS 101(29): 10697-702,2004)。先前已經報道了采用基于生存素膚的DC疫苗在腦神經膠質瘤的臨床前 模型中勒!向CD4+和CD8+T細胞表位的治療益處(Ciesielski等,Cancer Immunol Immunother 57(12):1827-35,2008)。
[0016] 膚和重組蛋白質本身的免疫原性通常較差，因此需要將其與佐劑聯合給予。佐劑 的作用是至少兩倍。一方面，佐劑在足W允許充分引發T細胞應答的時間長度中將抗原遞送 至免疫系統。另一方面，佐劑觸發樹突細胞的活化和成熟。因此，載有抗原的DC遷移至附近 的淋己結，并獲得W最優方式呈遞抗原用于重新起始T細胞應答的能力。前一項佐劑功能可 通過多種試劑滿足，例如礦物油，用于乳液形成(不完全弗氏佐劑）、脂質體或生物可降解的 微球。目前可用于人類的佐劑相對較少。運些包括明抓和MF59。然而，越來越多的分子限定 的佐劑出現于臨床開發中，并用于癌癥疫苗接種的臨床試驗中。運些包括各種合成的或重 組TLR配體、礦物油，例如蒙塔尼(mon化nide)、皂巧類，甚至脂質體。
[0017]用于癌癥疫苗接種且包含陽離子脂質和疫苗佐劑(R，S D0TAP(1，2-二油酷基-3-S甲基錠丙烷））的脂質體納米顆粒已被建立成用于DNA、膚和蛋白質的有效遞送系統。作為 脂質組分和佐劑應用的其它陽離子脂質有：0514?、0114?、0004?、0048、3,8 001]^、尺-DOTMA、S-DOTMA、R，S DOEPC、R-DOEPC和S-DOEPC。DOTAP在脂質體制劑中的應用提供了凈正 表面電荷，其被報道能夠促進納米顆粒和APC之間的相互作用(Foged等，Int J化arm 298 (2): 315-22，2005)。此外，DOTAP促進樹突細胞成熟，由此增強抗原交叉呈遞，運通過反應性 氧物質(ROS)介導的機制發生(參見化n等，J Control Release 130(1) :22-8.2008)。
[001引最近顯示，W其分開的對映異構體形式（例如R-DOTAP和S-D0TAP)使用的，包含手 性陽離子脂質作為脂質組分和佐劑的脂質體制劑在放大對于抗原的免疫應答，W及甚至在 誘導、活化和導向性地調節免疫應答方面格外地有效（參見例如WO 2009/129227和WO 2013/039989)。
[0019] 脂質體是公認的藥物遞送載劑。它們是微小的、納米顆粒大小的、封閉的載劑，其 包封通過包含憐脂(優選是組成細胞膜的憐脂部分）的雙層膜與外部介質分隔的內部水性 空間。脂質體的結構與細胞的基礎結構高度相似。它們也相對具有生物相容性。脂質體體現 將藥物遞送至身體中希望的目標并降低系統毒性的潛力。因此，在改善的制劑和更好的祀 向策略將獲得更高的治療方面存在越來越多的興趣。脂質體可基于尺寸、形貌、組成、制備 方法和功能而廣泛分類。簡言之，W尺寸來看，脂質體W兩種常見類別存在：小單層載劑 (SUV)和大單層載劑化UV)dSUV的尺寸范圍通常在20nm-100nm。尺寸范圍在10化m-20化m的 中間單層載劑（IUV)被視為在SUV之間。SUV是單殼載劑，優選通過高強度超聲處理產生。親 水性藥物被捕獲在內部水性核屯、中，而疏水性藥物被捕獲在雙層膜中。
[0020] 如前所述，已證明脂質體制劑作為藥物遞送載劑的多項益處。然而，因為它們的包 封率低，它們必須用于攜載極強力的藥物。基于脂質的載劑還面臨若干其它困難，例如，在 血流中不穩定、許多藥物在脂質/表面活性劑溶液中溶解性差、膽存穩定性差，和藥物的快 速突釋。脂質體制劑也與嚴重副作用相關聯，因為其會在皮膚組織中的累積。因此，2012年， 僅12種采用脂質體遞送系統的藥物獲得許可，還有五種其它脂質體藥物處于臨床試驗中。
[0021] 因此，目前十分需要提供高度有效且穩定的脂質體抗原遞送系統，其能夠釋放需 要在體內引發希望的增強免疫應答的選定的抗原，所述免疫應答通過高度有效的佐劑的存 在而被加強。
[0022] 生存素是有利的癌癥疫苗候選物，出于如下原因，其具有用于持久腫瘤特異性免 疫應答的潛力，和有利的安全性能：
[0023] ?在終末分化的正常組織中低表達。
[0024] ?在各種癌癥類型中高表達。
[0025] ?表達與晚期級別和治療抗斥相關聯。
[0026] ?調亡抑制劑。
[0027] ?促進細胞分化和遷移/轉移。
[00%] ?促進腫瘤微環境中的血管生成。
[0029] ?設及細胞應激反應。
[0030] 因此，本發明的一個目的是，提供用于生存素導向的癌癥治療的脂質體制劑，其至 少在強佐劑DOTAP或結構類似的手性陽離子脂質的存在下，于體內穩定且充分有效。
[0031] 待解決的問題之一必定是抗原與佐劑關于其不同的永久凈電荷(R-DOTAP的正凈 電荷，和生存素的負凈電荷）的固有不相容性，運導致穩定性降低。另一個問題是各制劑中 的生存素的體內免疫原性不足。
[0032] 通過本發明對于脂質體制劑的脂質組分的選擇、生存素結構/序列的調節，和多種 物理化學參數(例如粒徑、抗原荷載、脂質組分和DOTAP的濃度和含量）的最優化，上述問題 能夠得到解決。

【發明內容】

[0033] 在脂質體制劑中采用全長生存素的嘗試顯示，運些顆粒具有不盡如人意的生物物 理蛋白質性質。總之，當與D0TAP，本發明的優選佐劑混合時，能夠觀察到缺乏穩定性的生存 素（圖1、圖2)。
[0034] 驚人地發現，通過采用C末端截短型生存素，能夠解決穩定性問題。將生存素 C末端 截短能使該蛋白質在溶液中穩定，運通過移除誘導蛋白質在溶液中沉淀的疏水片來實現。 蛋白質被加工成膚并呈遞至免疫系統的能力不需要對于蛋白質的部分的生物活性-僅在與 抗原呈遞細胞的蛋白體復合物接觸之前需要結構完整性。在本發明的一個方面中，C末端截 短型生存素在生物學上仍有活性且有效。
[0035] 因此，本發明的一個目的是，提供C末端截短的形式，其由全長生存素 (SEQ ID NO: 1)的1-119、1-120、1-121、1-122、1-123、1-124、1-125、1-126、1-127、1-128、1-129、1-130、 1 -131、1 -132、1 -133氨基酸殘基組成，自N末端計算。
[0036] 因為生物工程改造策略，在本發明的優選實施方式中，第一個甲硫氨酸殘基可被 切割去除，提供如下截短型生存素 ：SEQ ID N0:1的2-119、2-120、2-121、2-122、2-123、2-124、2-125、2-126、2-127、2-128、2-129、2-130、2-131、2-132或2-133。
[0037] 在包含例如DOTAP(優選R-D0TAP)作為脂質佐劑的脂質體制劑中，與全長生存素相 比，上述運些生存素短型序列全部顯示的改善的生物-物理性質，同時發揮相似的藥理學性 質，其各自與142個氨基酸殘基序列(SEQ ID N0:1)代表的全長生存素相比。
[0038] 因此，本發明設及如下截短型生存素氨基酸序列： MGAP化PPAW QP化做服IS T邱層P化EG CACT陽RMAE AGFiHCPTEN E抑LAQCFFC
[0039] F'腿LEGWE即腳PI魄服冊SSGC抑LSVK蝴F跑L化邸FLKL蛾邸地服IA陸T投NK
[0040] (SEQ ID N0:2):該序列的Gly2-K120序列部分在本發明中稱作本發明的藥物物 質，或"dC-生存素藥物物質"，并且與SEQ ID NO: 3的序列部分1-119相同。
[0041 ] GAP化PPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACWERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC
[0042] FKELEG肥PD 孤PI邸服KH SSGCAFLSVK KQF邸LTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK
[0043] (SEQ ID N0:3):該序列的Glyl-Klig序列部分在本發明中稱作本發明的藥物物質 或dC-生存素，并且與SEQ ID N0:2的序列部分2-120相同。
[0044] 本發明優選設及由全長生存素的前120個N末端氨基酸殘基組成的截短型生存素， 其中優選刪去位置1上的甲硫氨酸殘基(SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3)。
[0045] 更驚人地發現，如上所述的截短型生存素，在葡萄糖酸化至某一程度時，與截短的 非葡萄糖酸化的生存素相比，能夠引發顯著改善的體內藥理學性質。
[0046] 因此，本發明的一個目的是，提供一種C末端截短型生存素，其由SEQ ID No. 1代表 的全長人生存素的前118-122個N末端氨基酸組成，或由與所述截短型生存素具有>90%，優 選〉91%、〉92%、〉93%、〉94%、〉95%、〉96%、〉97%、〉98或>99% 的同源性且引發相同或幾 乎相同的生物活性的序列組成，其中所述截短型生存素在一個或多個位置處被葡萄糖酸 化。
[0047] 在一個特定方面，本發明設及C末端截短型生存素，其由SEQ ID NO: 1所代表的全 長人生存素的前118-133個N末端氨基酸組成，或與所述截短型生存素具有>90 %的同源性 的序列，其中，所述截短型生存素在一個或多個位置處葡萄糖酸化。在一個優選方面中，所 述C末端截短型生存素發揮相同的生物活性。
[0048] 本發明具體設及由全長人生存素的前120個N末端氨基酸組成的相應的C末端截短 型生存素;所述截短型生存素由氨基酸序列(SEQ ID N0:2)代表：
[0049] 鵬俾化？城W OPFL邸釀IS 邱猜巧LEGCAG件靴MAE A睞I恥PTEN E抑LAQ鄭FC 邱趾晚備PI) I3DPIE瑣跋杜親描AFLSM K臘郎LTL組化化孤煎A反MIA紙了脯肛，
[0050] 其中所述截短型生存素在一個或多個位置處葡萄糖酸化。
[0051 ]在本發明的一個優選實施方式中，至少在SEQ ID N0:2或如上所述的相應的118-122個氨基酸殘基序列的位置2處的甘氨酸殘基被葡萄糖酸化。
[0052]本發明具體設及相應的截短型生存素，其中，位于N末端位置1處的甲硫氨酸殘基 被移除(通常在蛋白質表達步驟之后）；所述截短型生存素由氨基酸序列（SEQ ID N0:3)代 表：
[005；3] GAP化PPAW QPFLKDHRI S TFKNWPFLEG CACWERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC
[0054] FKELEG肥PD 孤PI邸服KH SSGCAFLSVK KQF邸LTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK
[0055] 其中所述截短型生存素在一個或多個位置處葡萄糖酸化。
[0056] 在本發明的一個優選實施方式中，至少在SEQ ID N0:3或相應的118-122個氨基酸 殘基序列的位置1處的甘氨酸殘基被葡萄糖酸化。
[0057] 發明人已顯示，如果在本發明的截短型生存素的賴氨酸殘基處進行葡萄糖酸化 (gluconoyIation)，能夠進一步改善有利的性質。優選地，SEQ ID NO: 2的位置23和103處的 賴氨酸殘基，和SEQ ID NO:3的位置22和103處的賴氨酸殘基，可分別被葡萄糖酸化，優選通 過葡糖酸-1,5-內醋進行，但原則上也可采用其它葡糖酸化試劑。因此，本發明的一個目的 在于，提供一種相應截短的葡萄糖酸化的生存素，其中所述葡萄糖酸化在賴氨酸殘基處額 外地進行，所述賴氨酸殘基優選是位于SEQ ID N0:2的位置23和/或位置103處，或位于SEQ ID NO:3的位置22和/或102處的賴氨酸殘基。
[005引驚人地發現，如果對應組合物中并非所有的截短型生存素分子均被葡萄糖酸化， 則由本發明的脂質體制劑產生的體內藥理學數據尤其有利，特別是關于活化的CD4+和/或 CD8+T細胞應答的體內藥理學數據。具體而言，40%的葡萄糖酸化獲得了最為平衡的生存素 特異性CD4+和CD8+T細胞應答。較高水平的葡萄糖酸化優先參與CD8+T細胞應答，運WCD4+輔 助T細胞支持為代價。因此，本發明的一個目的在于，提供一種生存素組合物，其包含如上所 述的截短型生存素，和相應的非葡萄糖酸化的截短型生存素，其中在所述組合物中，該截短 型生存素的所述組合物中的10-80%，優選10-60%，更優選35-45%，最優選約40%的截短 型生存素分子被葡萄糖酸化。
[0059] 本發明的截短型生存素的葡萄糖酸化提供如下優勢：
[0060] 合成的葡萄糖酸化允許提供寬修飾范圍，允許對其藥理學益處進行系統評價。
[0061] 建立的方案為設計高效且高性價比的方法提供了基礎。
[0062] (截短型）生存素的葡萄糖酸化提高了本發明的治療性截短型生存素作為腫瘤 疫苗的抗原性和功效。
[0063] 認為本發明的截短型生存素的合成葡萄糖酸化是一種優化，其在克服與宿主細 胞葡萄糖酸化相關聯的主要不利條件的方面具有潛力。
[0064] 本發明的生存素可W是糖基化(glycosylated)的或非糖基化的。優選地，它是非 糖基化的，并且由細菌系統(如大腸桿菌)制造。
[0065] 如上所述，本發明的主要目的是提供一種脂質體制劑，其在疫苗接種后于體內產 生生存素或生存素樣活性，其中所述脂質體制劑在不同物理和藥理學參數方面被優化，并 且包含十分有效的免疫刺激劑和佐劑DOTAP，優選其手性組分R-DOTAP，或類似的手性脂質 佐劑，例如R-或S-DOTMA或R，S D0EPC。因此，本發明的目的在于，提供一種脂質體制劑，其包 含：
[0066] (i)截短型，優選葡萄糖酸化的生存素，如上所述，例如SEQ ID N0:2的包含120個 氨基酸殘基的序列，或SEQ ID N0:3的包含119個氨基酸殘基的序列，或具有>90%，優選〉 95%的序列同源性的相應的經修飾的序列，或者，相應的截短型生存素的生存素組合物，其 中該截短型生存素分子的10-60%，優選35-45%被葡萄糖酸化，如上所述，和
[0067] (ii)至少一種佐劑，其中所述至少一種佐劑是具有免疫調節劑作用的手性陽離子 憐脂，優選選自下組：R，S DOTAP、R-DOTAP、S-DOTAP、R，S DOTMA、R-DOTMA、S-DOTMA、R，S DOEPC、R-DOEPC和S-DOEPC。
[0068] 發明人發現，如果W2-8mM，優選3-5mM，且最優選約4mM的濃度施加，尤其但不限 于，聯合脂質體制劑中的R-DOTAP施加，上述手性陽離子佐劑脂質特別有效。脂質體制劑中 脂質佐劑的含量可變化，但有趣的是，15-30% (mol/mol)的含量產生藥理學功效方面的最 佳結果。
[0069] 發明人還顯示，除手性陽離子脂質的存在W外，脂質組合物的質和量在本發明的 脂質體制劑的有利性質方面也起重要作用。
[0070] 因此，本發明的另一個目的在于，提供一種脂質體制劑，其基于截短型生存素和至 少一種手性陽離子脂質佐劑，例如D0TAP，如上所述，其包含膽固醇和選自下組的至少一種 憐脂:卵憐脂(PC)、憐酸乙醇胺(PE)，和憐酸甘油(PG)。
[0071] 在本發明的一個優選實施方式中，憐脂是選自下組的卵憐脂（PC):DLPC、DSPC、 0口口(：、01?(：、00?(：、6?(：和6?〔3。如下所示，蛋卵憐脂巧?〇(其為不同？(：的粗混物)是最為優選 的，因為相較于其它憐脂酷膽堿(例如DMPC)，其顯示最顯著的作用（例如，對于CD8+觸發的 體內應答）。不過，對于本發明的脂質體組合物的制備，也可采用并測試其它已知的憐脂。
[0072] 本發明的脂質體制劑可包含如下含量的膽固醇：10-60% (mol/mol )，優選20-45%，更優選30-45%，最優選45%，和如下含量的上述卵憐脂(PC) :30-80% (mol/mol)，優 選30-50%，最優選約35%含量的EPC。
[0073] 本發明的脂質體制劑包含介于40nm和500nm的不定尺寸的納米顆粒。優選的脂質 體組合物包含脂質體顆粒，其中至少70%的顆粒，優選至少80%的顆粒，的尺寸為50- 500皿，優選100-300皿，最優選150-25化m，因為運些顆粒產生物理和生物性質方面的最有 利結果。
[0074] 還顯示，當依賴于抗原荷載的顆粒表面電荷>17mV，所述抗原荷載根據本發明是 0.5 -1.5mg/mL，優選0.75 -1. Omg/mL時，能夠獲得尤其有利的結果。正表面電荷K電位)能增 強含DOTAP的脂質體納米顆粒的免疫和抗腫瘤活性。
[0075] 根據上文可見，脂質體納米顆粒的全部相關參數和組分均經調節W獲得最優化的 脂質體制劑，其獲得較為驚人的性質，并且在本發明中稱為本發明的藥物產品，或"dc-生存 素藥物產品"。
[0076] 因此，本發明的特定目的是，提供一種相應的脂質體制劑，其包含：
[0077] (i)截短型（葡萄糖酸化的）生存素和截短型生存素的組合物，所述截短型生存素 如上文和權利要求中所述，優選SEQ ID NO:2或3的序列，
[007引 （i i)脂質組分R-DOTAP、膽固醇和EPC，
[0079] (i i i)該制劑中的R-DOTAP濃度是3 - 5mM，
[0080] (iv)脂質體顆粒，其中至少70%具有150-250nm的粒徑，和
[0081 ] (v)0.5mg/mL( ±0.1 mg/mL)的抗原荷載。
[0082] 在一個優選實施方式中，所述藥物產品由如下參數表征：
[0083] (i)葡萄糖酸化、非葡萄糖酸化的截短型生存素，其由SEQ ID N0:3代表，其中，約 40% (±2-5%，優選±5%)的所述截短型生存素被葡萄糖酸化，和
[0084] Qi)所述脂質組合物的含量為：10-30%，優選約20% (±1%)R-D0TAP; 25-55%， 優選約45%(±1%)膽固醇;和30-60%，優選約35%(±1% 化PC(mol/mol)。
[0085] 本發明的脂質體制劑的脂質體顆粒，優選憐脂組分可通過標準方法被PEG化。本發 明的運些PEG化的脂質顆粒顯示增強的穩定性，和該制劑對于低鹽濃度的敏感性降低方面 的強趨勢，由此顯著影響并改善了蛋白質或制劑的沉淀。然而，相較于非PEG化的顆粒，本發 明的PEG化的脂質體制劑驚人地獲得較低的體內功效(CD47CD8+T細胞應答和抗腫瘤活性）。 然而，可根據本發明來采用脂質顆粒的PEG化，W調節有需求的患者(尤其是具有過度反應 的免疫應答的個體）中的免疫應答。因此，本發明的一個目的是提供一種脂質體制劑或疫苗 組合物，如上文和下文所述的，其中所述脂質體顆粒經PEG化，優選介于0.5%和5% (mol/ mol總脂質含量)之間。
[0086] 本發明還設及本發明的脂質體和疫苗制劑，其出于膽存目的被凍干。介于2.0-2.5%(w/v)的低濃度薦糖的存在能使制劑充分穩定化而不影響凍干制劑的藥理學功效。本 發明的制劑還可包含抗氧化劑，優選一硫代甘油(MTG)，用于保護不受氧化破壞。
[0087] 如上下文所述的脂質體和疫苗制劑根據本發明用于制備疫苗組合物，所述疫苗組 合物旨在用于疫苗接種治療。
[0088] 因此，本發明的一個目的在于，提供一種免疫刺激性疫苗，其包含如上下文所述的 脂質體制劑，其還可包含運載體、賦形劑、添加劑、稀釋劑、其它免疫增強劑或免疫效應物分 子。
[0089] 本發明的疫苗組合物與其它治療有效的藥物聯合或分開使用（同時或依次給予）， 所述其它治療有效的藥物例如，抗腫瘤劑和/或其它治療形式，例如福照。
[0090] 在一個優選實施方式中，所述脂質體疫苗制劑與化療劑(例如環憐酷胺、卡銷，或 紫杉醇)聯合，或與抗腫瘤抗體或抗體-細胞因子融合蛋白（例如NHS-IL12)聯合，如下所述。 運些組合顯示增強的體內功效(圖21-24)。因此，更具體地，本發明的進一步目的是，提供一 種藥物組合物，其包含脂質體制劑或免疫刺激性疫苗組合物，在本文所述的每種情況中，聯 合選自下組的抗腫瘤劑:環憐酷胺、卡銷、紫杉醇和NHS-IL12。在一個優選的方面，本發明設 及所述藥物組合物，其用于人個體的預防或治療，其中所述個體患有癌癥或癌癥相關的疾 病。
[0091] 最后，本發明設及所述通過疫苗接種來進行人個體的預防或治療的免疫刺激性疫 苗或脂質體制劑，其中所述個體患有癌癥或癌癥相關的疾病，或有運種傾向。本發明尤其設 及:通過疫苗接種來治療患有癌癥或具有患癌傾向的患者的相應的方法，其中所述疫苗接 種觸發所述個體中的生存素特異性免疫應答，例如，通過調節，優選通過攻擊患者的免疫系 統來增強CD4+和/或CD8+T細胞應答，并由此抑制或防止該患者中的腫瘤生長。
[0092] 根據本發明，對于制劑優化了疫苗的如下參數，從而相較于全長生存素，增強免疫 應答：
[0093] .生存素蛋白質修飾：10-80%,優選10-60%的受控合成的葡萄糖酸化影響生存 素特異性CD4+和CD8+T細胞應答的最優誘導。
[0094] ? R-DOTAP濃度:3.5-4.5mM DOTAP包括了生存素特異性CD4+和CD8+T細胞應答的最 優平衡。
[0095] ?顆粒表面電荷:C電位〉17mV，優選約為1 SmV，運誘導生存素特異性CD4+和CD8+T細 胞應答之間的最優平衡。
[0096] ?粒徑:較大納米顆粒，優選〉200nm，運增強生存素特異性CD8+T細胞IFN- 丫生成。
[0097] ?脂質組合物:在發展細胞免疫應答方面，EPC輔助脂質一致地勝過合成的輔助脂 質，例如DMPC等。
[009引 ?用于低溫保存的賦形劑:2-3%薦糖支持穩定且有活性的凍干疫苗制劑。
[0099] 本發明的制劑能增強截短型生存素的水性穩定性，并通過轉而采用所述截短型生 存素克服了 R-DOTAP和全長生存素固有的不相容性。通過施用如上所述的截短的葡萄糖酸 化的生存素，與全長的原先的生存素對比，藥理學活性得到了保持，并且，相對于非葡萄糖 酸化的截短型生存素而言有所增加(參見圖2-圖14)。
[0100] 附圖簡述
[0101] 圖lA:8mM脂質濃度、具有遞增量的生存素的DOTAP脂質體。從左至右:0蛇/mL蛋白 質、4化g/mL蛋白質、3. Img/mL蛋白質。由遞增的蛋白質濃度誘導了DOTAP-蛋白質復合物的 沉淀。
[0102] 圖IB:在多種抑和鹽條件的基質中，全長生存素對比C末端截短型生存素的穩定性 評估。綠色指示有利，紅色為不利條件。對于1-120個氨基酸的生存素，觀察到蛋白質相容的 條件的相對延伸趨向于較低的鹽和較低的pH。
[0103] 圖2:對于包含D0TAP/CH0/DMPC或D0TAP/C冊/DPPC的S元混合物的脂質組合物的 滴定和粒徑(顆粒尺寸)分布(96w形式）的影響，樣品在to和在2-8°C膽存1周后檢測。在匯集 并檢測=份制備物后獲得多個值。
[0104] 圖3:關于不同的PC組合（96w形式）的脂質體組合物的滴定：DMPC+DPPC、D0PC+ DPPC、D0PC+DSPC，當采用D0PC+DPPC或DPPC+DMPC的組合時獲得合適的粒徑分布。值代表S 個小瓶各自值的匯集。
[01化]圖4:關于不同比例的DPPC和DOPC、具有固定含量的D0TAP(20%mol/mol)和膽固醇 (45 % mo 1 /mo 1)的脂質體組合物的滴定（96w形式），在寬范圍的比例中獲得合適的粒徑分 布。值代表=個小瓶各自值的匯集。
[0106] 圖5:關于不同的PC組合(96w形式）的脂質體組合物在降低的鹽含量（IOOmM KCl) 條件下的滴定。在使載有生存素的脂質體穩定的方面，顯示DMPC優于DPPC和DSPC。也顯示 DOTAP含量的減少使脂質體穩定。值代表S個孔各自值的匯集。
[0107] 圖6:在存在減少的KCl含量(50nM)的條件下的脂質體組合物(96w形式）的滴定。關 于制劑可行性和在4°C放置一周的短期穩定性，研究了不同比例的DSPE-PEG2000(l-5% mol/mol)和不同的輔助脂質。采用DMPC、DPPC和DOPC作為憐脂。值代表S個孔各自值的匯 集。
[010引圖7:佐劑濃度的影響。C57化/6小鼠2次疫苗接種之后的CD4和CD8讀出值，疫苗組 合物：1 OOnm DOTAP脂質體，0.5mg/mL抗原荷載，脂質：20 %DOTAP、35 %EPC、45 %膽固醇。
[0109] A:T細胞記憶應答暗示約2mM DOTAP條件下的增殖最大值。
[0110] B:相反，在制劑中DOTAP的最高濃度條件下觀察到產生CD8+T細胞的SVN特異性 IFN-T的最高頻率。
[0111] 對照例：非特異性的免疫活化通過如下方式定量：用MHC I類限制性卵清蛋白膚 (SIINFEKL)刺激從疫苗接種的小鼠分離的CD8+T細胞。
[0112] 圖8:DOTAP濃度的影響-2mM對比4mM R-D0TAP。
[0113] A:CD4+T細胞增殖，和
[0114] B:在巧7BL/6小鼠中進行2次疫苗接種之后的CD8+IFN-丫生成，疫苗組合物：100皿 DOTAP脂質體，0.5mg/mL抗原荷載，脂質：20 %DOTAP、35 %EPC、45 %膽固醇。
[0115] 對照例：非特異性的免疫活化通過如下方式定量：用MHC I類限制性卵清蛋白膚 (SIINFEKL)刺激從疫苗接種的小鼠分離的CD8+T細胞。
[0116] 4mM DOTAP誘導了生存素特異性CD4+和CD8+T細胞應答的最優平衡。
[0117] 圖9:C電位和疫苗荷載對生存素特異性CD4+和CD8+T細胞應答的作用。2次疫苗接種 后C57BL/6小鼠的CD4和CD8讀出值，疫苗組合物：IOmM脂質濃度，脂質：20%DOTAP，35%EPC， 45 %膽固醇。
[011引A:SVN特異性CD4+T細胞增殖，其根據通過用純化的全長生存素蛋白質脈沖處理的 抗原呈遞細胞刺激的分離的CD4+T細胞中的3H-胸巧攝取來檢測。
[0119] B: SVN特異性CD8+T細胞IFN-丫生成，其通過采用經M肥I類限制性SVN膚脈沖處理 的抗原呈遞細胞刺激的分離的CD8+T細胞的ELISPOT分析來檢測。
[0120] 顆粒表面電荷:-6mV~+33mV。疫苗荷載導致顆粒表面電荷的荷載。+ 18.3mV的C電 位誘導生存素特異性CD4+和CD8+T細胞應答的最優平衡。
[0121 ] :粒徑對細胞毒性免疫應答的影響。制劑由20 % R-D0TAP/35 % EPC/45 %膽固 醇(mol/mol似IOmM的總脂質濃度，各藥物載量為0.5mg/mL組成。較大的納米顆粒(200nm) 增強了生存素特異性CD8+T細胞IFN- 丫生成。EPC輔助脂質在發展細胞免疫應答方面一致地 優于合成的輔助脂質(例如，DMPC)。
[0122] 圖11: DMPC對比EPC作為憐脂組分的比較。脂質體的組成如下：20 % DOTAP/25 % EPC/45% 膽固醇(mol/mol)或20%0014口/50%01口(：/30%膽固醇，脂質濃度：10111]\1，藥物載 量:0.5mg/mL，尺寸：105皿化PC)對比129皿(DMPC)，數據在每周兩次疫苗接種之后采集，N = 10只小鼠/組。
[0123] 圖12:載有下述物質的PEG化的脂質體的細胞毒性免疫應答:
[0124] A:兩次疫苗接種。
[0125] B:四次疫苗接種，脂質濃度：IOmM,尺寸:50-60nm，抗原荷載:0.5mg/mL，n=10只小 鼠/組。
[0126] 3和5 % PEG化。
[0127] 圖13: PEG化的生存素脂質體(3%，5% )對比非PEG化的制劑(0 % )的比較，脂質體 組成:20mM脂質濃度(app)。200nm尺寸，抗原載量0.5mg/mL，數據顯示非PEG化制劑優越的細 胞毒性作用。
[01%]圖14:液體化PC液體形式）和凍干化PC凍干形式）脂質體重建后的比較，脂質體組 成:20mM，20 % D0TAP/35 % EPC/45 % 膽固醇，尺寸:200nm，抗原載量:0.5mg/mL，EPC 凍干形式 額外包含lOOmg/mL薦糖。
[0129] 圖15A:葡萄糖酸化方案。
[0130] 圖15B:通過使用葡萄糖酸-1,5-內醋試劑產生的生存素葡萄糖酸化范圍。
[0131] 圖15C:反應參數及其對生存素葡萄糖酸化的作用的評價。
[0132] 圖16:生存素葡萄糖酸化對生存素特異性CD4+和CD8+T細胞應答的作用。
[0133] 圖17:生存素葡萄糖酸化對dC-生存素在皮下MC38/SVN腫瘤模型中的抗腫瘤功效 的作用。
[0134] 圖18:根據本發明的l-120aa截短型生存素的合成的基因。表達質粒AL37包含編碼 該截短型生存素 （SEQ ID N0:2;l-120aa)的DNA序列。表達之后，SEQ ID N0:3(對應于SEQ ID N0:2的2-120,省略了第一個甲硫氨酸殘基)的截短型生存素被釋放進入培養基。
[013引圖19: PAL37中的限制性位點。
[0136] 圏或:包含編碼沈Q ID NO:2/3的截短型生存素 DNA的表達質粒pAL37(沈Q ID NO: 4)的DNA序列和特征。
[0137] 圖21:本發明的截短型生存素 (SEQ ID N0:3的2-120aa)與環憐酷胺(CPA)的組合。
[0138] 圖22:本發明的截短型生存素 （SEQ ID N0:3的2-120aa)與抗體-細胞因子融合蛋 白畑S-IL12的組合。
[0139] 圖23:在荷載卵巢腫瘤的SVN.Tg小鼠中，本發明的截短型生存素 (SEQ ID N0:3的 2 -120aa)與紫杉醇的組合。
[0140] 圖24:在荷載卵巢腫瘤的SVN.Tg小鼠中，本發明的截短型生存素 (SEQ ID N0:3的 2-120aa)與卡銷的組合。
[0141] 發明詳述
[0142] 根據本發明的定義，術語"藥物物質"指的是"dC-生存素"（2-120aa二聚生存素構 建體，在C末端截短），簡稱為本發明的截短型生存素(基于SEQ ID N0:3)，其中，截短型生存 素至少在SEQ ID NO:3的Glyl被特定地葡萄糖酸化。
[0143] 根據本發明的定義，術語"藥物產品"指的是包含如上所述的"藥物物脈'的脂質體 制劑，并且優選地如本文上下文所述。更具體地，本發明的"藥物產品"是：（i)由SEQ ID NO: 3表示且非糖基化的截短型生存素，其中所述截短型生存素的40% (±0.5%)被葡萄糖酸 化，和（ii)脂質組合物的含量為：10-30%,優選約20%(±1%)R-DOTAP;25-55%，優選約 45%(±1%)膽固醇；和30-60%，優選約35%(±1%化口(：(111〇1/111〇1)。
[0144] 表達系統的選擇
[0145] 小尺寸，W及產生缺乏翻譯后修飾的多膚的意圖，使截短型生存素成為用于在原 核表達系統(例如大腸桿菌）中生成的特別合適的候選物。歸因于其天然的胞質定位，生存 素適應還原環境。在發展過程中，它變得明顯，從而生存素蛋白需要連續的抗氧化保護W維 持結構完整。該要求顯然有利于用于重組生成的胞內祀向。此外，在畢赤(Pichia)系統中進 行的可行性研究掲示生存素的失效的分泌性質。運些考量使大腸桿菌被選擇成為生成宿 主，同時保持胞內蛋白質產物。還決定采用誘導型啟動子系統（Iaclq/T7)，聯合附加體載 體。基于質粒的系統具有如下優勢:在項目進展過程中便于對表達盒進行修飾。通過誘導來 控制表達，允許調節并優化轉錄本水平。其還避免了細胞庫加工中，W及發酵培養物的生長 期過程中的負選擇壓力。
[0146] 大腸桿菌產生的生存素的質譜分析掲示，兩種物質的質量相對于主要形式增加了 + 178和+25細a。該模式指示通過反應性糖衍生物進行的蛋白質修飾，產生所謂的憐酸-葡萄 糖酸化。其產生自具有憐酸-葡萄糖酸內醋的蛋白質中的伯胺基團的自發反應，該具有憐 酸-葡萄糖酸內醋的蛋白質是處于糖酵解和戊糖憐酸通路的界面處的代謝中間體。在初始 憐酸-葡糖酸基蛋白質加合物(+258Da)形成后，存在對葡糖酸基形式的部分水解(+178Da) (參見Geoghegan等，Anal Biochem 267(1): 169-84,1999)。在生存素的情況中，該反應被限 制于Gly2處的a-氨基基團。在測試的表達條件的范圍下，多達12%的生存素蛋白質基于該 機制被修飾。該修飾是不希望的，并且被評價為生產控制方面的風險。還觀察到其可能引起 管控方面的關注。然而，對于去除純化過程中的經修飾物質或避免其通過合適的發酵設置 而產生所做的多項努力均不成功。
[0147] 隨著宿主細胞積累代謝物憐酸-葡萄糖酸內醋，會出現失控的憐酸-葡萄糖酸化。 因此，本發明的目的是提供一種大腸桿菌菌株，其中不發生葡萄糖酸化，然而，通過運些研 究令人吃驚地發現，本發明的葡萄糖酸化的截短型生存素相比非葡萄糖酸化的生存素具有 更多的藥理學活性。
[0148] 因此，發明人開發出一種表達宿主，其本身不使表達的截短型生存素(憐酸)-葡萄 糖酸化。而是，（憐酸)-葡萄糖酸化應在表達之后通過合成的手段和受控的方式進行。然而， 應注意，本發明包括其中葡萄糖酸化是通過天然的或生物工程改造的表達宿主系統獲得 的，截短的葡萄糖酸化的生存素。
[0149] 根據本發明可用于本發明的截短型生存素的表達的合適且優選的大腸桿菌菌株 是大腸桿菌化21(DE3)(諾瓦基公司（Novagen))。然而，該菌株天然地具有內醋酶活性方面 的不足，并將該反應性中間體水解成惰性葡糖酸。運一可購得的菌株根據本發明經生物工 程改造，所述工程改造通過將(憐酸)-葡萄糖酸內醋酶基因引入該表達菌株的基因組來進 行。運一方案完全廢除了憐酸-葡萄糖酸化的和葡萄糖酸化的生存素物質的出現，并且為W 受控的方式通過本領域通曉的合成的手段引入葡萄糖酸化提供了可能。因此，原則上，也可 對內醋酶活性方面不足的其它細菌菌株進行工程改造，進而可用于產生本發明的截短型生 存素。
[0150] 根據本發明，采用由上述生物工程改造大腸桿菌菌株(優選大腸桿菌化21(DE3)) 而產生的菌株，用于用包含本發明的截短型生存素的表達質粒進行轉化。本發明的特異性 的菌株被稱為大腸桿菌T7E2(#1)。
[0151] 為了產生本發明的非糖基化且原始地非葡萄糖酸化的截短生存素，構建質粒，并 通過該質粒轉化大腸桿菌T7E2。該質粒稱為PAL37,并且序列和特征示于圖19和20。當然，本 發明原則上包括該質粒構建體的變體和修飾形式，尤其是帶有先導序列、啟動子序列、限制 性位點、抗生素抗性等的那些。應指出，（合成地)糖基化的截短型生存素（W修飾生存素的 生物和物理性質）的應用也涵蓋在本發明的要點中。
[0礎修飾反應(葡萄糖酸化)
[0153] 通過細菌表達宿主表達時，本發明的截短型生存素優選是非葡萄糖酸化的。為了 使生物工程改造的截短型生存素具有受控和所需的葡萄糖酸化率，通過標準方法合成地進 行葡糖酸基殘基的引入。葡萄糖酸化通過使游離氨基基團與標準葡糖酸化試劑(例如葡萄 糖酸-1,5-內醋)反應來實現（圖15A)。本發明的截短型生存素中的可能的游離氨基殘基是： 切割掉甲硫氨酸殘基之后的SEQ ID N0:2的位置2的甘氨酸，和SEQ ID N0:3的位置1的甘氨 酸。此外，用于葡萄糖酸化的候選物是截短的分子中的所有賴氨酸殘基，盡管賴氨酸23和賴 氨酸103(SEQ ID NO 2)或賴氨酸22和賴氨酸102(SEQ ID N0:3)是優選的賴氨酸殘基，因為 運些位置處的葡萄糖酸化產生具有最佳藥理學性質的生存素。
[0154] 根據本發明，具有本發明的葡萄糖酸化的截短型生存素的疫苗觸發的體內免疫應 答強于具有相同但非修飾的生存素的相應疫苗。
[0155] 宿主細胞介導的生存素的葡萄糖酸化作為采用的大腸桿菌菌株(例如化2UDE3)) 中的次優代謝情況的不希望的后果而產生。觀察到低可及程度的修飾(至多12%)和對于該 事件的受限的控制不利于利用該機制。為了進行較寬修飾范圍下的生存素葡萄糖酸化的電 位藥理學益處的系統性評估，已設計一種合成方案作為替代。使源自表達菌株T7E2#1的非 修飾的生存素 DS批次與葡萄糖酸-1,5-內醋反應。修飾程度隨著葡萄糖酸-1,5-內醋提供的 量而增加。實現的修飾水平高達80%，優選65%-80% (圖15B)。
[0156] 該反應保持了對于位于Gly2(SEQ ID N0:2)或GlyUSEQ ID N0:3)處的a-氨基基 團顯著的選擇性，運可能歸因于其獨特的地a性質。然而，觀察到低于兩種處于低水平的賴 氨酸殘基的提高的內醋濃度修飾。可用采用正交檢測原則的兩種方法來定量生存素的葡萄 糖酸化水平(基于電荷的cIEF，基于質量的ESI-MS，基于固定相相互作用性質的RP-HPLC)。 歸因于內醋在水性溶液中的自發水解，其必須W粉末形式添加，并且摩爾量相對蛋白質組 分顯著過量。除了葡萄糖酸化試劑的量W外，還評價了關鍵反應參數如溫度、反應時間和抑 的影響（圖15C)。
[0157] 所用緩沖系統、包括的抗氧化劑的制劑可行性
[0158] 在本發明的截短型生存素的開發的構架中，進行了對緩沖介質的調整。具有優化 的特點的一種合適的配制緩沖劑包含50mM化-P、150mM化Cl、lmMDTT，pH7.5。由于DTT未 被衛生當局批準，需要根據批準的抗氧化劑重新設計緩沖組合物。此外，探索了緩沖鹽系統 的類型、抑和單價鹽濃度，W確定生存素構建體的最優穩定性范圍。結果可匯總如下：
[0159] 乙醇和叔下醇在5-20%的范圍中測試。采用遞增的溶劑濃度，在25°C下5天之后觀 察到增加的氧化二聚作用。至少采用5%叔下醇檢測到二聚作用。
[0160] 截短型生存素顯示pi為6.1。當在4-9的范圍內進行抑滴定時，在5.0<抑<6.0檢測 到穩定性最低值，且在運些抑值下對應于凈分子電荷時出現沉淀。在不添加抗氧化劑的情 況下檢測時，化學穩定性(氧化)在>7.0的較高抑值下顯著地降低。通過向制劑導入150mM 化Cl，pH 6下的抑穩定性驚人地增強。在最優鹽濃度，API可在6-8的pH范圍中被穩定化，其 中，最優穩定性出現在抑6-6-5。顯示化Cl在接近dC-生存素的Pl附近的抑值下使該分子穩 定。此外，還證明其在在載藥的含R-DOTAP的脂質體的加工過程中是關鍵組分。在不具有或 具有不足的NaCl濃度(<150mM)的情況下，蛋白質在陽離子脂質體的存在下沉淀。
[0161] 最終優選的緩沖組合物確定為由如下賦形劑組成：20mM K2HP化、150mM KCUlOmM MTG，pH 7，然而，組成和含量的變化形式也在本發明范圍內。
[0162] 在保護本發明的截短型生存素不受氧化損傷方面，測試了如下抗氧化劑:抗壞血 酸、亞硫酸鐘、亞硫酸鋼、硫代硫酸鋼、半脫氨酸、甲硫氨酸、單硫代甘油、甲醒橫酸鋼，和沒 食子酸丙醋。所有運些賦形劑W根據FDA成分列表的市售胃腸外產品形式使用。抗氧化劑性 能在25°C解育5天后測試。結果顯示了單硫代甘油(MTG)優于其它抗氧化劑的優越性。僅 MTG、甲硫氨酸和硫代硫酸鋼在測試方案中防止了氧化。沒食子酸丙醋和抗壞血酸造成了不 希望的反應并且導致測試樣品變色。MTG濃度WO-IOmM在20mM K2HP化、150mM KCl，pH 7.0中 滴定。氧化的防止(25°C下5天)依賴于MTG濃度。
[01創用于本發明的脂質體制劑中的脂質和憐脂
[0164] 多種脂質化合物和衍生物可用于制備本發明的脂質體顆粒的脂質組分。所述脂質 體制劑通常包含脂質化合物，例如膽固醇或O-生育酪、陽離子憐脂和中性憐脂。陽離子組分 是本發明必需的，W抵消用于本發明的脂質體制劑中的生存素片段的負電荷。
[0165] (A)手性陽離子憐脂
[0166] 陽離子憐脂組分優選具有手性性質，因為分離的對映體形式顯示增加的生物學和 藥學功效。它們可W優選自：R，S D0TAP、R-DOTAP、S-D0TAP、R,S DOTMA、R-DOTMA、S-DOTMA、 R，S DOEPC、R-DOEPC和S-DOEPC，但不限于運些試劑。
[0167] 截短型生存素脂質體的制劑可行性由截短型生存素和佐劑組分(優選R-D0TAP)的 固有的不相容性主導。圖1給出了關于該現象的示意，其歸因于生理條件下DOTAP的永久正 電荷與生存素的凈負電荷之間的不受控的相互作用。在制劑開發的過程中，一項主要目標 是抑制不希望的靜電相互作用，同時使每脂質體的DOTAP含量最大化。DOTAP的作用不只是 作為脂質體雙層的部分的脂質組分，還作為佐劑在疫苗接種方案和設定(本文中，關于截短 型生存素）中發揮強力作用。
[0168] 通過在0-50% (mol/mol)范圍中滴定D0TAP，能夠證明可在0-30% (mol/mol)D0TAP 的范圍內控制電荷相互作用。此外，能夠顯示DOTAP和一種中性脂質組分的混合物不導致設 想的目標尺寸的顆粒。將D0TAP、膽固醇和一種PCW獨特的比例混合時，獲得優選的結果，所 述比例例如：10-30%，優選約20%(±1%)3-0014?;25-55%，優選約45%(±1%)膽固醇； 和30-60%，優選約35% ( ± 1 % 化PC(mol/mol)。
[0169] (B)其它脂質和憐脂
[0170] 發現電荷相互作用的控制可通過向脂質體雙層導入中性脂質組分(憐脂酷膽堿 (PC)，包括卵P(XEPC)、膽固醇和生育酪)來實現。合適的中性憐脂的示例有:憐脂酸(憐脂酸 鹽KPA)、憐脂酷乙醇胺(腦憐脂）（PE)、卵憐脂(蛋黃素）（PC)、憐脂酷絲氨酸(PS)、憐脂酷肌 醇(PI)、憐脂酷肌醇憐酸(PIP)、憐脂酷肌醇二憐酸(PIP2)，和憐脂酷肌醇=憐酸(PIP3)。
[0171] 此外，合成的憐脂衍生物可用于本發明：
[0172] ?憐脂酸(DMPA、DPPA、DSPA)
[0173] ?卵憐脂（DHPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DEPC)
[0174] ?憐脂酷甘油(DMPG、DPPG、DSPG、POPG)
[0175] ?憐脂酷乙醇胺(DMPE、DP陽、DSPE DOPE)
[0176] .憐脂酷絲氨酸(DOPS)
[0177] ^給出了優選用于本發明來制備本發明的脂質體制劑的脂質的概況。
[017 引
[0179] 除了 S元混合物，還研究了 D0TAP、膽固醇和一種憐脂更復雜系統的混合物，尤其 著重于模擬和替代制劑組分類脂EPC中的脂肪酸組成。作為主要PC，該混合物包含DSPC、 DPPC、POPC和DOPC。兩種限制復雜EPC被運些制劑組分中的兩種的混合物替代。圖2、3和4示 例了輔助脂質組合物對脂質體的制劑可行性和穩定性的影響。盡管DSPC在在制劑特點方面 顯示有限的合適性，DOPC和DPPC或DMPC和DPPC的混合物顯示良好的制劑穩定性。DPPC和 DOPC在相關濃度范圍內滴定，并且，當分別滴定2-32% (mol/mol)的DOPC和3-32%的DPPC 時，僅顯示PSD的微小變化。
[0180] 糖基化的脂質體和鹽濃度減少
[0181] 在初步試驗中，證明單價離子的濃度對于分散穩定性而言是重要的。盡管在液體 制劑中不那么重要，但凍干或冷凍制劑在150mM KCl的鹽含量處存在凝固點的問題。發現-與標準PC不同-脂質體雙層中PEG化憐脂的存在降低了制劑對于減少的鹽含量的敏感度。圖 5顯示，在IOOmM KCl(標準150mM)下的制劑試驗，和在該條件下對于蛋白質/制劑沉淀的驚 人效果。相反，圖6顯示在50mM KCl鹽含量下的制劑選擇的概況。可見，在制劑中引入低至 3% (mo 1/mo 1)的DS陽-PEG2000允許產生載有生存素的脂質體。在1 -2%DS陽-PEG2K，制劑顯 示沉淀和粒徑分布(PSD)的顯著增加。
[0182] 運些結果顯示（圖6)，如前所述，憐脂或脂質體顆粒的PEG化在本發明的截短型生 存素的可能的沉淀方面促進了脂質體制劑的穩定性。然而，不利的是，相較于具有相同含量 和組成的非PEG化顆粒，包含生存素的PEG化脂質體顆粒顯示降低的抗腫瘤功效和減小的 CD47CD8+T細胞活性。
[。側脂質體的冷凍和凍干
[0184] 測試了 S種不同的制劑在-70°C的冷凍和凍干：
[01 化]D0TAP/EPC/CH0 20/35/45( % 比例）
[01 化]D0TAP/C冊/D0PC/DS陽-PEG2K 20/45/32/3( % 比例）
[0187] D0TAP/C冊/D0PC/DS陽-PEG2K 20/45/30/5( % 比例）
[0188] 不同的冷凍保護劑(例如，海藻糖或薦糖）的可行性測試顯示薦糖在凍干后維持脂 質體尺寸分布方面的優越性。因此，滴定了不同的薦糖濃度，W確定最優尺寸維持的范圍。 設定濃度為0%、2.5%、5%、7.5%和10%薦糖(巧八）。
[0189] 發現約10%的薦糖是最優的，但干擾體內功效。因此，基于脂質組分D0TAP/CH0/ EPC和2-3%薦糖(w/w)，優選約2.5%薦糖的冷凍分散物脂質體引發最優物理化學和體內藥 學活性。
[0190] 此外，發現在免疫應答方面，包含PEG2K的制劑劣于非PEG化形式。
[019。體內實驗
[0192] (i)DOTAP濃度的影響
[0193] 為了研究DOTAP濃度/疫苗接種丸劑的影響，脂質體數量W及由此的DOTAP的濃度 在0.7mM~TmM DOTAP范圍內變化。圖7顯示疫苗接種了安慰劑脂質體(P丄.）或包封了生存 素蛋白質的脂質體的小鼠的相應的CD4+和CD8+T細胞應答。然而，在佐劑含量和CD8+T細胞應 答之間觀察到劑量依賴性關系（圖7A)，注意到在最高的DOTAP濃度損失了SVN特異性CD4+T 細胞增殖。該結果指示，2~7mM R-DOTAP的DOTAP濃度是最優的，其在最高DOTAP濃度(7mM) 具有朝向SVN特異性CD8+T細胞的優先偏斜。此外，圖7中的數據顯示，在疫苗制劑中的DOTAP 中等濃度(例如，2mM)處同時存在CD4+和CD8+SVN特異性T細胞應答。為了進一步說明相關的 濃度范圍，將第二研究設定為比較2mM和4mM R-DOTAP(圖8)。結果指示，在誘導SVN特異性 CD4+T細胞增殖（圖8A)和產生IFN-丫的CD8+T細胞（圖8B)方面，4mM的DOTAP濃度優于2mM。
[0194] (ii)抗原荷載的影響
[01巧]本發明的脂質體（例如，IOOnm脂質體、IOmM脂質、20%0014口、35%6口(：、45%膽固 醇)載有不同程度的生存素(0、0.1 mg/血、0.5mg/血、1. Omg/mL和1.5mg/mL)和SC(截短的）生 存素 (SEQ ID NO 3)dCD4/CD8應答表明，荷載最優值在0.5-10.〇111邑/1111^之間（圖94)，而細胞 毒性效果的穩定階段似乎在0.1-0.5mg/mL抗原之間達到（圖9B)。尤其，安慰劑脂質體和純 的蛋白質均不引發任何顯著的免疫作用。
[0196] (iii)粒徑的影響
[0197] 本發明的脂質體(例如aOOnm對比2(K)nm脂質體)在不同的粒徑在疫苗生物活性的 影響方面進行比較。圖10顯示，在兩次疫苗接種后，CD8+活化的差異。粒徑為180-350nm，優 選200-25化m的脂質體在測試設定中顯著地增大了免疫應答。該結果表明，約20化m的粒徑 非常適用于疫苗應用。
[0198] (iv)脂質組合物的影響
[0199] 出于項目歷史原因，所有早期試驗均采用包含20%D0TAP/35%EPC/45%膽固醇 (mol/mol)的脂質體進行。EPC是不同的憐脂酷膽堿的相當粗制的混合物，主要由具有C16、 C18和C18:1脂肪酸的PC組成。在確定其它制劑組成W獲得脂質體的優越物理化學穩定性和 降低制劑的復雜度方面做出了很多努力。EPC能夠被作為憐脂組分的DMPC有效替代，同時能 夠保持所有其它制劑參數，例如尺寸、表面電荷和抗原荷載。建議的制劑由20mM 20 % D0TAP/50 %DMPC/30 %膽固醇(mol/mol)組成，并且經過免疫學動物研究。數據顯示，當用合 成的輔助脂質替代EP別寸，完全損失免疫活性(圖11)。
[0200] 在第二組實驗中，評價PEG化脂質體的免疫原性。脂質體由20%D0TAP/45%膽固 醇/32 %D0PC/3%DSPE-PEG2000組成，或由 20 %D0TAP/45 %膽固醇/30%D0PC/5 %DSPE-PEG2000組成，并且其針對標準含EPC的脂質體進行測試（圖12)。在2次和4次疫苗接種之后 記錄CD8應答。數據表明，1)在引發特異性的細胞毒性應答方面，3%PEG化具有優越性，和2) 在4次疫苗接種之后，免疫應答進一步增大。與含DMPC的脂質體相類似，CD8+T細胞的頻率遠 低于用含EPC的脂質體進行疫苗接種之后的情況。當引入低量的DSPE-PEG2000時，脂質體小 得多。尚不清楚活性的損失主要由顆粒表面上的PEG遮蔽介導還是由減小的粒徑(可能會導 致從免疫系統的識別下逃逸)介導。因此，進行采用最優化的粒徑（約200nm)和DOTAP濃度 (4mM R-DOTAP)的另一組實驗(參見圖13)。同樣地，在PEG化制劑僅能檢測到溫和的免疫活 化，而對于具有0 % PEG化的基于陽離子EPC的制劑而言觀察到強應答。
[0201] (V)凍干制劑的性能
[0202] 歸因于生存素蛋白質在水性環境中固有的穩定性，需要確定用于長期膽存產品的 替代形式。開發了用于保持脂質體的物理化學性質的凍干方案。其包括向制劑添加冷凍保 護劑。制劑緩沖液中，約25-150mg/mL，優選100-150mg/mL的薦糖濃度顯示能夠有效地保持 相關疫苗的參數(粒徑、電荷、藥物荷載）。圖14說明疫苗接種方案，W及重建的凍干制劑相 較于同等脂質組合物的液體制劑的相應的CD8+讀出值。可見，凍干制劑的細胞毒性降低。
[0203] 上述結果清楚地顯示，能夠在陽離子脂質體中配制120aa(源自SEQ ID N0:1)的截 短型生存素變體。該制劑允許具有強且可再生的佐劑能力，如果采用DOTAP(優選R-D0TAP)， 運取決于脂質顆粒的尺寸和組成。制劑試驗掲示，脂質體穩定性和特點取決于對制劑組分 的謹慎選擇。盡管純的R-DOTAP不適于配制敏感抗原，但D0TAP、膽固醇和憐脂酷膽堿組分的 混合物允許產生根據目標概況穩定的脂質體。特殊的相關性在于脂質體基質中引入的PEG 化脂質，因為運些顯著地降低了生存素和R-DOTAP之間的不希望的靜電反應，并且允許W減 少含量的單價離子進行產生和膽存。
[0204] 體內結果強調了制劑參數對于疫苗的佐劑性能的重要性。在約2(K)nm(150-300nm) 的粒徑下，3-5mM，優選3.5-4.5mM，更優選4mM R-DOTAP被鑒定為最優佐劑濃度。并且，證明 脂質組合物對于疫苗而言具有最外部(outmost)的重要性。引入作為制劑組分的DMPC使疫 苗失活，而采用D0TAP、EPC和膽固醇的混合物能檢測到強且穩健的作用。PEG化脂質和薦糖 的添加降低了疫苗的功效。但甚至在lOOmg/mL薦糖的情況下仍能記錄到細胞毒性作用。通 過將薦糖濃度減少至50-25mg/mL，增強了體內性能。
[02化]組合治療
[0206]在另一方面，免疫治療劑的給予有利于同時或依次與本發明的脂質體疫苗接種組 合物聯用。本發明的合適的免疫治療劑有，例如，抗癌癥抗體，例如抗VEGF(R)抗體，抗EGFR 抗體如貝伐單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗、埃羅替尼、吉非替尼和阿法替尼，或抗PDLl抗體， 例如如WO 2013/079174中所公開。抗體可優選通過其C末端重鏈融合至細胞因子，例如IL- 2^冊日、伴佩和比12。
[0207] 在本發明的一個優選實施方式中，已知的融合蛋白NHS-IL12和NHS-IL2 (Selectikine),優選NHS-IL12,與本發明的脂質體制劑聯用。NHS-IL12是融合蛋白，其包含 通過核細胞結合至腫瘤的壞死核屯、（"TNT"抗體，參見WO 2000/001822)的已知人抗體NHS76 的重鏈，其中所述抗體在其C末端共價融合至IL-12的p40和/或p30亞基(經修飾），并且具有 潛在的免疫刺激和抗腫瘤活性。給予后，免疫細胞因子NHS-IL12的抗體部分結合至從主要 定位于壞死的固體腫瘤的核屯、處的壞死的腫瘤細胞釋放的DNA，由此遞送IL-12部分。進而， 該試劑的IL-12部分刺激宿主免疫系統增加針對腫瘤細胞的免疫應答，由此抑制腫瘤生長。 比-12是促炎性細胞因子，其具有多種免疫調節功能，并且可增大宿主對于腫瘤細胞的免疫 應答。通過祀向腫瘤細胞，NHS-比-12可W降低與重組人IL-12的全身性給予相關聯的毒性。
[0208] 基于本發明的截短型生存素的，用于治療多種癌癥(優選卵巢癌癥)的優選的組合 療法包括(圖21-24):
[0209] ?與低劑量環憐酷胺(CPA)組合:發現低劑量CPA增強了免疫應答，并且已知運通 過CD4_25-Treg細胞的消耗介導。在數個癌癥疫苗臨床試驗中也觀察到了CPA活性。在DPX-Survivac I期研究中，還顯示節律式低劑量CPA可直接增強DPX-Survivac的免疫原性。
[0210] ?與抗PD-Ll組合:疫苗的常規基本原理是對APC的活化和對抗原特異性CTL介導 的免疫應答的刺激。然而，在慢性腫瘤抗原刺激的設定中，CD8T細胞經歷耗竭，使它們變得 功能失調。盡管多種機制會促進耗竭過程，但PD-Ll是最為成熟表征的上調的抑制性分子， 并且與疾病進展和免疫功能失調相關聯。PD-Ll的阻塞已顯示對于在臨床試驗中增加腫瘤 清除率的有效性。因此，認為本發明與抗PD-Ll的組合將會促進CTL應答。此外，已在至少于 一線化療中失敗的卵巢癌癥患者中研究了抗PD-LU18%的卵巢癌癥患者(n = 17)能夠達到 疾病穩定至少6個月。
[0211] ?與NHS-IL12的組合:NHS-IL12是IL-12的祀向遞送，其經建議W使該細胞因子成 為更安全、更有效的癌癥療法。化-12設及原初T細胞向Thl細胞的分化，其可刺激T細胞的生 長和功能。其刺激從T和NK細胞產生IFN- 丫和TNF-a，并減少化-4介導的IFN- 丫抑制。化-12 還具有抗血管生成活性，運意味著其能夠阻斷新血管生成。因此，建議將本發明的截短型生 存素與上述藥物或其它抗癌癥藥物組合W增強總體抗腫瘤活性。
[0212] 本發明的疫苗組合物還可額外包含其它化合物，所述化合物已知具有免疫刺激 性，例如CpG或環憐酷胺。CpG核酸優選包含至少一種或多種(促有絲分裂的)胞喀晚/鳥嚷嶺 二核巧酸序列(CpG基序）。在某些實施方式中，本發明的脂質體制劑或疫苗組合物的功能與 促進免疫應答的效應物分子相呼應。例如，所述效應物分子可W是細胞因子部分，包括但不 限于，比-2、比-7、化-12、比-18、比-21、化-23、GM-CSF或任何其它細胞因子，尤其是能夠激 活化I免疫應答的因子。所述效應物分子還可W是抑制免疫系統的細胞因子的抑制劑，例 如，STAT3抑制劑。
[0213] 治療應用
[0214] 在一個方面中，本發明設及本文所述的脂質體制劑或本文所述的免疫刺激性疫苗 在制備用于預防或治療癌癥或癌癥相關的疾病的藥物中的應用，其中所述癌癥或癌癥相關 的疾病基于生存素特異性腫瘤細胞的存在。在一個優選方面中，所述脂質體制劑與選自下 組的抗癌劑聯用:環憐酷胺、卡銷、紫杉醇和NHS-IL12。
[0215] 在一個方面中，本發明設及預防或治療有需要的個體中的癌癥或癌癥相關的疾病 的方法，其中所述癌癥或癌癥相關的疾病基于所述個體中生存素特異性腫瘤細胞的存在， 所述方法通過給予所述個體治療有效劑量的本文所述的免疫刺激性疫苗來進行。在一個優 選方面中，本發明設及通過額外給予選自下組的抗腫瘤劑:環憐酷胺、卡銷、紫杉醇和NHS-IL12來進行治療的方法。
[0216] 因為生存素似乎在大多數癌癥形式中表達，本發明的疫苗組合物或脂質體制劑很 可能能夠用于控制其中表達生存素的任何類型的癌癥疾病。
[0217] 因此，作為示例，本發明的組合物和制劑針對惡性血液病(包括慢性淋己性白血病 和慢性骨髓性白血病）、黑素瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、膜腺癌和前列腺癌 具有免疫活性。該治療應用包括給予患有所述疾病的患者有效量的本發明的藥物組合物。
[0218] 根據本發明，本發明的疫苗組合物或脂質體制劑還可包含藥學上可接受的運載體 和/或其它輔助物質和添加劑和/或佐劑。
[0219] 本發明制劑通常包含安全且有效的量的上述截短型生存素多膚。本文中所用的" 安全且有效的量"指，一定量的本發明的截短型生存素，其足W顯著誘導對于癌癥(例如，肺 癌或卵巢癌）的積極改善。然而，同時，"安全且有效的量"足夠小W避免嚴重副作用，即，允 許在優勢和風險之間存在一個合適的關系。對于運些限制的確定通常處于合理醫學判斷的 范圍內。關于本發明的藥物物質，表述"安全且有效的量"優選指一定量的本發明的截短型 生存素，其適于W如下方式刺激適應性免疫系統:不造成過度或破壞性的免疫反應，但優選 地，也沒有處于可檢測水平W下的免疫反應。"安全且有效的量"還關于如下因素而變化:待 治療的具體病癥W及待治療患者的年齡和身體狀況、病癥的嚴重程度、治療時長、伴隨性治 療的性質，所用的具體藥學上可接受的運載體，和類似因素，運可根據隨診醫生所掌握的知 識和經驗來確定。本發明的脂質體或疫苗制劑可根據本發明用于人，也可用于獸醫學目的， 作為藥物組合物用于疫苗接種。
[0220] 本文所用的表述"藥學上可接受的運載體"優選包括本發明脂質體或疫苗制劑的 液體或非液體基質。如果本發明的脂質體制劑或疫苗組合物W液體形式提供，該運載體將 通常是無熱原的水;等張鹽水或帶緩沖的（水性）溶液，例如，憐酸鹽或巧樣酸鹽緩沖的溶 液。
[0221] 本發明的免疫原性疫苗組合物的量可根據具體應用而變化。然而，在各種情況中， 單劑量疫苗優選是約IOyg-約5000yg，更優選約50yg-約2500yg，例如，約IOOiig-約lOOOiig。 在本發明的一個優選實施方式中，脂質體制劑的單一劑量根據本發明可包含500-1，20化g 的所述脂膚，更優選700-90化g。在本發明的一個優選實施方式中，通過本發明的脂質體制 劑進行的疫苗接種伴隨著給予100-400mg/m 2,優選250mg/m2的環憐酷胺，通過運種方式能夠 激活或增強患者的免疫系統。通常，在疫苗接種開始之前，一般1~5天，優選2~5天的單劑 量應足夠有效，然而其它不同的方案也是可用的。
[0222] 給予模式包括皮內、皮下和靜脈內給予、W時間控釋制劑形式植入等。本文涵蓋本 領域抑制的任何和所有給予形式。還涵蓋適于配制可注射的免疫原性膚組合物的本領域已 知的任何和所有常規劑型，例如凍干形式和溶液、懸液或乳液形式，其必要時包含常規的藥 學上可接受的運載體、稀釋劑、防腐劑、佐劑、緩沖組分等。
[0223] 在本發明的另一個方面中，本發明的疫苗組合物和脂質體制劑可與其它藥學上有 效的制劑和藥物聯合，運在下文中將做詳細描述。
[0。4] 化療/放療
[0225] 本發明的疫苗接種方法還包括"化-放療"。本發明的化-放療包括"化療"。化-放療 也包括通過按照標準方法福照進行或通過給予帶放射性標記的化合物進行的"放療"。根據 本發明，福照是優選的。
[0226] 本文所用的術語"細胞毒性試劑"指的是一種物質，其通過造成細胞損毀來抑制或 阻止細胞功能。該術語意在包括放射性同位素、化療劑、免疫治療劑，和毒素，例如具有酶促 活性的細菌、真菌、植物或動物源性的毒素，或其片段。該術語還可包括細胞因子家族的成 員，優選IFN 丫，W及還具有細胞毒性活性的抗腫瘤試劑。
[0227] 術語"抗癌劑"或"抗腫瘤劑"描述有效于癌癥/腫瘤治療的所有試劑。該術語包括， 細胞毒性劑、化療劑，和免疫治療劑。
[0228] 本發明的化-放療通常W化療起始，隨后是放療。然而，W放療起始治療也是可行 的。化療通過給予至少一種"化療劑"，優選基于銷的藥物，例如順銷或卡銷來進行。根據本 發明，化療劑每天、每周或每2~5周給予，運取決于給藥時程和給予的次數。
[0229] 本發明的化療包括給予化療劑，其根據本發明的理解是細胞毒性劑類別的一員， 并且包括直接對腫瘤細胞，且不間接通過其它機制（例如生物反應調節）發揮抗腫瘤作用 (即，防止腫瘤細胞的發育、成熟或擴散)的化學劑。
[0230] W本發明的化-放療設定給予的本發明優選的化療劑有:基于銷的試劑，例如J員 銷或卡銷。然而，也可使用如下所述的其它化療劑。
[0231] 此外，可給予額外化療劑或其它抗癌劑W促進請求保護的治療的功效。市售應用、 臨床評價和臨床前開發中存在大量的抗腫瘤試劑，其可包括在本發明中，用于通過聯合治 療來治療腫瘤/腫瘤形成。應指出，化療劑可任選地與上述脂質體制劑一同給予。化療或化 療劑的示例包括烷基化試劑，例如，氮芥、乙亞胺化合物、烷基橫酸醋/鹽和具有烷基化作用 的其它化合物，例如亞硝基脈、順銷和達卡己嗦;抗代謝物，例如，葉酸、嚷嶺或喀晚括抗劑； 有絲分裂抑制劑，例如，長春花生物堿和足葉草毒素的衍生物;細胞毒性抗生素和喜樹堿衍 生物。優選的化療劑或化療包括氨憐汀巧thyol)、卡己他賽、順銷、達卡己嗦(DTIC)、放線菌 素 D、多西他賽、二氯甲基二乙胺、鏈脈菌素、環憐酷胺、卡莫司汀（BCNU)、環己亞硝脈 (CCNU)、阿霉素（亞德里亞霉素）、阿霉素脂質體(Doxil)、吉西他濱(健擇）、道諾霉素、道諾 霉素脂質體(Daunoxome)、甲基節阱、酬康挫、絲裂霉素、阿糖抱巧、依托泊巧、甲氨蝶嶺、五 氣尿喀晚(5-FU)、長春花堿、長春新堿、博來霉素、紫杉醇（紫杉酪）、多西他賽(泰素帝）、阿 地白介素、天冬酷胺酶、白消安、卡銷、克拉屈濱、喜樹堿、CPT-lUlO-徑基-7-乙基-喜樹堿 (SN38)、達卡己嗦、氣尿巧、氣達拉濱、徑基脈、異環憐酷胺、伊達比星、美司鋼、干擾素 a、干 擾素 e、伊立替康、米托蔥釀、拓撲替康、亮丙瑞林、甲地孕酬、美法侖、琉嚷嶺、普卡霉素、米 托坦、培口冬酶、噴司他下、贓泊漠燒、普卡霉素、鏈脈菌素、它莫西芬、替尼泊巧、睪內醋、硫 鳥嚷嶺、嚷替派、烏拉莫司汀、長春瑞濱、瘤可寧，及其組合。
[0232] 在本發明的一個優選實施方式中，提供脂質體制劑，其中化療劑選自下組:順銷或 卡銷，并且非銷基的化療劑選自下組:長春瑞濱、依托泊巧、紫杉醇、多西他賽、長春地辛、吉 西他濱、異環憐酷胺和培美曲塞，優選紫杉醇。
[0233] 根據本發明施加化療，通常通過至少兩個周期，優選2-8個周期，更優選2-5個周期 來進行。一個周期為21~35天，優選21~28天。化療劑的給藥方案取決于不同可能的患者和 藥物相關的狀況與性質。通常，順銷W每周期50-120mg/m2的劑量施用。卡銷或紫杉醇可根 據本發明W每周期和每單劑量IOO-ISOOmg施用。
[0234] 放療根據本發明通過標準福照進行，其中施加總計40-120Gy，優選至少50Gy，更優 選50~75Gy。放療通常分級進行，其中1.5-3.5Gy每天施加持續至少四天，優選依次5-7天。 根據本發明待施加的總福照劑量在21-35天范圍內，優選28天內。必要時或有利時，可在福 照開始時或在中間間隔時施加3.5- 15Gy，優選5- IOGee的加強劑量。
[0235] W下實施例W更具體的方式描述本發明，但不限制本發明的范圍。 實施例
[0236] 實施例1:材料
[0237] 本發明中施用的憐脂物質列于表KDOTAP獲自默克密理博公司（Merck Millipore)，且膽固醇購自西格瑪奧德里奇公司（Sigma Al化ich)。所有其它脂質獲自德國 脂質有限公司化ipoid AGKdC-生存素如下所述制備并由在C末端截短的人生存素的氨基 酸序列組成，W獲得更優的穩定性特點和更好的可制造性。其包含人生存素的氨基酸2-120 (SEQ ID N0:3)，并且具有如下特點:分子量13.81^)曰，等電點6.0和烙點48°(：。
[0238] 實施例2:來源菌株大腸桿菌化21 (DE3)的工程改造和大腸桿菌T7E2菌株作為用于 本發明的截短型生存素的表達菌株的制備
[0239] 來源菌株大腸桿菌化21 (DE3)(諾瓦基)工程改造如下：
[0240] ?大腸桿菌BL21(DE3)的引入（incoming)分析
[0241] ?改變大腸桿菌化21 (DE3)基因組巧SL基因 W獲得鏈霉素抗性表型
[0242] ?用大腸桿菌化21(DE3)STR基因組背景中的loxP-cmR-loxP盒替代非必要的DE3 原隧菌體區
[0243] ?用大腸桿菌化21(DE3)STR L'lDE3:loxP-cmR-loxP遺傳背景中的合成的Pgl基 因替代Rac原隧菌體
[0244] ?移除IoxP-偵賠的氯霉素標志物
[0245] 大腸桿菌化21 (DE3)的基因組序列[gb#CP00 1509.3巧日Artemi S軟件（Rutherford 等，Bioinformatics 16(10):944-5,2000)用于計算機虛擬（in-siIico)菌株工程改造。大 腸桿菌化2UDE3)在補充有心亮氨酸（0.04mg/mL)的LB Vegitone肉湯和瓊脂或麥芽糖M9-小板(0.4% )上有氧增殖。必要時，氨節青霉素(Ap)、氯霉素（Cm)、卡那霉素化m)、鏈霉素 (Str)和四環素(Tc)分別添加至最終濃度 50flg/mL、15flg/mL、15flg/mL、50flg/mUP3flg/ ITlL O
[0246] 為了確保來源菌株大腸桿菌化21(DE3)(購自諾瓦基）不具有葡萄糖酸化作用，生 物工程改造菌株基因組DNAdBL21(DE3)基因組包含多種原隧菌體。存在潛在的風險，即在某 些生理條件下，運些中的一些可能會變得具有活性W產生感染性隧菌體顆粒。ADE3隧菌體 的存在退回到T7聚合酶(T7-RNAP)向細菌基因組的導入。為了進一步減少活動的機會，已在 表達菌株中刪除了位于T7-RNAP基因上游的38.3千堿基的DE3原隧菌體序列。此外，在引入 憐酸-葡萄糖酸內醋酶基因拷貝的過程中刪除Rac原隧菌體基因座。根據本發明的所得菌株 是大腸桿菌T7E2(#1)并且特征為具有如下遺傳特點：（i)鏈霉素抗性，運歸因于基因組rpsL 中的點突變，導致Lys43Arg交換（后續基于rpsL的逆選擇的先決條件），（ii)無標記移除 89.1 %的DE3-原隧菌體，不破壞T7RNA-聚合酶基因和功能，和（i i i )用源自大腸桿菌MG 1655基因組序列的合成的口旨^基因替代Rac-原隧菌體。
[0247] 實施例3:用表達質粒PAL37轉化大腸桿菌T7E
[0248] 來源質粒是祀T42(諾瓦基），其通過PAL28最終設計成最終表達質粒pAL37dpLA37 的質粒DNA完全示于圖20并且由SEQ ID NO: 4代表。相應的限制性內切酶的限制性位點示于 圖19。質粒AL37包含編碼截短型生存素序列SEQ ID N0:2(SEQ ID N0:1的l-120aa)的DNA， 該截短型生存素從其表達后釋放進入介質，第一甲硫氨酸殘基被切割掉，由此得到代表性 的截短型生存素沈Q ID N0:3(SEQ ID N0:1的2-120aa)。
[0249] 對于轉化，大腸桿菌T7E2#1細胞在冰上溶解，添加化I的質粒al37并在冰上解育30 分鐘，在42°C解育30秒，并再次于冰上解育2分鐘。然后，添加25化1無抗生素的LB Vegitone 肉湯，并在37°C解育60分鐘，W45化pm振蕩。培養物鋪板于補充有卡那霉素和鏈霉素的LB Vegitone瓊脂板并在37°C解育過夜。
[0250] 來自該板的細胞用于產生通過=重劃線而具有單個集落的瓊脂板。在28°C解育兩 天后，采用小型單個集落來接種具有擋板的IL搖瓶中的200mL化學確定的培養基，W28°C和 16化pm保持過夜用于一次培養物。二次預培養物采用1.44mL的一次培養物接種，供于光學 密度為OD 578皿=0.001。培養物在281：，160巧111下解育約20小時。添加17%甘油和21111甜菜 堿，并使細胞懸液分散在IOxlmL冷凍管中，蓋上蓋子，并將所述管在液氮中速凍，并膽存在 上述液氮中。
[0251 ]為了產生研究工作細胞庫，在各例中，解凍一管第一細胞儲液。采用17化1的儲液 接種具有擋板的IL搖瓶中的200mL化學確定的培養基，W28°C，160巧m解育過夜。添加17% 甘油和2mM甜菜堿，并使培養物分散于SOxlmL冷凍管(供于第一 RWCB)和IOOxlmL管(供于第 二RWCB)中。蓋上蓋子并將管置于細胞冷凍裝置Planer K巧O 10中并冷凍。冷凍之后，處理 結束，并將管小屯、置于冷凍罐中。分析所得物質的特性、純度、活力、革蘭氏染色和污染的隧 菌體。符合所有可接受的標準。
[0252] 實施例4:本發明的截短型生存素的葡萄糖酸化的方案
[0253] .獲自實施例3的截短型生存素經凝膠過濾進入緩沖液
[0254] ? 125mg生存素（5mg/mL)在25°C水浴中攬拌
[02W] ?添加固體葡萄糖酸-1,5-內醋，200mM終濃度
[0256] ?時程0-20h，主反應在45分鐘后撤回
[0257] .凝膠過濾 [0巧引.濃縮
[0 巧 9] ?通過 cIEF、ESI-MS、沈+RP-HPLC 分析
[0260].產出約100mg(80%)，其中總葡萄糖酸化的部分為約65%
[0261 ].反應物在約60分鐘后獲取(抑指示(；L完全水解）
[0262] ?該分辨率下，單和雙修飾動力學之間無差異
[0263] 實施例5:脂質體生成方法
[0264] 向96孔板的各孔添加 22化1的緩沖液或蛋白質溶液。首先將脂質溶解于乙醇，然后 W33iU/孔注射進入含有緩沖液的孔。各制劑重復=次。各孔通過吹打混合。脂質注射通過 Eppendod多吸管分液器W分配模式和速度水平5進行，運對應于約0.5mL/分鐘的水性溶 液。最終混合步驟通過Biohit Proline 12-通道吸管，WP模式和速度水平1進行，運是約 SOmL/分鐘。用于混合的每次吹打體積為10化1，且各孔吹打一次。除非另有說明，最終脂質 濃度為ImM,且生存素濃度為O.lmg/mL。各制劑重復S次。
[02化]實施例6:連續乙醇注射脂質體生產方法
[0266] 采用2mm內徑的娃酬管，WSOmL/分鐘的流速，將緩沖液或蛋白質溶液累入樣品容 器。脂質先溶解于乙醇，然后Wl2mL/分鐘的流速注射進入緩沖流。最終脂質體溶液收集于 樣品容器中。除非另有說明，最終制劑顯示IOmM的脂質濃度和Img/mL的總蛋白質含量。各制 劑重復=次。
[0267] 實施例7:粒徑和C電位檢測
[0268] 脂質體的尺寸測量通過動態光散射采用Malvern Zetasizer化no-ZS儀器進行。 檢測在25°C下W固定的173°反向散射角進行。通過相同的Malvern Ze化sizer化no-ZS儀 器檢測脂質體的C電位。脂質體溶液Wl: 100在水中稀釋。檢測在25°C采用斯莫路科夫斯基 (Smoluchowski)模型進行。
[0269] 實施例8:產生本發明的藥物產品的藥物物質的配制
[0270] 脂質體分散于由如下組分組成的緩沖介質：
[0271] ?脂質組合物：20%R-D0TAP，35%高純度EggPC化?〇,45%膽固醇（全部％111〇1/ mol)
[0272] ?分散物中的總體脂質組合物:20mM
[0273] ?分散介質:20mM憐酸鐘抑7、150mM KCiaOmM單硫代甘油(MTG)
[0274] ?含量dC-生存素:0.8-1. Omg/mL總含量，藥物載量0.6mg/mL
[0275] 包含77mM脂質的憐脂的乙醇溶液通過如下方式制備：稱取107.6mg DOTAP， 207. Img EPC和134.Omg膽固醇于合適的玻璃燒杯中，并用乙醇（>99%純度）添加至lOmL。 API在包含20mM K2HP〇4、150mM KCl、10mM MTG的緩沖液中稀釋。
[0276] 脂質體通過如下方式制備:在t型混合裝置中控制混合乙醇和緩沖溶液。乙醇相的 流速為12mL/分鐘且緩沖液相的流速為SOmL/分鐘。所得的脂質體分散物通過在Slide-A-Lyzer透析盒(MWCO IOkDa，PES)中透析24h(采用5x緩沖液交換）來純化。在最后一步中，月旨 質體通過滲濾法濃縮2x。所得的脂質體通過化S檢測并顯示平均粒徑為約120nm且PDK 0.15。供于進一步處理，脂質體在2.5% (w/v)薦糖的存在下經冷凍或凍干。所得的顆粒顯示 平均粒徑為200-300nm，PDI〉0.15。藥物載量分析掲示有0.6mg/mL的抗原結合至脂質體顆 粒。
[0277] 為了允許凍干樣品，緩沖組合物變成20mM K2HP化。還要求陽離子根據單價鹽中的 鐘進行調整。在由20mM K2HP化、IOmM MTG組成的pH 7.0的緩沖液中進行從0到150mM的KCl滴 定。需要最少30mM KCl來保持DS緩沖液中的蛋白質。為了確保脂質體存在下的可加工性，濃 度提高至150mM KC1。
【主權項】
1. 一種C末端截短型生存素，其由如SEQ ID N0:1所示的全長人生存素的前118-133N末 端氨基酸組成，或與所述截短型生存素具有>90%的同源性的序列，其中，所述截短型生存 素在一個或多個位置經葡萄糖酸化。2. 如權利要求1所述的C末端截短型生存素，其中存在的賴氨酸殘基中的至少一個被葡 萄糖酸化。3. 如權利要求1或2所述的C末端截短型生存素，其由全長人生存素的前120個N末端氨 基酸組成，其中所述截短型生存素如氨基酸序列（SEQ ID NO:2)所示： MGAPTLPPAff QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK〇4. 如權利要求1或2所述的C末端截短型生存素，其中，N末端位置1處的甲硫氨酸殘基被 移除。5. 如權利要求4所述的C末端截短型生存素，其由全長人生存素的前120個N末端氨基酸 組成，其中所述截短型生存素如氨基酸序列（SEQ ID NO:3)所示： GAPTLPPAff QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK。6. 如權利要求4所述的C末端截短型生存素，其中位置1處的甘氨酸殘基被葡萄糖酸化。7. 如權利要求6所述的截短型生存素，其中位置1處的甘氨酸殘基和位置22和/或位置 102處的賴氨酸殘基被葡萄糖酸化。8. 如權利要求1-7中任一項所述的截短型生存素，其中所述葡萄糖酸化以合成方式通 過葡萄糖酸-1，5-內酯來實現。9. 如權利要求1-8中任一項所述的截短型生存素，其中所述截短型生存素是非糖基化 的。10. -種生存素組合物，其包含如權利要求1-9中任一項所述的截短型生存素，和相應 的非葡萄糖酸化的截短型生存素，其中在所述組合物中，10-80%的所述截短型生存素分子 被葡萄糖酸化。11. 如權利要求10所述的生存素組合物，其中，35-45%的所述截短型生存素分子被葡 萄糖酸化。12. -種脂質體制劑，其包含如權利要求1-9中任一項所述的截短型生存素，或如權利 要求10或11所述的生存素組合物，和至少一種佐劑，其中，所述至少一種佐劑是起免疫調節 劑作用的手性陽離子磷脂。13. 如權利要求12所述的脂質體制劑，其中，所述手性陽離子磷脂是DOTAP。14. 如權利要求13所述的脂質體制劑，其中，所述脂質體制劑中的D0TAP的濃度是2 - 8mM〇15. 如權利要求13或14所述的脂質體制劑，其中，所述手性陽離子脂質是R-DOTAP。16. 如權利要求12-15中任一項所述的脂質體制劑，其包含膽固醇和選自下組的至少一 種磷脂:卵磷脂(PC)、磷酸乙醇胺(PE)和磷酸甘油(PG)。17. 如權利要求16所述的脂質體制劑，其中，所述磷脂是選自下組的卵磷脂(PC): DLPC、DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、EPC和EPC3。18. 如權利要求17所述的脂質體制劑，其中，所述卵磷脂是蛋卵磷脂(EPC)。19. 如權利要求12-18中任一項所述的脂質體制劑，其中，所述手性陽離子磷脂佐劑是 R-DOTAP，且其在所述脂質制劑中的含量是15~30%(mol/mol)。20. 如權利要求12-19中任一項所述的脂質體制劑，其包含含量為25-55% (mol/mol)的 膽固醇。21. 如權利要求12-20中任一項所述的脂質體制劑，其包含含量為30-80% (mol/mol)的 卵磷脂(PC)。22. 如權利要求12-21中任一項所述的脂質體制劑，其中所述制劑的脂質體顆粒的顆粒 表面電荷2 17mV。23. 如權利要求12-22中任一項所述的脂質體制劑，其中抗原荷載是0.5-1.5mg/mL。24. 如權利要求12-23中任一項所述的脂質體制劑，其中所述制劑中至少70%的脂質體 顆粒的粒徑為50~500nm。25. 如權利要求12-24中任一項所述的脂質體制劑，其包含 (i)如權利要求10所述的生存素組合物， (i i)脂質組分R-D0TAP、膽固醇和EPC， (i i i)在所述制劑中具有3 - 5mM的濃度的R-D0TAP， (i v)脂質體顆粒，其中至少70 %的所述顆粒的粒徑是50 - 2 50nm，和 (v)0.5mg/mL( ±0. lmg/mL)的抗原荷載。26. 如權利要求25所述的脂質體制劑，其中 (i) 所述截短型生存素如SEQ ID N0:3所示并且是非糖基化的，其中40%(±5%)的所 述截短型生存素被葡萄糖酸化，和 (ii) 脂質組合物的含量是： 10-30%R-D0TAP、 25-55%膽固醇，和 30-60%EPC(mol/mol)。27. -種免疫刺激性疫苗，其包含如權利要求12-26中任一項所述的脂質體制劑，任選 地還包含藥學上可接受的運載體、賦形劑、添加劑或稀釋劑。28. 如權利要求27所述的免疫刺激性疫苗，其通過疫苗接種在人個體的預防或治療中 應用，其中所述個體患有癌癥或癌癥相關的疾病，或具有患癌癥或癌癥相關疾病的傾向，其 中所述癌癥或癌癥相關的疾病基于生存素特異性腫瘤細胞的存在。29. 用于如權利要求28所述應用的免疫刺激性疫苗，其用于治療人個體，其中，所述疫 苗接種觸發所述個體中的生存素特異性免疫應答。30. 用于如權利要求29所述的應用的免疫刺激性疫苗，其中CD4+和/或CD8+T細胞應答被 引發。31. 用于如權利要求28-30中任一項所述應用的免疫刺激性疫苗，其中采用所述疫苗進 行的疫苗接種抑制或阻止腫瘤生長。32. -種藥物組合物，其包含如權利要求12-26中任一項所述的脂質體制劑，或如權利 要求27所述的免疫刺激性疫苗，和選自下組的抗腫瘤劑：環磷酰胺、卡鉑、紫杉醇和NHS-IL12〇
【文檔編號】C07K14/435GK105873941SQ201480068752
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年12月16日
【發明人】S·蓋斯勒, P·伯尼福特, J·普拉什克, M·維岡特, S·杰克爾, R·凱爾納, T·里斯奧克, D·穆勒-珀帕拉, K·漢斯
【申請人】默克專利有限公司