具有增強的光合作用的植物及其生產方法
【專利摘要】公開了具有增強的光合作用的轉基因植物。所述轉基因植物是用編碼異源碳酸氫鹽轉運體的轉基因多核苷酸轉化的。所述碳酸氫鹽轉運體可以來自藻類或藍藻細菌物種。所述轉基因多核苷酸包含在功能性植物啟動子的控制下編碼所述碳酸氫鹽轉運體的核酸序列并可選地包括與所述碳酸氫鹽轉運體異源的葉綠體被膜靶向肽。公開了形成轉基因植物和轉基因多核苷酸的方法。
【專利說明】具有増強的光合作用的植物及其生產方法
[0001] 相關申請的引證
[0002] 本申請要求于2013年12月31日提交的美國申請號61/922,141的優先權，將其公開 內容通過引證整體結合于此。
[0003] 政府支持聲明
[0004] 本發明是部分W來自美國能源部的政府支持完成的。政府對本發明享有一定權 利。
[0005] 序列表
[0006] 通過引證結合在于此的序列表是作為ASCII文本文件W電子形式提交的，創建于 12/30/13,優先權信息更新于 12/23/2014,并且命名為"UMA0050PCT_sequence_ST25"。
技術領域
[0007] 本公開設及使用碳酸氨鹽轉運體增強植物中的光合作用的方法W增強期望的作 物屬性的產量，包括生物質產量、種子產量、種子中的油含量、淀粉含量或薦糖含量。此外， 運些改變可W導致耐旱性增加。
【背景技術】
[000引作物生產力受限于許多因素，主要的因素是在光合作用過程中將光能量光化學轉 化為固定碳的相對低效率。該低效率的主要促成原因是通過生產性光和路徑固定C02和在 非生產性的光呼吸路徑中固定02的酶，核酬糖-1,5-二憐酸簇化酶/加氧酶(rubisco)的雙 重特異t生。（Whitney SM,Houtz RL,&Alonso H(2011)Adv曰ncin邑 our underst曰ndin邑曰nd capacity to engineer nature's CO2-sequestering enzyme,Rubisco.Plant Physiol 155(1):27-35.)0
[0009] 植物中的C4和CAM代謝的進化表明通過在rubisco處濃縮C〇2(即通過最小化光呼 吸作用)來增加生產性簇化酶活性與非生產性加氧酶的活性的比率顯著地增加植物物種的 環境范圍和生物質產量，最高達50% (Peterhansel C(2011)Best practice procedures for the establishment of a C4cycle in transgenic CSplants.J Exp Bot 62(9): 3011-3019.)。不幸地是，運些復雜的新陳代謝策略不會容易地轉變為更普遍的C3作物種 類，因為它們依賴于不同的，細胞特異的葉綠體類型的詳細解剖結構（例如C4代謝中的 Kranz解剖學)和生物起源(Peterhansel 2011)。增加光合效率的可替代策略為使用誘變策 略W增加作物物種中rubisco的簇化酶/加氧酶活性的比率。不幸地是，改變rubisco的酶性 質來實現運些目標是有挑戰性的（Taniguchi Y,et al.(2008)0ve;rp;roduction of C4photosynthetic enzymes in transgenic rice pi曰nts:曰n approach to introduce the C4-like photosynthetic pathway into rice.J Exp Bot 59(7):1799-1809， Hibberd JM&Covshoff S(2010)The regulation of gene expression required for C4photosynthesis.Annu Rev Plant Biol 61:181-207.)。
[0010] 基于植物種子油的液體運輸燃料(例如生物柴油和綠色柴油)作為環境、經濟和技 術上可實行的石油來源燃料的替代物具有極大的潛力。植物種子油相比當前使用的作為燃 料源的源自玉米或甘薦的乙醇具有明顯的優勢。植物油可W直接用現有技術轉化為燃料， 并且因此可W在幾十年內替代很大部分的基于石油的燃料。源自種子油的生物燃料是最小 碳中性的。每年用由等量的固定C〇2組成的作物替代作為燃料消耗的生物質，并且由于較低 的硫和氮含量，來自生物燃料的排放是比柴油更清潔的。各種的含油種子作物是美國農業 的支柱，因此增加運些作物的耕作與現有的農業實踐是很大程度上相適合的。
[0011] 基于生物油的生物燃料目前在美國代表相對小部分的可再生能源市場，在2001年 占5.1%的高速公路柴油市場并且在2015年僅計劃達到6.8% (Tyson TK，Bozell J， Wallace R,Petersen E,&Moens L(2004)Biomass oil analysis:research needs and recommendations,National Renewable Energy Laboratory Technical Report,NREL/ TP-510-34796)。在美國目前的生產依賴于由食物油生產的傳統方法繁育的作物物種(例如 大豆、葵花和油菜巧），并且因此如生物柴油的燃料主要是由食品工業的廢產物生成的 (Tyson et al.2004)。因此，用于轉化為生物燃料的油的產量相對較低。增加來自糧食作物 的種子油直接轉換為燃料生產將直接與食物油生產相競爭，從而對食物油價格和可獲得性 具有負面后果。增加生物油生產的第二個限制是油作物物種(大豆或油菜巧)相比其他用于 乙醇生產的商品作物（例如玉米或甘薦）較低的生產力（Johnston M,Foley JA Jolloway T,Kucharik C,Monfreda C(2009)Resetting global expectations from agricultural bio化els.化viron Res Lett 4(1))。因此，基于生物油的燃料的大量增加需要開發具有較 低農藝要求的，高生產力的專用含油種子作物。
[0012] 因此，存在對于具有增強的光合作用和/或作物產量的轉基因植物及方法，W及用 于其中的增強植物中的光合作用和作物產量的組合物的需要。
【發明內容】
[0013] 本文公開了相比野生型植物，具有增強的光合作用的轉基因植物。
[0014] 在實施方式中，該轉基因植物包含異源碳酸氨鹽轉運體，其中該轉基因植物具有 比不包含異源碳酸氨鹽轉運體的相同種類的野生型植物至少5%更高的C〇2同化速率。
[0015] 在實施方式中，轉基因植物包含異源碳酸氨鹽轉運體，其中該轉基因植物具有比 不包含異源碳酸氨鹽轉運體的相同種類的野生型植物至少5%更低的降低的蒸騰速率 (tr曰nspir曰tion r曰te)。
[0016] 在實施方式中，用包含與編碼異源碳酸氨鹽轉運體的多核巧酸可操作地連接的可 植物表達的轉錄調節序列的重組DNA構建體來轉化轉基因植物。
[0017] 本文還公開了用于增強植物中的光合作用的方法和組合物。
[0018] 在實施方式中，重組體多核巧酸包含與可植物表達的轉錄調節序列可操作地連接 的編碼異源碳酸氨鹽轉運體的核酸序列，其中編碼碳酸氨鹽轉運體的核酸序列可選地進一 步可操作地連接至編碼葉綠體被膜祀向膚的核酸序列。
[0019] 在實施方式中，生產具有增強的光合作用的轉化植物的方法包括用公開的重組體 多核巧酸轉化植物細胞；由該植物細胞生長植物直至植物產生種子；W及由其中與未表達 異源碳酸氨鹽轉運體的相應植物相比，光合作用增強的植物選擇種子。
[0020] 當在W下部分中提供詳細說明和實施例時，本發明的運些和其他實施方式、優勢 和特征將變得顯而易見。
【附圖說明】
[0021 ]現在參考附圖，其中，在多個附圖中，相同的元素編號相同：
[0022] 圖1示出了融合至藍藻細菌BicA碳酸氨鹽轉運體(上部)或藍藻細菌SbtA碳酸氨鹽 轉運體(下部）的atTic20轉運膚（"atTic20TP" ;N端)和cMyc表位(C端）的示意圖。
[0023] 圖2示出了將或atTic20TP_BicA_cMyc體外引入分離的葉綠 體中。A.用于體外表達融合蛋白的質粒構建體，縮寫為BicA/SbtA T7(pUC18)，表示BicA或 SbtA存在于質粒中。在圖中，"T7啟動子"表示T7隧菌體轉錄啟動子；"lacOr表示乳糖操縱 子操縱序列；并且"17終止子"表示T7隧菌體轉錄終止子。B.體外表達和葉綠體蛋白引入試 驗的縮略流程圖。C.體外引入[ 35S]atTic20TP_BicA_cMyc融合蛋白的結果。用分離的葉綠體 在促進蛋白質引入的條件下溫育體外翻譯的蛋白質（泳道1)。〇.體外引入[ 35S]atTic20TP_ SbtA_cMyc融合蛋白的結果。用分離的葉綠體在促進蛋白質引入的條件下溫育體外翻譯的 蛋白質（泳道1)。蛋白質與葉綠體結合，并且部分處理為其成熟形式(泳道2)。引入之后用嗜 熱菌蛋白酶處理葉綠體(泳道5-7)表明成熟形式已經引入。葉綠體分級為膜和基質部分表 明蛋白質局部化至葉綠體膜(比較泳道3至4與6至7)。
[0024] 圖3示出了編碼克隆為雙運載體(binary vector) ,pEarleyGate 100(右側）并且 用于亞麻莽的核轉化的 atTic20TP_BicA_cMyc、atTic20TP_SbtA_cMyc、CCPl_cMyc 或 LCIA_ CMyc的單基因構建體的示意圖。在運些圖中，"KanK"表示卡那霉素抗性基因；"LB"表示T-DNA(轉化DNA)左邊界序列；"BaK"表示BASTA抗性基因；"35S"表示35S花挪菜花葉病毒啟動 子；"0CS"表示章魚堿合酶轉錄終止子;并且"RB"表示T-DNA右邊界序列。
[0025] 圖4示出了在分離的葉綠體中體外引入并局部化atTic20TP_SbtA_cMyCeA.將體外 翻譯的[35s]atTic20TP_SbtA_cMyc或[35s]atTic20TP_BicA_cMyc融合蛋白（泳道 1)與分離 的葉綠體在促進蛋白質引入(import)的條件下溫育。兩種蛋白質與葉綠體結合并且處理為 它們的成熟形式(泳道2)并與葉綠體膜結合(泳道3)。葉綠體分級分離(fractionation)為 全部的膜（泳道3)、基質（Shoma)(泳道4)、內包膜（inner enveIope)(泳道5)和類囊體膜 (泳道6)表明SbtA_cMyc或BicA_cMyc與內包膜（泳道5)的初級結合（primary association)。在可靠的內膜蛋白atTic20處分布無法分辨（第S子圖（panel))，然而 Rubisco的小亞基唯一地W基質分離（第四子圖）。8.葉綠體部分中每種引入的蛋白質相對 于總葉綠體中發現的量的分布的定量分析確定B i C A_cMy C或Sb t A_cMy C在內包膜中的局部 化。每種蛋白質從左到右，部分為:總體、膜、基質、內包膜和類囊體。
[0026] 圖 5 示出了 atTic20TP_SbtA_cMyc、atTic20TP_BicA_cMyc、CCPl_cMyc 和 LCIA_cMyc Tl轉化體的選擇。A.來自在用BASTA處理之前的±壤上發芽的轉化的亞麻莽的Tl種子的實 例。B.在用200mg/L的BASTA處理S次后的與A中相同的植物。BASTA抗性轉化體是顯而易見 的。C.移植的 BASTA 抗性品系的實例。D.代表性的 atTic20TP_SbtA_cMyc、atTic20TP_BicA_ cMyc、CCPl_cMyc和LCIA_cMyc Tl轉化體的基于PCR的基因分型(genotyping)表明轉基因的 存在。在野生型植物中沒有檢測到轉基因。將擴增編碼肌動蛋白的基因的引物用作PCR反應 的對照。
[0027] 圖6示出了轉化的亞麻莽中CCPl_cMyc或LCIA_cMyc的表達。將來自五周的T1CCP1_ cMyc轉化體或TlLCIA_cMyc轉化體的葉提取物通過SDS-PAGE解析(resolve)并用抗cMyc免 疫印跡W檢測CCPl_cMyc(A)或LCIA_cMyc(B)蛋白質的表達。在每種構建體的五個獨立的Tl 品系中而非在野生型提取物中W不同的表達水平檢測到預測的分子大小的蛋白質。
[002引圖7示出了用抗cMyc抗體免疫印跡W檢巧化icA_cMyc(A)或SbtA_cMyc(B)的，來自 IOiig的魏豆葉綠體和5至30yg的亞麻莽葉綠體的總體(T)、膜(P)和可溶解的基質（S)部分的 結果的照片。
[0029] 圖8示出了在表達CCPl_cMyc的亞麻莽T3純合品系中植物C〇2同化作用、氣孔下 (substomatal)C〇2濃度、氣孔導度（stoma1:al conductance)和蒸騰作用的圖。（A)在恒定的 400皿〇1/1112大氣0)2和恒定光照下的0)2同化作用。（8)4中的植物的氣孔下0)2濃度斯，（〇 來自A的C〇2同化作用與來自B的Ci的比率。（D)來自A的葉的氣孔導度。化)來自A的葉在恒定 的50%濕度下的蒸騰速率。誤差棒(error bar)代表平均值的標準誤差。
[0030] 圖9示出了當水在7天期間內保留時，37和50天的亞麻莽CCP1-20植物比較野生型 (野生型，wild type)的照片。
[0031] 圖10示出了在亞麻莽CCP1-20和野生型(對照)植物W250ml/天或175ml/天誘水的 限制條件下葉含水量的圖。誘水值對應于田地值(field value)的典型范圍。符號**和*分 別表示在雙尾t測試中P = O. Ol和P = 0.0 5處的顯著性。
[0032] 圖11示出了代表性的CCPl亞麻莽品系在受限的水處理下C〇2同化速率(A)和種子 產量(B)的圖。種子產量量化為每株植物的種子重量。
[0033] 圖12示出了 CCP1-20和野生型（對照）植物在不同的氮肥施加下氮利用效率(A)和 碳/氮比率(B)的圖。
[0034] 圖13示出了在不同的氮下生長的野生型(WT)亞麻莽和T3純合CCPl亞麻莽的A/Ci 曲線。（A)在標明的不同的氮肥比率下生長的亞麻莽品系CCP1-20和野生型植物的A/Ci (凈 0)2同化速率A相對于計算的氣孔下C〇2濃度Ci)曲線。（B)WT亞麻莽和兩種獨立的表達CCP1_ cMyc的純合CCPl_cMyc轉化品系的A/Ci曲線。對每個散點圖示出最佳匹配趨勢線。在插圖中 示出兩種品系中CCPl_cMyc的表達水平。
[0035] 圖14示出了來自在充足的氮的氮;標記為"標準溫室條件"）或減少的氮 (1化pm的氮)下生長的CCP1-20亞麻莽和野生型(對照)植物的種子產量的圖。種子產量測量 為每株植物的總種子重量。每個樣品代表平均最少10株植物。誤差棒代表平均值的標準誤 差。
[0036] 圖15顯示了來自田地測試的CCPl亞麻莽品系相對于野生型（對照)植物的生物質 產量數據。
[0037] 圖16顯示了來自田地測試的碳酸氨鹽轉運體品系相對于野生型（對照）植物的種 子產量數據。
[0038] 圖17顯示了來自田地測試的碳酸氨鹽轉運體品系相對于野生型（對照）植物的油 產量數據。符號*表示假設不等方差(unequal variance)的兩個樣品的t測試中P = 0.05處 的顯著性。
[0039] 圖18顯示了 BicA或SbtA亞麻莽T3純合品系和野生型(對照)植物中的植物C〇2同化 作用和內部[C02]的圖。A.恒定的400皿ol/m 2大氣C〇2和恒定光照下的C〇2同化作用.B.轉基 因品系中的氣孔下C〇2 (Ci)。C. C〇2同化作用與Ci的比率。光照水平是600皿01 Hf 2S-I。植物在 2加侖花盆中生長。在5周的植物上進行測量。誤差棒代表平均值的標準誤差。**和*分別表 示在雙尾t巧聯中P = O. Ol和P = 0.0 5處的顯著性。
【具體實施方式】
[0040] 本文公開了包含異源碳酸氨鹽轉運體的轉基因植物。已經出乎意料地發現工程化 W包括外源碳酸氨鹽轉運體的植物示出了增強的碳光合捕獲/固定速率。表達外源碳酸氨 鹽轉運體的植物展現出相對于野生型植物更高的C〇2同化速率。轉基因植物還示出增加的 水和氮利用率和生物質生產的總體增加。公開的轉基因植物表現出通過工程化增加 C〇2在 rubisco的可用性來增加作物生產力的潛力。
[0041] 由于將來自藍藻細菌和其他生物體的C〇2濃縮機制的蛋白質引入植物，轉基因植 物具有改善的通過光合作用固定碳的能力。例如，SbtA蛋白質是藍藻細菌碳酸氨鹽轉運體， 其增加 C〇2可用性并適應于較低的C〇2。因此增大光合作用的產量可W增加作物產量。此外， 除可用于植物生長的固定碳的量增加之外，轉基因植物還可W導致增加的氮利用率和減少 的需水量。
[0042] 藍藻細菌和藻類進化出兩種替代的高效碳濃縮機制(CCM) W增加簇化酶/加氧酶 的活性（Price GD, et al.(2013)J Exp Bot 64(3) :753-768. ,Meyer M&Griffiths H (2013)J Exp Bot 64(3) :769-786.)。第一種使用高親合性的碳酸氨鹽膜轉運體W增加細 胞的HC03-1。第二種策略在藍藻細菌中稱為簇酶體并且藻類中稱為淀粉核的微室內隔絕 rubisco與碳酸酢酶。肥化-由碳酸酢酶在微室中迅速轉化為CO2W顯著增加 rubisco處的C〇2 濃度，從而將碳同化增加幾個數量級。
[0043] 近來的研究已經模型化植物細胞的內隔室內的二氧化碳傳導。運些研究表明葉綠 體被膜在細胞內形成對C〇2擴散有顯著抗性的阻隔化vans JR&Von Caemmerer 8(1996) Plant Physiol 110(2):339-:346.,Tholen D&Zhu XG(2011)Plant Physiol 156(1):90-105.)，由此限制葉綠體基質中由rubisco固定碳的速率化vans&Von Caemmerer 1996; Price GD,Badger MR,&von Caemmerer S(2011)Plant Physiol 155(1):20-26.)。在葉綠 體被膜中引入來自微生物和藻類CCM的碳酸氨鹽轉運體具有減輕該擴散阻隔的潛力。已經 在藍藻細菌中確認了多個確定的且提出的肥化-轉運體，包括化+協同轉運體（sympoder) (BicA和SbtA)、ATP驅動的（BCTl)和NADPH驅動的（NDHU)吸收系統(Price GD,Badger MR, Woodger FJ,化ong BM(2008)J Exp Bot 59(7):1441-1461.)0
[0044] 此外，響應低CO2環境綠藻如萊茵衣藻表達誘導>1000倍的假定葉綠體H(XV轉運 體。運些包括局部化在葉綠體被膜的LCIA和CCP巧日CCP2(CCPl/2)轉運體(Miura K，et al. (2004)PlantPhysioll35(3):1595-1607;ChenZY，Lavi即eLL，MasonCB，&Moron巧JV (1997)Plant I%ysiolll4(l) :265-273. ;Spalding MH&Jef打巧 M(1989)Plant Physiol89 (I) :133-137. KLCIA是促進的陰離子轉運體的甲酸鹽/亞硝酸鹽轉運體家族的成員 (Mariscal V，et al.(2006)Protist 157(4) :421-433) eLCIA 在爪贍卵母細胞中的表達提 供了其用作低親合性碳酸氨鹽轉運體的證據。也提出CCPl和CCP2用作碳酸氨鹽轉運體。它 們局部化在衣藻中的葉綠體被膜并且與線粒體載體蛋白的家族相關，包括ADP/ATP易位體 (translocatorKMoroney JV&Mason CB(1991)&n J Bot 69(5):1017-1024. ;Ramazanov Z,Mason CE,Geraghty AM,Spalding MH,&Moroney JV(1993)Plant Physiol 101(4): 1195-1199. )dCCP1和CCP2是96%-致的。它們的基因位于包括多個編碼另外的CCM組分的 基因的基因簇內（Merchant SS, et al.(2007)Science 318(5848) :245-250.)。
[0045] 已經出乎意料地發現轉基因植物中局部化至植物的葉綠體被膜的異源碳酸氨鹽 轉運體(例如來自藍藻細菌或藻類)的表達導致轉基因植物中光合作用水平的顯著改善。
[0046] 本文公開了具有增強的光合作用的轉基因植物。
[0047] 在實施方式中，該轉基因植物包含異源碳酸氨鹽轉運體。在實施方式中，轉基因植 物包含編碼與可植物表達的轉錄調節序列可操作地連接的異源碳酸氨鹽轉運體的重組體 核酸序列，其中該核酸序列可選地進一步編碼與異源碳酸氨鹽轉運體可操作地連接的葉綠 體被膜祀向膚。在實施方式中，用包含與編碼異源碳酸氨鹽轉運體的多核巧酸可操作地連 接，和可選地與編碼葉綠體被膜祀向膚的多核巧酸可操作地連接的可植物表達的轉錄調節 序列的重組DNA構建體來轉化轉基因植物。在運些實施方式的任一個中，表達的異源碳酸氨 鹽轉運體局部化至葉綠體被膜。
[0048] 在實施方式中，轉基因植物具有比同樣種類的野生型植物的C〇2同化速率至少 5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的C〇2 同化速率。在本文中野生型植物是指不包含異源碳酸氨鹽轉運體的植物。
[0049] 在實施方式中，轉基因植物具有比同樣種類的野生型植物的蒸騰速率至少5%、至 少10%、至少15%、至少20%或至少25%更低的蒸騰速率。
[0050] 在實施方式中，轉基因植物具有比同樣種類的野生型植物的種子產量至少5%、至 少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40或至少50%更高的種子產量。
[0051] 在實施方式中，轉基因植物具有比同樣種類的野生型植物的水利用率(W肥）至少 5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的WUE。
[0052] 在實施方式中，轉基因植物具有比同樣種類的野生型植物的氮利用率(N肥）至少 5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的NUE。
[0053] 在實施方式中，轉基因植物具有比同樣種類的野生型植物的成熟速率至少5%、至 少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的成熟速率。
[0054] 在本文中，"碳酸氨鹽轉運體"蛋白質是通過任何轉運機制轉運碳酸氨鹽的蛋白 質。碳酸氨鹽轉運體的類別包括陰離子交換體和Na7HC〇3-i協同轉運體。
[0055] 在任何公開的實施方式中，碳酸氨鹽轉運體可W是來自藍藻菌的碳酸氨鹽轉運 體，例如BicA多膚或SbtA多膚，或來自藻類的碳酸氨鹽轉運體，例如CCPl多膚或LCIA多膚。 藍藻菌可W是集胞藻，例如集胞藻（Synechococ州S)PCC6803,或聚球藻（Synechococcus)， 例如聚球藻P(X700。藻類可W是衣藻屬，例如萊茵衣藻。
[0056] 為本發明的目的，"植物"是指所有植物界的高等和低等植物的種和屬。該術語包 括成熟的植物、種子、芽和苗，W及部分、繁育材料、植物器官組織、原生質體、愈傷組織和其 他培養物，例如源自他們的細胞培養物，W及所有其他給出功能或結構單元的植物細胞的 組的種類。成熟的植物是指處于任何超過苗的發育階段的植物。苗是指處于早期發育階段 的幼小、不成熟的植物。
[0057] "植物"包括所有一年生和多年生的單子葉或雙子葉植物并且包括(舉例來說，但 不限于)南瓜屬、菩薇屬、葡萄屬、胡桃屬、草替屬、蓮屬、首猜屬、紅豆草屬、=葉草屬、胡盧 己屬、班豆屬、相枯屬、亞麻屬、天竺葵屬、木馨屬、胡蘿h屬、擬南芥屬、蕓苔屬、蘿h屬、芥子 屬、顛茄屬、辣椒屬、曼巧羅屬、賞窘屬、番茄屬、煙草屬、輪螺屬、矮牽牛屬、毛地黃屬、牛至 屬、菊宦屬、向日葵屬、窩宦屬、雀麥屬、天口冬屬、金魚草屬、宣草屬化eterocallis)、龍面 花屬(Nemesia)、天竺葵屬、泰屬(Panieum)、狼尾草屬、毛賞屬、千里光屬、蝴蝶花屬、黃瓜 屬、紫水晶屬(Browallia)、大豆屬、魏豆屬、菜豆屬、黑麥草屬、稻屬、玉蜀泰屬、燕麥屬、大 麥屬、黑麥屬、小麥屬、高梁屬、云杉屬和白楊屬的那些。
[0058] 優選的植物是來自W下植物家族的那些:寬科、菊科(Asteraceae)、蕓苔科、石竹 科、襲科、菊科(Composi化e)、十字花科、葫蘆科、唇形科、豆科、蝶形花科、百合科、亞麻科、 錦葵科菩薇科、茜草科、虎耳草科、玄參科、茄科、梧桐科、番杏科、山茶科、傘形科。
[0059] 本發明可W特別有利地應用與雙子葉植物生物體。優選的雙子葉植物具體選自雙 子葉作物植物如，例如菊科(Asteraceae)如向日葵屬、萬壽菊屬或金盞花屬及其他；菊科 (Compositae),具體地窩宦屬，非常具體地栽培屬(窩宦)及其他;十字花科，具體地蕓苔屬， 非常具體地油菜屬（油巧油菜）、蕓苔中（campestris)(甜菜）、oleracea CV Tastie(卷屯、 菜）、oleracea CV Sonwball W菜花）和oleracea CV Emperor(花挪菜）和其他甘藍類；W 及擬南芥屬，非常具體地南芥屬(thaliana)，和水芹或卡諾拉(canola)及其他;葫蘆科如甜 瓜、南瓜(pumpkin)/南瓜（squash)或西葫蘆及其他;豆科，具體地大豆屬，非常具體地大豆 屬(max) (soybean)、黃豆，和首猜、魏豆、菜豆(bean)或花生及其他;茜草科，優選地唇形亞 綱如，例如阿拉比卡咖啡（Coffea arabica)或大果咖啡（Coffea Iiberica)(咖啡樹)及其 他;茄科，具體地番茄屬，非常具體地西紅柿(esculentum)屬（西紅柿（西紅柿））、茄屬，非常 具體地馬鈴馨（tuberosum)屬（馬鈴馨（potato))和茄子(melongena)(茄子(aubergine)) W 及辣椒屬，非常具體地辣椒(annuum)屬(辣椒(pepper))和煙草或紅辣椒及其他;梧桐科，優 選地五啞果亞綱如，例如可可（Theobroma cacaoK可可樹)及其他；山茶科，優選地五啞果 亞綱如，例如野茶樹(Camellia sinensis)或茶樹(Thea sinensis)(茶樹（tea shrub))及 其他;傘形科，具體地胡蘿h屬(非常具體地胡蘿Kcarota)屬（胡蘿K胡蘿h))和芹屬（非常 具體地堇（graveolens dulce)(芹菜））及其他；W及亞麻巧、棉花、大麻、亞麻、黃瓜、渡菜、 胡蘿K糖甜菜和各種樹木、堅果和葡萄藤屬，具體地香蕉和奇異果。
[0060] 還包括有觀賞植物，實用或觀賞樹木、花弁、插瓶花、灌木或草皮。可W提及的植物 為(舉例來說但不限于)被子植物、苔薛植物如，例如苔類(liver flower)和薛類(苔薛）；藤 類如羊齒、馬尾和石松;裸子植物如松柏類、蘇鐵類、銀杏和買麻騰(Gnetatae),菩薇科的家 族如玫瑰，石南科如杜酷花屬(rhododeiKlron)和杜酷花(azalea)，大戟科如一品紅和己豆， 石竹科如石竹花，茄科如矮牽牛花，苦宦苔科如非洲紫宦苔，鳳仙花科如含羞草，蘭科如蘭 花，尊尾科如唐富蒲(gladioli)、尊尾花、小蒼蘭和番紅花，菊科如金盞花，牛兒苗科如天竺 葵，百合科如龍血樹(化acena)，桑科如無花果，天南星科如龜背竹和許多其他。
[0061] 用于轉化特別感興趣的是油類作物植物的植物。油類作物植物被理解為是含油量 是自然地較高和/或其可W用于油類的工業生產的植物。運些植物可W具有高含油量和/或 特定的在工業上感興趣的脂肪酸成分。優選的植物是具有至少按重量計1%的脂質含量的 那些。油類作物包括，舉例來說:玻璃宦(Borago Officinalis)(玻璃宦(borage));亞麻莽 屬(亞麻莽）；蕓苔屬如蕓苔、歐洲油菜(B.napus)、憲菁、埃塞俄比亞芥(B.carinataK芥末、 油巧油菜或憲菁油菜）；大麻（Cannabis sativa)(大麻（hemp));紅花（Carthamus t i nc tori us)(紅花（safflower));挪子（Co COS nucifera)(挪子（CO conut));海甘藍 (化ambe abyssinicaK兩節莽）；專距花屬（產生中鏈長度，特別是用于工業應用的脂肪酸 的專距花屬物質）；非洲油棟桐化Iaeis guinensis)(非洲油棟桐(A打ican oil palm));美 洲油棟桐（美洲油棟桐(American oil palm));大豆(Glycine max)(大豆（soybean));陸地 棉（美洲棉）；海島棉（埃及棉）；草本棉（亞洲棉）；向日葵化eIianthus anmms)(向日葵 (sunflower));亞麻（Linum usitatissimum)(亞麻半子或亞麻（flax));月見草（Oenothera biennis)(月見草（evening primrose));油橄攬（橄攬）；水稻（0;ryza sativa)(水稻 (rice));篇麻（Ricinus communis)(藍麻（castor));芝麻（Sesamum indicum)(芝麻 (sesame));小麥屬(小麥）；玉米屬(玉米），和各種堅果屬諸如，例如胡桃或扁桃。
[0062] 亞麻莽屬，通常稱為亞麻莽，是歐洲的地中海區域和亞洲當地的，并且看起來特別 適應于冷半干旱氣候區域(干草原和大草原）。亞麻莽屬在歷史上作為含油種子作物培養W 生產植物油和動物飼料。其已經引入加拿大的高原區域和美國的部分作為工業的含油種子 作物。由于其種子的高含油量(~35%)、其抗凍性、短生產周期(60-90天)和抗蟲性，其是用 于增強光合作用W改善其作為生物燃料的生產來源的潛力的感興趣的目標。
[0063] 本文還公開了重組體多核巧酸，包含與可植物表達的轉錄調節序列可操作地連接 的編碼碳酸氨鹽轉運體的核酸序列，其中編碼碳酸氨鹽轉運體的核酸序列可選地進一步可 操作地連接至編碼葉綠體被膜祀向膚的核酸序列。
[0064] 在一些實施方式中，編碼碳酸氨鹽轉運體的核酸序列進一步包含編碼表位標記的 序列，W幫助表達的碳酸氨鹽轉運體的親合性捕獲或局部化。表位標記是，其中將已知的表 位借助遺傳工程融合至重組體蛋白質的技術。第一個可商購的表位標記最初是設計用于蛋 白質純化的。此外，通過選擇可獲得對其的抗體的表位，該技術使得可W檢測不可獲得對其 的抗體的蛋白質。表位標記的另外的實例包括FLAG、6X化S、谷脫甘膚-S-轉移酶(GST)、HA、 cMyc、AcV5或串連親和純化表位標記。
[0065] 可W由其獲得碳酸氨鹽轉運體基因的種類的實例包括東方曲殼藻、阿格藻屬、透 明雖形藻（Amphiprora hyaline)、咖啡形雙眉藻、咖啡形雙眉藻線型變屬（Amphora coffeiformis var.linea)、咖啡形雙眉藻點狀變屬（Amphora coffeiformis var .punc1:a1:a)、咖啡形雙眉藻盾狀變屬（Amphora coffeiformis var. taylori)、咖啡形雙 眉藻薄狀變屬(Am地ora coffeiformis var.tenuis)、優美雙眉藻、優美雙眉藻頭狀變屬 (八111口110^(1日1；[。日1：133；[1]1日￥日1'.。日9；[1日1：日）、雙眉藻屬、魚腥藻、纖維藻、鑲型纖維藻、布朗尼 葡萄藻、包特氏菌屬、叢粒藻、葡萄藻（BotiTococcus sudeticus)、片球藻、Bracteococ州S medionuc Ieatus、四鞭藻、纖細角毛藻、牟勒氏角毛藻、牟勒氏角毛藻廣鹽變屬 (畑aetoceros muelleri var.subsalsum)、角毛藻屬、具孔衣藻、小球藻（畑lore Ila 曰nitr曰t曰）、小球藻（Chlorell曰曰nt曰rctic曰）、小球藻（Chlorell曰曰ureoviridis)、小球藻 (加 Iorella Candida)、小球藻（加 Iorella capsulate)、干枯小球藻（加 lore Ila desiccate)、楠圓小球藻、浮水小球藻、融合小球藻（畑IorelIa fuse a)、小球藻變屬 (畑Iorella fusca var.vacuolata)、小球藻（畑Iorella glucotropha)、水溪小球藻 (Chlorella infusionum)、水溪小球藻海岸變屬（Chlorella infusionum var.actophila)、7jC溪小球藻變屬（Chlorella infusionum var.auxenophila)、小球藻 (Chlorella kessleri)、小球藻（Chlorella lobophora)、小球藻（Chlorella luteoviridis)、小球藻變屬（Chlorella Iuteoviridis var.aureoviridis)、小球藻變屬 (Chlorella luteoviridis var. lutescens)、小球藻（Chlorella miniata)、小球藻 (Ch Iorella minutissima)、小球藻（Chlorella mu tabilis)、小球藻（Chlorella nocturna)、小球藻（化Iorella ovalis)、小球藻（Qilorella parva)、嗜光小球藻、小球藻 (Chlorella pringsheimii)、原始小球藻、原始小球藻酸居變屬、規則小球藻、規則小球藻 極小變屬、規則小球藻變屬（化lore Ila regular is var .umbricata)、小球藻（Qilore Ila re isiglii)、嗜糖小球藻、海洋小球藻楠圓變屬、海水小球藻、單純小球藻、耐熱性小球藻、 小球藻屬、球抱小球藻、小球藻(ChlorelIa Stigmatophora)、萬尼氏小球藻、普通小球藻、 小球藻(化IorelIa vulgaris fo.T&rtia)、普通小球藻自養變屬、普通小球藻綠色變屬、普 通小球藻普通變屬、普通小球藻變屬（Qilorella vulgaris var.vulgaris fo.Te;rtia)、普 通小球藻變屬（畑Iorella vulgaris var.vulgaris fo.Viridis)、小球藻（化Iorella xanthella)、小球藻（Chlorella zofingiensis)、小球藻（Chlorella trebouxioides)、普 通小球藻、水溪綠球藻、綠球藻屬、綠梭藻、藍隱藻、金球藻屬、卡氏球巧板藻屬、隱甲藻、隱 藻屬、隱秘小環藻、梅尼小環藻、小環藻屬、衣藻（化1日1117(101]1〇]1日8 1]1〇6?〇13；[；0、萊茵衣藻、衣 藻屬、杜氏藻屬、杜氏藻化unaliella bardawil)、杜氏藻(Dunaliella biocula1:a)、顆粒杜 氏藻(DunalielIa granulate)、海生杜氏藻、微小杜氏藻、己夫杜氏藻、杜氏藻(DunalielIa pei;rcei)、杜氏藻化unaliellap;rimolecta)、鹽生杜氏藻（Dunaliellasalina)、陸生杜氏 藻（DunalielIa terricola)、杜氏藻（DunalielIa tertiolecta)、綠色杜氏藻、杜氏藻 (Dunaliella tertiolecta)、綠色獨球藻、獨球藻屬、后棘藻屬、裸藻屬、披刺藻屬、克羅脆 桿藻、脆桿藻屬、藍股藻屬、絲藻屬、雨生紅球藻、膜胞藻屬、等鞭金藻（Isochry sis aff .Galbana)、等鞭金藻（Isockrysis ga化ana)、麟孔藻、微星藻、微星藻、微小單針藻、單 針藻屬、保囊菌屬、鹽生微綠球藻、微綠球藻、截形舟形藻、舟形藻（Navicula biskanterae)、舟形藻（Navicula pseudotenelloides)、具膜舟形藻（Navicula pelliculosa)、腐生舟形藻、舟形藻屬、腎鞭藻屬、腎鞭藻屬、普通菱形藻、亞歷山大菱形藻、 新月菱形藻、普通菱形藻、細端菱形藻、碎片菱形藻、漢氏菱形藻、平庸菱形藻、中型菱形藻、 小頭菱形藻、微小菱形藻、楠圓微小菱形藻(NitzscMa pusilla elliptica)、微小菱形藻 (Nitzschia pusilla monoensis)、四邊微小菱形藻（Nitzschia quadrangular)、菱形藻 屬、掠鞭藻屬、小卵囊藻、卵泡藻、卵囊藻屬、沼澤顫藻、顫藻屬、亞短顫藻(顫藻SiAbrevis)、 類小球藻(ParachlorelIa kessleri)、嗜酸鹽藻(Pascheria acidophila)、己夫藻屬、S角 褐指藻、隧菌體、席藻屬、扁藻屬、顆石藻（Pleurochrysis carter ae)、顆石藻 (Pleurochiysis dentate)、顆石藻屬(Pleurochrysis sp.)、威克海姆原壁藻(Prototheca wickerh am ii)、原壁藻（Prototheca stagnora)、波多黎各原壁藻（Prototheca portoricensis)、原壁藻(Prototheca moriformis)、饒氏原壁藻(Prototheca zopf ii)、7jC 生假小球藻（Pseudochlorella aquatica)、塔胞藻（Pyramimonas sp.)、桑甚藻、不透明紅 球菌、綠球藻（Sarcinoid chrysophyte)、被甲柵藻、裂殖壺菌、水棉、純頂螺旋藻、裂絲藻 屬、集球藻屬、集胞藻、萬壽菊、孔雀草、四角藻、四片藻屬、瑞典四片藻、威氏海鏈藻W及鮮 綠球藻(Viridiella fridericiana) 0
[0066]在一些實施方式中，碳酸氨鹽轉運體來自藍藻菌并且編碼藍藻細菌碳酸氨鹽轉運 體的核酸序列進一步包含編碼與碳酸氨鹽轉運體編碼序列可操作地連接的葉綠體被膜祀 向膚的序列。藍藻菌的實例包括集胞藻屬，例如集胞藻屬PCC6803和聚球藻屬，例如聚球藻 P(X7002。在本文中"葉綠體被膜祀向膚"是指當嵌合體蛋白表達自核基因組時，可W祀向包 括該膚的嵌合體蛋白至葉綠體被膜，如葉綠體內包膜的膚序列。適合的葉綠體被膜祀向膚 的實例包括葉綠體被膜膜蛋白的前體的轉運膚，例如擬南芥atTic20前體（Uniprot Q8GZ79,版本52;NP_171986.3)的轉運膚(aa 1-110);葉綠體丙糖憐酸醋/憐酸醋易位體前 體的轉運膚，例如魏豆葉綠體憐酸丙糖醋/憐酸醋易位體前體化niprot P21727,版本73)的 轉運膚(aa 1-72);擬南芥白化屬或淺綠突變型1蛋白（GenBank登錄號BAB62076.1的氨基酸 1-51)的轉運膚，或萊茵衣藻CCPl前體或LCIA前體的轉運膚。
[0067] 藍藻細菌碳酸氨鹽轉運體可W是依賴化+的肥03-轉運體，例如BicA多膚或SbtA多 膚。BicA在海洋藍藻細菌的基因組中廣泛表現并且屬于許多細菌中的目前注釋為硫酸鹽轉 運體或透性酶的真核和原核轉運體的大家族(SulP家族）。
[0068] 在一些實施方式中，碳酸氨鹽轉運體來自藻類。藻類可W是衣藻屬或任何下表1和 2中列舉的藻類。衣藻屬可W是，例如萊茵衣藻。藻類碳酸氨鹽轉運體可W是CCPl多膚或 LCIA多膚.
[0069] 在實施方式中，碳酸氨鹽轉運體包含集胞藻屬PCC6803的SbtA基因（核巧酸序列， 沈Q ID NO: 1，登錄號NC_000911.1，區域：1600659.. 1601783 ;GI: 16329170;多膚序列，SEQ ID ^:2，登錄號郵_441：340.1)。
[0070] 在實施方式中，碳酸氨鹽轉運體包含聚球藻屬PCC7002的BicA基因（核巧酸序列， 沈QIDN0:3，登錄號NC_010475.1，區域：2452833..2454533);多膚序列，SEQIDN0:4，登 錄號 YP_001735604.1)。
[0071] 在實施方式中，碳酸氨鹽轉運體包含萊茵衣藻的CCPl基因（核巧酸序列，SEQ ID N0:5,登錄號XM_001692145.1的編碼序列）；多膚序列，SEQ ID N0:6,登錄號XP_ 001692197.Do
[0072] 在實施方式中，碳酸氨鹽轉運體包含萊茵衣藻的LCIA蛋白基因（核巧酸序列，SEQ ID N0:7,登錄號XM_001691161.1的編碼序列）；多膚序列，SEQ ID N0:8,登錄號XP_ 001691213.Do
[0073] 只要碳酸氨鹽轉運體具有碳酸氨鹽轉運體活性，碳酸氨鹽轉運體包括與SbtA、 BicAXCPl或LCIA同源的碳酸氨鹽轉運體。"同源物"是用于本領域的統稱術語，表示擁有與 對象序列高度的序列相關性的多核巧酸或多膚序列。運種相關性可W通過確定比較的序列 之間一致性和/或相似性的程度來量化。落在該統稱術語內的是術語"直系同源物 (odholog)"，意指是另一物種的多核巧酸或多膚的功能等效物的多核巧酸或多膚，W及 "橫向同源物(paralog)"，意指當認為在相同的物種內時，功能上類似的序列。存在于相同 的物種中的橫向同源物或其他物種中的碳酸氨鹽轉運體基因的直系同源物可W通過在本 領域中眾所周知的分子生物技術，不用過度的實驗而容易地識別。如在本文中使用的SbtA、 BicA、CCPl或LCIA分別指訊tA、BicA、CCPl或LCIAW及它們的同源物和直系同源物。
[0074] 具有與萊茵衣藻CCP1、萊茵衣藻LCIA、聚球藻屬PCC7002BicA或集胞藻屬 PCC6803SbtA顯著的相似性，適用于實施公開的方法W生成具有增強的光合作用的轉基因 植物的已知的編碼序列和/或蛋白質序列在下表1-4中列出。對于萊茵衣藻CCPl或萊茵衣藻 LCIA，運些編碼序列和蛋白質序列是通過用適當的查詢序列的GenBank的tBLASTN捜索確定 的，如表1-2中所示。表1-2中僅示出具有<E-10的E值的序列。對于聚球藻屬PCC7002BicA或 集胞藻屬PCC6803SbtA，蛋白質序列是通過用適當的查詢序列的GenBank的BLASTP捜索確定 的，如表3-4所示。在表3和4中僅分別示出具有與聚球藻屬PCC7002BicA或集胞藻屬 PCC6803訊tA>60%的氨基酸序列一致性的序列。
[0075] 表1.使用萊茵衣藻CCPl蛋白的登錄號XM_001692145由GenBank的tBLASTN捜索確 定的示出與萊茵衣藻CCPl顯著的相似性的DNA和蛋白質序列。 「nn7Al
[0116]
[0117] 如在本文中使用的兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的"百分比同源度"是使用 Karlin and Altschul(1990)Proc.化tl.Acad.Sci. ,U.S.A.87:2264-2268的算法確定的。 運樣的算法被結合在Altschul et al.(1990) J.Mol.Biol. 215:403-410的NBLAST和XBLAST 程序中。用NBLAST程序，分數=100，字長12進行BLAST核巧酸捜索W獲得與本發明的核酸分 子同源的核巧酸序列。用XBLAST程序，分數= 50,字長=3進行BLAST蛋白質捜索W獲得與參 照多膚(例如SEQ ID N0:5)同源的氨基酸序列。為獲得間隙比對(gapped alig皿ent)用于 比較目的，如在Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述的利用 間隙化AST(gapped BLAST)。當利用化AST和間隙化AST程序時，通常使用默認參數（見 http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
[0118] 此外，包括基本與編碼SbtA、BicA、CCPl或LCIA多膚的多核巧酸相同的多核巧酸。 "基本上相同"是指具有與參照氨基酸或核酸序列的序列至少約85%，具體地約90%，并且 更具體地約95%或更多相同的序列的多膚或多核巧酸。對于多膚，參照多膚序列的長度通 常為至少約16氨基酸，或具體地至少約20氨基酸，更具體地至少約25氨基酸，并且最具體地 至少約35氨基酸。對于核酸，參照核酸序列的長度通常為至少約50核巧酸，具體地至少約60 核巧酸，更具體地至少約75核巧酸，并且最具體地至少約110核巧酸。
[0119] 通常，可W通過雜交確認同源序列，其中雜交處于嚴格的條件下。使用嚴格雜交 (即洗涂核酸片段兩次，其中每次洗涂為用2X氯化鋼和巧樣酸鋼(SCC緩沖液；1.150mM氯化 鋼和15mM巧樣酸鋼，pH 7.0)和0.1 %十二烷基硫酸鋼(SDS)在室溫下30分鐘，隨后在50°C下 用2X SCC和0.1 %SDS洗涂一次30分鐘;并且然后洗涂兩次，其中每次洗涂為用2XSCC在室溫 下10分鐘），可W確定包含最多約25至約30%的堿基對錯配，或約15至約25%的堿基對錯 配，或約5至約15 %的堿基對錯配的同源序列。
[0120] 編碼SbtA、BicA、CCPl或LCIA多膚序列的多核巧酸允許制備具有特異地雜交至運 種基因序列的能力的相對短的DNA(或RNA)序列。較短的核酸序列可W用作在給定的樣品中 檢測互補序列的存在的探針，或可W用作引物W檢測、擴增或突變編碼SbtA、BicA、CCPl或 LCIA多膚的DNA序列的限定片段。用于雜交研究的核酸序列長度可W大于或等于約14核巧 酸W保證片段有足夠長度形成穩定的和選擇性的雙鏈分子。例如，通過直接由化學方法合 成片段，通過應用核酸復制技術，如PCR技術，或通過由含有適當的插入物和適合的限制位 點的重組質粒剪切選定的核酸片段來制備運種片段。
[0121] 術語碳酸氨鹽轉運體包括編碼訊tA、BicA、CCPl或LCIA多膚或含有置換、插入或刪 除多膚主鏈的全長蛋白質的多核巧酸。相關的多膚通過將同源度分配給各種刪除、置換和 其他修改來與SbtA、BicA、CCPl或LCIA比對。同源性可W沿著整個多膚或多核巧酸，或沿著 連續殘基的子集確定。百分比相同性是當比較兩個序列時氨基酸或核巧酸相同的百分比。 相似性百分比是當比較兩個序列時氨基酸或核巧酸化學上類似的百分比。訊tA、BicA、CCPl 或LCIA與同源的多膚優選地是大于或等于約75%、優選地大于或等于約80%，更優選地大 于或等于約90 %或最優選地大于或等于約95 %相同的。
[0122] 例如，可W通過常規的位點定向誘變多核巧酸(其是用于程序地確定分子的殘基 功能上重要與否的一個途徑），由隨機突變、由化學合成或由多膚的化學品或酶切割來產生 同源的多膚。
[0123] 在多膚序列與參照序列小于100%相同的情況下，不相同的位置優選地但并非必 要地為參照序列的保守置換。保守置換通常包括在W下的組內的置換:甘氨酸和丙氨酸;鄉 氨酸、異亮氨酸和亮氨酸;天冬氨酸和谷氨酸;天冬酷胺和谷氨酷胺;絲氨酸和蘇氨酸;賴氨 酸和精氨酸；W及苯丙氨酸和酪氨酸。
[0124] 在認為特定的多膚具有與限定長度的參照多膚特定的百分比相同性時，該百分比 相同性是相對于參照膚。因此，50%相同于100氨基酸長的參照多膚的膚可W是完全相同于 參照多膚的50氨基酸長的部分的50氨基酸多膚。其也可W是在參考多膚的整個長度上50% 與其相同的100氨基酸長的多膚。當然，許多其他的多膚符合該標準。
[01巧]在本文中設及SbtA、BicA、CCPl或LCIA的核巧酸或氨基酸序列也包括設及運些序 列的自然存在的變體。不同于SEQ ID N0:l、3、5或7(核巧酸)和2、4、6或8(氨基酸)并且保持 生物功能的非自然存在的變體也包括在本文中。優選地，該變體包含具有保守的氨基酸變 化，即類似的帶電或不帶電氨基酸的變化的多膚。遺傳編碼的氨基酸通常分為四個家族： (1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸）；堿性(賴氨酸、精氨酸、組氨酸）；（3)非極性(丙氨酸、鄉氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）；W及(4)不帶電極性(甘氨酸、天 冬酷胺、谷氨酷胺、半脫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸）。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時共 同歸類為芳香族氨基酸。由于每個家族的成員具有與相同家族的其他成員類似的物理的與 化學性能，有理由期待用異亮氨酸或鄉氨酸單獨替換亮氨酸、用谷氨酸單獨替換天冬氨酸、 用絲氨酸單獨替換蘇氨酸，或用結構上相關的氨基酸類似地替換氨基酸對得到的分子的結 合性能不會具有主要的影響。氨基酸的變化是否產生功能的多膚可W容易地通過試驗含有 SbtA、BicA、CCPl或LCIA衍生物的轉基因植物的性能來確定。
[01%] 設及訊tA、BicA、CCPl或LCIA也設及SbtA、BicA、CCPl或LCIA的多膚衍生物。如在本 文中使用的"多膚衍生物"包括來自天然存在的SbtA、BicA、CCPl或LCIA的不同長度的那些 多膚，并且包含如在SbtA、BicA、CCPl或LCIA中發現的相同的一級順序中約五個或更多個的 氨基酸。具有與訊tA、BicA、CCPl或LCIA基本上相同的氨基酸序列但是擁有少數的基本上不 影響SbtA、BicA、CCPl或LCIA多膚衍生物分別與SbtA、BicA、CCPl或LCIA特異的分子，如抗體 相互作用的能力的氨基酸置換的多膚是在SbtA、BicA、CCPl或LCIA多膚衍生物的定義之內 的。多膚衍生物還包括糖基化的形式，與其他分子的聚集結合物和與不相關的化學部分的 共價結合物。
[0127] 在一個實施方式中，碳酸氨鹽轉運體(例如，Sbt A、Bi CA、CCP1或LCIA基因或它們的 同源物)在適用于體內表達如，例如植物表達系統的載體中表達。碳酸氨鹽轉運體多核巧酸 插入在重組體表達載體或多個載體中。術語"重組體表達載體"是指已經通過插入或結合碳 酸氨鹽轉運體遺傳序列來操縱的質粒、病毒或其他在本領域中已知的方式。術語"質粒"通 常在本文中根據本領域技術人員熟知的標準命名規則，由在大寫字母和/或數字之前和/或 之后的小寫的P標明。在本文中公開的質粒是可商購的，公眾在無限制的基礎上可獲得的， 或可W通過常規應用眾所周知的，公開的程序由可獲得的質粒構建的。許多質粒及其他克 隆和表達載體是眾所周知的和容易獲得的，或本領域普通技術人員可W容易地構建許多適 于使用的其他質粒。運些載體轉化至適合的宿主細胞W形成用于生產多膚的宿主細胞載體 系統。
[0128] 術語重組體多核巧酸或核酸是指通過由遺傳工程技術或由化學合成通過人工操 作多核巧酸的分離的片段實現結合兩個另外分離的序列片段而制成的多核巧酸。運樣做 時，可W將期望的功能的多核巧酸區段結合W生成期望的功能的組合。
[0129] 在本文中可互換地使用的術語"分離的"或"純化的"是指核酸、多膚或其他生物部 分，其從其自然地相關聯的組分中移開。術語"分離的"可W指單獨的并且分離于在自然界 中發現該分子的整個生物體，或基本上沒有其他同樣類型的生物大分子存在下存在的多 膚。術語"分離的"相對于多核巧酸可W指核酸分子完全或部分沒有在自然界與其正常地關 聯的序列;或如其存在于自然界中，但是具有與之關聯的異源序列的序列;或脫離自染色體 的分子。通常使用分析化學技術，例如聚丙締酷胺凝膠電泳或高效液相色譜確定純度和均 勻性。在一些實施方式中，術語"純化的"是指核酸或蛋白質是至少85%純的，具體地至少 90%純的，更具體地至少95%純的，或更加具體地至少99%純的。
[0130] 術語轉基因是指包含編碼蛋白質或RNA分子的編碼序列的重組體多核巧酸或核 酸。
[0131] 碳酸氨鹽轉運體多核巧酸插入適合于植物、細菌、酵母、昆蟲、兩棲動物或哺乳動 物細胞中的表達的載體中，該載體進一步包含在植物、細菌、酵母、昆蟲、兩棲動物或哺乳動 物細胞中表達核酸分子所需的，與編碼碳酸氨鹽轉運體的核酸分子可操作地連接的調控元 件。用于植物表達適合的載體包括T-DNA載體。"可操作地連接"是指其中如此描述的組分處 于允許它們W它們希望的方式作用的關系的排列（jux化postion)。連接與編碼序列可操作 地連接的表達控制序列從而在與表達控制序列相適合的條件下實現編碼序列的表達。如在 本文中使用的術語"表達控制序列"是指調節其可操作地連接的核酸序列的表達的核酸序 列。當表達控制程序控制和調節核酸序列的轉錄和翻譯(視情況)時，表達控制程序可操作 地連接至核酸序列。因此，表達控制序列可W包括適當的啟動子、增強子、轉錄終止子、蛋白 質編碼基因之前的起始密碼子(即ATG)、內含子的剪接信號(如果存在內含子的話）、基因的 正確讀取框架的維護W允許mRNA正確的翻譯，W及終止密碼子。術語"控制序列"旨在至少 包括其存在可W影響表達的組分，并且還可W包括其存在是有利的另外的成分，例如，前導 序列和融合配偶體(fusion padner)序列。表達控制序列可W包括啟動子。"啟動子"是指 足W引導轉錄的最小序列。還包括足W致使啟動子依賴的基因表達對細胞類型特異、組織 特異是可控制的，或可W由外部信號或試劑誘導的那些啟動子元件，運種元件可W位于基 因的5'或3'區域。包括組成型和誘導性啟動子兩者。如果啟動子是誘導型的，存在顯示表達 的介導調節的序列從而只有當植物或植物組織可使用誘導物(例如光)時轉錄相關的序列。 示例性的啟動子是35S花挪菜花葉病毒(CaMV)啟動子，提供基礎表達并避免轉基因植物的 過表達。
[0132] 關于編碼序列，術語"植物可表達"是指編碼序列(核巧酸序列）可W有效地由植物 細胞、組織和/或整個植物表達。如在本文中使用的，植物可表達的編碼序列具有符合在植 物細胞中可接受的基因表達的GC組合物，足夠低的CpG含量從而編碼序列的表達不會受植 物細胞的限制，W及符合植物基因的密碼子使用。在期望植物可表達的基因的特性與那些 自然存在的基因相同時，植物可表達的同源物會具有同義的編碼序列或基本上同義的編碼 序列。基本上同義的編碼序列是其中存在編碼與比較序列類似的氨基酸的密碼子，或如果 取代的氨基酸在性能上與其替換的氨基酸不類似，該變化對至少一種該酶的底物的酶活性 沒有顯著的影響的序列。如在本文中討論的，應充分理解在大多數情況下，氨基酸序列存在 一些靈活性因而功能不會顯著地變化。氨基酸序列中的保守變化和生成的類似的蛋白質可 W容易地使用如本文中公開的那些流程來測試。在期望植物可表達的基因具有不同的性能 時，氨基酸序列與野生型的基因相比可W存在變化，并且增強的光合作用的性能可W容易 地如本文中描述的確定。
[0133] "植物可表達的轉錄和翻譯調節序列"是可W在植物、植物組織和/或植物細胞中 起作用W影響它們結合的核巧酸序列的轉錄和翻譯表達的那些。包括定性地控制基因表達 (響應于環境信號如光，或W組織特異的方式打開或關閉基因表達)的5'序列和有利地增加 下游基因表達的水平的定量調節序列。用作翻譯控制序列的序列基序的實例是核糖體結合 位點序列。聚腺巧酸化信號是位于祀序列下游的轉錄調節序列的實例。示例性的側翼序列 包括根瘤±壤桿菌Ti質粒的nos基因的3'側翼序列。還可W利用細菌的merA編碼序列的上 游未翻譯序列W改善植物中其他序列的表達。
[0134] 植物可表達的轉錄調節序列可選地包含組成型啟動子W驅動貫穿整個植物或大 部分的植物組織的基因表達。在一個實施方式中，組成型啟動子在比單子葉植物 (endogenous plant)基因啟動子更高的水平下驅動基因表達。在一個實施方式中，組成型 啟動子在至少比單子葉植物基因啟動子至少兩倍更高，具體地至少五倍更高，并且更具體 地至少十倍更高的水平下驅動基因表達。適合的組成型啟動子包括植物病毒啟動子如花挪 菜花葉病毒(CaMV)35S和19S啟動子。示例性的植物病毒啟動子是花挪菜花葉病毒35S啟動 子。適合的組成型啟動子進一步包含組成地表達的植物基因的啟動子，如植物泛素、 Rubi SCO，和肌動蛋白啟動子如ACTl和ACT2植物肌動蛋白基因。示例性的植物基因啟動子包 括來自擬南芥的4機2啟動子（座位413618780;56〇10^):12)和來自水稻的4(：1'1啟動子 (GenBank登錄號S44221.1;SEQ ID NO: 13)。
[0135] 在調控元件將連接至組成型啟動子時，通常使用截短的（或最小的）啟動子，例如 截短的花挪菜花葉病毒的35S啟動子。其他組成型啟動子的截短的版本也可W用于提供 CAAT和TATA同源區域;運種啟動子序列可W源自根瘤±壤桿菌T-DNA基因如nos、ocs和mas W及植物病毒基因如CaMV 19S基因或擬南芥的ACT2基因的那些。在本文中具體地舉例的翻 譯控制序列是細菌信號的ATG翻譯起始密碼子的8和13上游之間的核巧酸并且來自植物的 ATG翻譯起始密碼子的1至7上游核巧酸。
[0136] 最小啟動子含有RNA聚合酶結合和引發轉錄所需的DNA序列信號。對于RNA聚合酶 II啟動子，該啟動子是由轉錄起始位點的約20至50堿基對上游的TATA同源序列基序和轉錄 起始位點的約50至120堿基對上游的CAAT同源序列基序所識別的。按照慣例，轉錄上游的核 巧酸由延伸自起始位點的上游(在5'方向）逐漸增大的數目開始。在一個實施方式中，在植 物組織中由最小啟動子引導的轉錄是較低的并且不會正面或負面地響應環境的或發育信 號。示例性的適合用于植物的最小啟動子是截短的CaMV 35S啟動子，其含有35S基因的-90 至+8的區域。在期望高水平的基因表達時，可W將上調基因表達水平的轉錄調節序列與在 其中使用的最小啟動子可操作地連接。運種定量的調節序列列舉為轉錄增強調節序列如增 強子。
[0137] 在一個實施方式中，植物可表達的轉錄調節序列包括組織或器官特異的啟動子W 在選擇的器官如根或芽W及其中的組織中驅動基因表達。在一個實施方式中，器官特異的 啟動子驅動地下的組織如根和根毛中的基因表達。在一個實施方式中，器官特異的啟動子 驅動地上組織如芽和葉中的基因表達。示例性的葉特異的啟動子是SRSl啟動子.在一個實 施方式中，器官特異的啟動子在花和生殖組織中驅動基因表達。
[0138] 植物可表達的轉錄調節序列可選地包括誘導型啟動子W響應于選擇的刺激驅動 基因表達。適合的誘導型啟動子包括光誘導型啟動子如SRSl啟動子，和葉綠素 A/13結合蛋 白可光誘導轉錄調節序列。
[0139] 用于構建重組DNA分子的載體的選擇取決于期望的功能性，例如復制、蛋白質表達 W及要轉化的宿主細胞。在一個實施方式中，載體包含原核復制子，即當引入原核宿主細胞 如細菌宿主細胞時，具有引導自主復制并染色體外維持重組DNA分子的能力的DNA序列。此 夕h載體還可W包含，當引入那些轉化細胞中時，其表達為細菌宿主細胞帶來選擇性優勢， 如耐藥性的基因。適合的細菌耐藥性基因是帶來對氨節西林或四環素（W及其他選擇性試 劑)的耐性的那些。新霉素憐酸轉移酶基因具有其在真核W及原核細胞中表達的優勢。
[0140] 載體通常包括對于插入重組DNA分子方便的限制位點。適合的載體質粒包括可獲 得自 BioRad Laboratories (Richmond，Cal if.)的pUC8、pUC9、地R322和地R329 W及可獲得 自曲a;rmacia(Piscataway，N.J.)的pPL、地和K223 W及可獲得自 Stratagene化a Jolla, Calif .)的pBLUESCRIPT'K和pBS。適合的載體包括，例如可獲得自Stratagene化a Jol Ia，Cal if.)的包括AZAP載體的A隧菌體載體。其他示例性的載體包括pCMU。其他適當的 載體還可W根據已知的方法合成;例如，載體pCMU/K哺pCMUII，其是pCMUIV的修飾。
[0141] 能夠在植物細胞中表達重組體核酸序列并且能夠在宿主植物細胞中引導穩定整 合的適合的表達載體包括源自根瘤±壤桿菌的腫瘤誘導(Ti)質粒的載體，和一些其他已知 在植物中作用的表達載體系統。例如，見Verma et al. ,NO.W087/00551通過引證結合在本 文中。其他適合的表達載體包括用于在轉基因植物中表達蛋白質的通路克隆（gateway cloning)相容植物目標載體，例如pEarleyGate 系列化 arley et al. The Plant Journal Volume 45,Issue 4,pages 616-629,February 2006)。
[0142] 表達和克隆載體可選地含有可選擇標記，即編碼用該載體轉化的宿主細胞生存或 生長所需的蛋白質的基因。雖然運種標記基因可W攜帶在另一多核巧酸序列上共同引入宿 主細胞，其最經常包含在克隆載體上。僅標記基因已經引入其中的那些宿主細胞會在選擇 性的條件下生存和/或生長。適合的選擇基因編碼的蛋白質(a)帶來對抗生素或其他毒性物 質，例如氨節西林、新霉素、甲氨蝶嶺等的抗性；（b)補足營養缺陷的缺點;或(C)提供不可由 復合培養基獲得的關鍵營養素。適當的可選擇標記的選擇將部分取決于宿主細胞。
[0143] 選擇轉基因植物最常使用的標記之一是對草錠麟（W各種商品名包括Basta和 Finale出售的除草劑)的耐性。對草錠麟的耐性是由編碼草下麟乙酷轉移酶(PAT)的細菌雙 丙氨麟抗性基因（BAR)帶來的。草錠麟選擇的主要優點是其可^在±壤中生長的植物上進 行并且不需要使用無菌技術。
[0144] 在一個實施方式中，將碳酸氨鹽轉運體編碼序列克隆入適用于在不同的組成型啟 動子，包括CaMV 35S啟動子W及來自擬南芥和水稻的肌動蛋白啟動子的控制下在亞麻莽中 表達的載體中。在一個實施方式中，由器官或組織特異的或誘導型的啟動子調節碳酸氨鹽 轉運體編碼序列。示例性的組織特異啟動子是葉特異的SRSl啟動子。在一個實施方式中，將 碳酸氨鹽轉運體編碼序列克隆入包含啟動子、方便的克隆位點和nos轉錄終止子(NOSt)的 植物表達盒構建體或載體中。在一個實施方式中，將碳酸氨鹽轉運體克隆入祀arlygate質 粒中的植物表達盒中。
[0145] 使用表達載體其他DNA轉化宿主細胞是通過本領域技術人員眾所周知的常規方法 進行的。"轉化"是指結合新的DNA(即細胞外源的DNA)后在細胞中誘導的永久的或暫時的遺 傳變化。在細胞是植物細胞時，永久的遺傳變化通常是通過將DNA引入細胞的基因組實現 的。"轉化細胞"或"宿主細胞"是指借助重組DNA技術將編碼碳酸氨鹽轉運體（例如SbtA、 BicAXCPl或LCIA多膚）的DNA分子或其片段引入其中（或引入其前體)的細胞(例如原核的 或真核的）。
[0146] 在本發明上下文中，重組體宿主細胞是遺傳地修改W含有分離的DNA分子的那些。 可W通過適合于特定的細胞類型的方式引入DNA，包括但不限于轉染、轉化、脂質轉染或電 穿孔。
[0147] 本文還包括已經用碳酸氨鹽轉運體基因轉化的轉基因植物。"轉基因植物"是遺傳 地修改W含有并表達重組DNA序列為調控RNA分子或蛋白質的事物。如在本文中具體列舉 的，轉基因植物是遺傳地修改W含有并表達與在植物細胞或組織或整個植物中作用的轉錄 控制序列可操作地連接或在其調控控制下的重組DNA序列。如在本文中使用的，轉基因植物 還包含初始轉基因植物的后代，其中那些后代含有并且能夠在本文中描述的植物可表達的 轉錄控制序列的調控控制下表達重組體編碼序列。含有轉基因胚的種子包括在該定義之 內。
[0148] 表達重組體基因的，轉基因植物的群體之內的單株植物可W具有不同的基因表達 水平。不同的基因表達歸因于多種因素，包括重組體基因的多重拷貝、染色質的影響和基因 抑制。因此，轉基因植物的表型可W測量為群體內的單個植物的百分比。在一個實施方式 中，大于或等于約25%的轉基因植物表達表型。具體地，大于或等于約50%的轉基因植物表 達表型。更具體地，大于或等于約75%的轉基因植物表達表型。表型是增加的C〇2同化、降低 的蒸騰速度、增加的水分利用率、增加的氮利用率或增加的種子產量。
[0149] 轉基因植物是用包含與植物可表達的轉錄調節序列可操作地連接的碳酸氨鹽轉 運體編碼序列的重組體多核巧酸或核酸分子轉化的。適合的碳酸氨鹽轉運體編碼序列包括 與碳酸氨鹽轉運體基因同源的序列。示例性的碳酸氨鹽轉運體基因包括集胞藻屬 PCC6803SbtA(沈Q ID N0:1)、聚球藻屬PCC7002BicA(沈Q ID N0:3)、萊茵衣藻CCPUSEQ ID N0:5)和萊茵衣藻LCIA(SEQ ID N0:7)。轉基因植物表達異源的碳酸氨鹽轉運體蛋白質，其 局部化至植物的葉綠體被膜，例如內包膜。在一個實施方式中，碳酸氨鹽轉運體是與CCPl蛋 白質同源的。適合的碳酸氨鹽轉運體蛋白質包括來自藍藻細菌的碳酸氨鹽轉運體蛋白質。 示例性的碳酸氨鹽轉運體蛋白質包括集胞藻屬？此68035^4(56〇10^):2)、聚球藻屬 PCC7002BicA(沈Q ID N0:4)、萊茵衣藻CCPUSEQ ID N0:6)和萊茵衣藻LCIA(SEQ ID NO: 8)。
[0150] 本發明人已經用在核基因組中編碼異源碳酸氨鹽轉運體的重組DM分子轉化了植 物。表達的重組體碳酸氨鹽轉運體局部化至葉綠體的內包膜。表達重組體異源碳酸氨鹽轉 運體基因的轉基因植物和植物細胞相比不包含重組體異源碳酸氨鹽轉運體的同樣種類的 野生型植物示出了增強的C〇2同化和降低的蒸騰速度。轉基因植物相比不包含重組體異源 碳酸氨鹽轉運體的同樣種類的野生型植物還示出了增加的種子產量。
[0151] 將包括植物可表達的基因或其他感興趣的DNA的重組DNA構建體通過適合的方法 插入植物的基因組中。合適的方法包括，例如根瘤±壤桿菌介導的的DNA轉移、直接DNA轉 移、脂質體介導的DNA轉移、電穿孔、共培養、擴散、粒子轟擊、顯微注射、基因槍、憐酸巧共沉 淀、病毒載體和其他技術。適合的植物轉化載體包括源自根瘤±壤桿菌的Ti質粒的那些。除 源自±壤桿菌的Ti或根誘導(Ri)質粒的植物轉化載體外，可W使用替代方法將DNA構建體 插入植物細胞。可W通過選擇轉化的種子或選擇轉化植物細胞并隨后再生來生產轉基因植 物。
[0152] 在一個實施方式中，在CaMV 35S啟動子和3'OCS終止子的控制下將碳酸氨鹽轉運 體編碼序列亞克隆至植物表達T-DNA雙運載體pEarleyGatelOO中。先前證明該編碼序列和 啟動子在大多數植物組織中是強烈轉錄表達的。使用真空滲入技術轉化亞麻莽，并且篩選 BASTA耐性的Tl生成種子。生產用分離的碳酸氨鹽轉運體多核巧酸轉化的轉基因植物。在一 個實施方式中，植物還表達第二碳酸氨鹽轉運體編碼序列。
[0153] 在一個實施方式中，生長(例如在±壤上)并收獲轉基因植物。在一個實施方式中， 與地下組織分開收獲地上組織。適合的地上組織包括芽、莖、葉、花、谷粒和種子。示例性的 地下組織包括根和根毛。在一個實施方式中，收獲整個植物并隨后將地上組織與地下組織 分離。
[0154] 通過W下非限制性的實施例進一步地說明本發明。技術人員想到的任何列舉的成 分和方法的變化旨在處于本發明的范圍內。
[0155] 實施例
[0156] 實施例1.碳酸氨鹽轉運體表達載體的構建和植物轉化
[0157] 訊tA基因融合的構建和祀向至葉綠體的確認
[0158]將基因構建體設計為將來自藍藻細菌的SbtA(集胞藻屬（Syncchocystis) PCC6803)碳酸氨鹽轉運體祀向至葉綠體。框內編碼的每種構建體融合來自擬南芥的 atTic20的葉綠體轉運膚（110氨基酸)至SbtA的N-末端W在由亞麻莽核基因組表達時將蛋 白質祀向至葉綠體（圖l)〇AtTic20是良好表征的葉綠體內包膜（inner envelope membrane)蛋白（Chen et al.，2000，Plant Physiol.122:813-822)。此外，含有 C-末端的基 因融合至C-Myc表位標記(邱itope化g)W便于確認在轉基因植物中的表達和局部化。示例 性的訊構建體提供為沈Q ID N0:11。
[0159] 將SbtA(atTic20TP_SbtA_cMyc)構建體插入含有上游隧菌體T7啟動子和下游T7終 止子序列的源自PUC18的載體PJe邱ress414中，W允許使用T7連接的轉錄-翻譯系統體外翻 譯構建體。
[0160] 將構建體在[35S]甲硫氨酸的存在下翻譯并用分離的魏豆葉綠體溫育W研究它們 適當地祀向至葉綠體并結合內包膜的能力。如由atTic20轉運膚的切割W產生較高移動性 的物質（泳道2)證明的，蛋白質引入反應的分析（圖2)表明體外翻譯產物(泳道1)引入至分 離的葉綠體中。處理葉綠體隨后引入嗜熱菌蛋白酶W消化葉綠體外側剩余的蛋白質表明兩 種蛋白質的處理的形式是保護不受蛋白水解的并且因此被完全引入(比較泳道2和5)。為確 認轉運體整合至葉綠體膜中，通過堿提取（alkaline extraction)和差示沉降 (differential sedimentation)分離基質和膜部分。隨膜顆粒部分分離的轉運體（比較泳 道6和7)符合適當的插入。
[0161] 將[35S]甲硫氨酸標記的atTic20TP_SbtA_cMyc引入分離的魏豆葉綠體中，并且隨 后將葉綠體分離W產生內包膜、基質和類囊體部分。將分布與引入atTic20的那些、真實的 內包膜蛋白和Rubisco的小亞基（SSU)，已知的基質蛋白質相比較。圖4示出atTic201T_ SbtA_cMyc被引入，處理成其成熟形式(SbtA_cMyc)，并主要結合至膜部分（圖4A，第二子圖， 比較泳道1、2和3)。訊tA_cMyc主要隨內包膜分離（圖4A，第二子圖，比較泳道4-6和圖4B)。大 于75%的蛋白質與內包膜相結合（圖4B)。該分布模式與引入的前atTic20(pre-atTic20) (圖44，第立子圖和4B)相似，表明SbtA_cMyc適當地局部化至內包膜。相對地，引入的SSU幾 乎唯一地局部化至基質部分（圖4A底部子圖和4B)。體外引入試驗的結果是明確的，并且因 此我們已經將訊tA碳酸氨鹽轉運體祀向至葉綠體的內包膜。
[0162] 通過核轉化構建用于將訊tA融合物引入植物的轉化載體
[0163] 將單獨的編碼atTi c20TF*_SbtA_cMyc的單基因構建體插入基于祀ar IeyGate 100 (PEG 100)的，含有修改的35S花挪菜花葉病毒(CaMV)啟動子的雙植物轉化載體中W提供在 轉基因植物中的基礎表達和避免過表達。將運些構建體（圖3; "PEG IOOSbtA")由±壤桿菌 介導的，基于確立的方法的化u&Kang，2008，Plant Cel 1 Rep，27，273-278)花器浸薩轉化法 (floral dip transformation)轉化至亞麻莽中。對每種載體轉化45-50株植物。收集來自 TO植物的種子。
[0164] 使用存在于T-DNA插入中的BASTA可選擇標記篩選來自運些植物的Tl巧苗。圖5示 出了通過施加200mg/L的BASTA除草劑成功選擇Tl巧苗(seedling)的實例（圖5,比較A和B)。 移植耐BASTA的植物（圖5C)并且使用來自T1品系的基因組DNA與基因特異性引物(Sb tA)或 對照引物(肌動蛋白）的PCR的基因分型確定該品系為atTi c20TP_SbtA_cMyc轉化體(見圖5D 中的實例）。野生型亞麻莽基因組DNA對肌動蛋白對照是陽性的，但是缺乏轉基因（圖5D)。
[01化]將亞麻莽葉綠體從由atTi c20TP_SbtA_cMyc構建體表達SbtA_cMyc的品系中分離。 在分離葉綠體之后，使用抗-CMyc抗體的免疫印跡實驗示出轉基因的蛋白質局部化至葉綠 體，處理至其成熟形式，并且結合至葉綠體膜（圖7B)。選擇純合的T3轉基因品系用于光合作 用分析。
[0166] 表達來自藍藻細菌的BicA的亞麻莽核轉化體的生成
[0167] 在祀G 100中生成與上述的對于SbtA的那些相似的表達藍藻細菌BicA碳酸氨鹽轉 運體的構建體(見圖1和圖3)。
[0168] 將運些構建體（"pEG 100BicA_cMyc")通過基于確立方法的，±壤桿菌介導的花器 浸薩轉化法轉化至亞麻莽中。對每種載體轉化45-50株植物，并且收集來自TO植物的種子。 使用如上文描述的存在于T-DNA插入中的BASTA(草錠麟)可選擇標記篩選來自運些植物的 Tl巧苗。通過基因組DNA的PCR確認Tl轉化植物（圖加）。將亞麻莽葉綠體從由atTic20TP_ BicA_cMyc構建體表達BicA的品系中分離。在分離葉綠體之后，使用抗-cMyc抗體的免疫印 跡實驗示出轉基因蛋白質局部化至葉綠體，處理至其成熟形式，并且結合至葉綠體膜（圖 7A)。
[0169] 隨后，選擇純合的T3轉基因品系用于光合作用分析。
[0170] 表達來自衣藻的CCPl碳酸氨鹽轉運體的亞麻莽核轉化體的生成
[0171] 來自衣藻的CCPl基因作為增加葉綠體[0)2]的轉運體是對SbtA有吸引力的替代。 CCPl已經示出增加低[C02]耐受性并且應當含有對于葉綠體祀向的所有植物特異信息，
[0172] 我們將稠合至cMyc表位標記的CCPl插入pEG 100雙運載體（圖3)和轉化的亞麻莽 屬植物。使用BASTA選擇篩選T1轉化體(作為實例見圖5A-C)并由PCR確認基因型（圖5D)。
[0173] CCPLcMyc品系示出較快的Tl成熟。使用可商購的cMyc單克隆抗體通過Tl植物提 取物的免疫印跡法測試轉基因的表達。由5個隨機選擇的5周大的Tl轉化體和對照野生型植 物制備葉提取物（圖6A)。將對應來自每種品系的25iig和50iig蛋白質的提取物由SDS-PAGE解 析并免疫印跡CCP l_cMy C的存在。圖6表明所有檢驗的CCP l_cMy C的T1品系（圖6A)表達預測 的分子質量的免疫活性蛋白質。野生型對照沒有展現出免疫活性。品系展現出相當大的蛋 白質表達的可變性，提供一系列的用于基因對光合參數的影響的表型分析的植物。收集來 自Tl轉化體的T2種子。
[0174] 選擇純合的T3品系用于表達CCP l_cMy C的CCP1亞麻莽品系。如W下描述的對選擇 的純合品系分析轉運體對光合作用(C〇2同化)的影響、水和氮的利用率和種子產量。
[0175] 表達來自衣藻的LCIA的亞麻莽核轉化體的生成
[0176] 在祀G 100中生成與上文對于CCPl表達所描述的相似的表達來自衣藻的LCIA的構 建體(圖3)。
[0177] 將運些構建體通過基于確立方法的，±壤桿菌介導的花器浸薩轉化法轉化至亞麻 莽中。對每種載體轉化45-50株植物。收集來自TO植物的種子。
[0178] 使用BASTA選擇篩選Tl轉化體(作為實例見圖5A-C)并通過PCR確認基因型（圖5D)。 選擇表達單獨的來自衣藻的LCIA基因的LCIA亞麻莽品系的純合T3品系并隨后分析各種功 能。
[0179] 使用可商購的cMyc單克隆抗體通過Tl植物提取物的免疫印跡法測試轉基因的表 達。由5個隨機選擇的5周大的Tl轉化體和對照野生型植物制備葉提取物（圖6B)。將來自每 種品系的對應25iig和50iig的蛋白質的提取物由SDS-PAGE解析并免疫印跡LCI A_cMy C的存 在。圖6表明所有檢驗的LCIA_cMy C的T1品系（圖6B)表達預測的分子質量的免疫活性蛋白 質。野生型對照沒有展現出免疫活性。
[0180] 堆疊構建體和表達堆疊構建體的植物轉化體的生成
[0181] 除單基因表達構建體外，生成其中表達多個碳酸氨鹽轉運體基因的多個"堆疊 (stacked)"表達構建體。構建與上文對于藍藻細菌轉運體或衣藻轉運體描述的相似，對于 特定的基因適當的是"堆疊"在轉化入植物中的表達載體中。
[0182] 具體地，制成表達來自藍藻細菌的BicA和SbtA兩者的堆疊基因構建體并隨后轉化 入亞麻莽中。
[0183] 另外，制成表達來自衣藻的CCPl和LCIA兩者的堆疊基因構建體并隨后轉化入亞麻 莽中。
[0184] 分離并測試生成自每種堆疊構建體的T3植物。
[0185] 在下表中提供相關的亞麻莽轉基因品系的狀態的總結。
[0186] 表5.單獨和共同表達的碳酸氨鹽轉運體轉基因品系的總結
[0187]
[0188] 實施例2.植物轉化體的功能測試
[0189] 在相同條件下生長的CCPl亞麻莽轉基因品系和野生型植物的光合參數
[0190] 檢驗四種各自為單獨的CCPl亞麻莽轉化體的純合T3品系W確定它們詳細的光合 和碳酸氨鹽轉運性能。對每種品系在最少=個生物復制體(=株植物)上進行所有的測量。 我們在幾種CCPl亞麻莽品系中確定了相比野生型植物的顯著差異。
[0191] 使用具有3cmX2cm采樣室的便攜式光合作用系統化I-6400XT，Li-C0R Inc.， Lincoln,肥，USA)測量凈光合作用、細胞間C〇2(Ci)、氣孔導度（Stomatal conductance)和 蒸騰作用。在4-5周大的植物上在開花之前測量氣體交換。
[0192] 在恒定的400皿ol/m2的C〇2濃度(213皿ol/m2的平均Ci)下，我們觀察到植物中CCP 1亞麻莽的同化速率的最小差異（圖8A)。然而，我們觀察到單獨的CCPl亞麻莽品系與野生型 相比Ci(圖8B)、氣孔導度（圖8D)和蒸騰速率（圖8E)的顯著差異。在轉基因品系中相比野生 型植物氣孔導度降低27-32%之間，并且蒸騰作用降低30-31%。當對Ci校正同化速率時，品 系CCPl-20、CCPl-34和CCP1-48各自展現出19%、14%和17%的同化作用/(：1增加（圖8〇。
[0193] 運些數據表示轉基因植物通過降低蒸騰作用和氣體交換（即關閉氣孔)來響應較 高的C〇2轉運能力。
[0194] 水利用率(WUE)和氮利用率(NUE)
[01M]基于對CCPl亞麻莽轉基因植物觀察到的顯著的氣孔導度和蒸騰作用降低（圖8)， 我們設置了表型測試W就水利用率比較CCP1-20和野生型植物。基本原理是基于預期降低 的蒸騰作用會導致降低的水利用并增加對減少灌概的耐受性。
[0196] 將轉基因和WT巧苗在Pro-mix生長培養基上萌發并將兩周大的巧苗移植至5"的花 盆。作為第一次定性測量W肥，我們使CCP1-20和野生型植物生長至開花起始(37天)或種子 成熟起始(50天）的階段并完全停止誘水7天，其中每天觀察枯萎的癥狀。CCP1-20在兩個階 段均展現出干旱耐受性的顯著增加（圖9)。在缺水7天之后CCP1-20植物保持健康，然而野生 型植物枯萎并開始干枯。
[0197] 檢驗運些植物的水利用率(WUE)和氮利用率(NUE) W測試由于降低的C〇2需求增加 的C〇2同化將導致氣體交換的變化和由于減少的rubisco合成導致氮需求減少的假說。
[019引通過確定在受限的水情下生長的野生型和CCP1-20植物的葉水含量來定量地測量 WUE。如Ba;rrs(Australian Jourmal of Biological Sciences, 1962,15:413-428)中描述 的，在相等尺寸的葉上測量相對葉水含量。在標準溫室條件下WT和CCPl-20之間的水含量沒 有顯著不同。在《250ml/天的水下水含量的差異是可檢測的。圖10示出了在250ml/天和 175ml/天的水下的葉水含量。選擇運些值是因為它們分別對應生長季節過程中~15in和~ IOin的降雨量（Spring Camelina Production Guide 2009) oWT植物的田地試驗表明當降 雨從 10增加至 15in/季時產量增加50% (Spring Camelina Production Guide 2009)。 CCPl-20植物在250ml/天和175ml/天的水下分別展現出相對WT 25%和71 %的水含量增加。 在175ml/天下的水含量僅比在標準溫室條件下觀察到的低27%。運些數據表明CCP1-20植 物的WUE顯著增加。
[0199] 在恒定的大氣[C02]下在水受限條件下在更大的代表組的CCPl品系中測量C〇2同 化示出了相對于野生型植物2-14%之間的同化增加（圖11A)。除了CCP1-34外，由每株植物 的種子重量測量的，CCPl亞麻莽植物的種子產量在運些條件下在所有品系中增加了 7-50% 之間（圖11B)。在所有的CCPl轉基因品系中相比野生型植物沒有檢測到種子的含油量的顯 著差異(數據未示出）。
[0200] 使用兩個參數測量氮利用率(NUE)(圖12)。首先，作為葉含氮量的函數測量C〇2同 化速率（圖12A)。將兩周大的WT和轉基因植物移植至充滿賠石(vermiculite)的5'花盆中。 將植物用含有如標明的不同濃度的氮的霍格蘭氏營養液（Hoagland ' S nutrient solution)處理。在4周大植物的成熟葉上測量凈光合作用。然后收獲葉片，干燥并通過催化 燃燒確定總含氮量。在12ppm的氮肥料施加下CCP1-20展現出相比野生型29%的NUE的增加。 在25ppm的氮下CCP1-20和野生型植物之間的NUE的差異降低至19%并且在更高的氮施加下 是不可辨別的。1化pm和25ppm的氮分別相當于±壤中24磅/英畝和50磅/英畝的田地施加。 在田地中推薦的施加率是30磅/英畝（Spring Camelina Production Guide 2009)。在 的氮下在CCPl-20和野生型之間觀察到15%的碳/氮含量比差異（圖12B)，符合CCPl-20 中 NUE 的增力日。我們的標準溫室施加為~ 20 化 pm 的氮。運些數據表明CCPl-20 相對于野生 型植物展現出顯著增加的饑正。在試圖模仿田地條件的條件下差異最為明顯。
[0201] 我們還使用A/Ci曲線(凈C〇2同化速率A對比計算的氣孔下C〇2濃度Ci)分析了在不 同的氮肥施加下生長的野生型和CCP1-20植物的光合作用參數。測量是用LI-6400XT在植物 中進行的。在所有的氮濃度下C〇2同化速率對CCP1-20保持接近恒定，但是對處于SOppmW下 氮濃度下的野生型下降（圖13A)。在25和12ppm的氮下，CCP1-20植物分別展現出相比野生型 植物21%和35%更高的同化速率（圖134)。我們還對第二品系，0^1-48生成了在12口口111的氮 肥下的A/Ci曲線，W支持用CCP1 -20觀察到的增加的氮利用率。兩種品系（CCP1 -20和CCP1 -48)均示出類似的A/Ci曲線，其中在4(K)ppm的Ci下觀察到C02同化速率相對于野生型植物增 加 30%(圖 13B)。
[0202] 在較低的氮肥施加下增加的NUE轉化為顯著的種子產量增加。CCP1-20的種子產量 (種子重量/植物）在12ppm的氮下比野生型高56% (圖14)。在標準溫室肥料條件下 I(K)PPm N)沒有觀察到野生型和CCP1-20之間種子產量的顯著差異（圖14)。
[0203] 西馬薩諸塞的田地試驗中CCPl轉基因品系的生物質和種子產量
[0204] 在西馬薩諸塞的田地試驗中使用25平方英尺的區塊測試代表性的CCPl亞麻莽品 系CCPll-18、CCPl-20和CCP1-48。在5月23日開始栽種。在7月29日開始CCPl亞麻莽品系的收 獲并在8月11日完成。在8月4日開始野生型對照區的收獲并在8月25日完成。
[0205] CCP1-20和CCP1-48品系一致地展現出較高的生物質產量，包括較高的種子數/植 物，種子數/總生物質，W及總種子和生物質重量/英畝（圖15)。該增加符合對兩種運些品系 在溫室和生長室中的觀察。此？1-20和〇^1-48的種子重量/英畝分別增加38%和51.5%。 CCP1-18品系由于較低的出苗率(seedling establishment)在田地中顯著地表現不佳，并 且示出39%的種子重量/英畝的減少。
[0206] CCP1-20和CCP1-48展現出略微減少的種子大小（種子重量/100種子）（圖16)，表明 種子產量的總體增加很大程度上是由于每株植物產生的種子數目的增加。運些數據也與溫 室的研究一致。
[0207] 所有的轉基因的種子的含油量與野生型對照不能區分，其中含量范圍為32-34% (重量/重量）的油（圖17)。在CCP1-20和CCP1-48中總體油產量(磅/英畝）分別增加43%和 76%。與其表現不佳一致，品系CCP1-48示出37%的油產量減少。
[020引如由田地試驗的栽種和收獲安排表明的，表達CCPl構建體的品系在對照品系前一 至兩周成熟。運顯示該特性也可能影響亞麻莽的壽命周期和/或誘導轉基因植物的早期衰 老。
[0209] 在相同條件下生長的訊tA或BicA轉基因品系和野生型植物的光合參數
[0210] 我們還分析了表達BicA和SbtA微生物碳酸氨鹽轉運體的純合亞麻莽BicA和SbtA T3純合品系中的光合參數。一些品系展現出顯著增加的C〇2同化（圖18A)。當由Ci調節時（圖 18B) ,SbtA-S和BicA-IO在275WH01 C〇2mol空氣-1的恒定Ci下在統計上展現出相比野生型植 物15%的同化的顯著增加（圖18C)。
[0211] 實施例3.用載體轉化各種農作物
[0212] 玉米的±壤桿菌介導的轉化
[0213] 本發明中提供的載體可W遵循先前所描述的流程用于玉米的±壤桿菌介導的轉 化（Frame et al.,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol.1,PP 185-199, Hum曰n曰 Press)O
[0214] 植物材料:將在溫室中生長的植物用作外植體來源。在授粉后9-13天收獲穗(ear) 并用80%的乙醇表面殺菌。
[0215] 外植體分離、侵染和共培養:將未成熟的合子胚（1.2-2.Omm)由單獨的核屯、無菌剖 開并在根瘤±壤桿菌菌株EHAlOl培養基（在轉化之前在補充有IOOiiM的乙酷下香酬的5ml N6介質中生長用于刺激細菌Vir基因2-化）中在室溫下溫育5分鐘。將傳染的胚盾片側向上 移至共培養基(N6瓊脂凝固的培養基，含有300mg/l的半脫氨酸、5iiM的硝酸銀和IOOiiM的乙 酷下香酬)并在20°C下在黑暗中溫育3天。將胚移至含有lOOmg/1的頭抱嚷目虧、lOOmg/1的萬 古霉素和如M的硝酸銀的N6靜息培養基(resting medi皿)并在28°C下在黑暗中溫育7天。
[0216] 愈合組織選擇：將所有的胚移至第一選擇性培養基（補充有1.5mg/l的除草膚 (bialaphos)的上述靜息培養基)并在28°C下在黑暗中溫育2周，隨后在含有3mg/l除草膚的 選擇性培養基上繼代培養。在相同的培養基上每2周通過繼代培養增殖并維持愈合組織的 增生塊。
[0217] 植物再生和選擇:將耐除草膚的胚胎發生愈合組織品系移至再生培養基K補充有 60g/l薦糖、1.5mg/l除草膚和lOOmg/1頭抱嚷目虧（cefotaxime)并用3g/l Gelrite固化的MS 基礎培養基）并在25°C下在黑暗中溫育2至3周。將在運期間形成的成熟胚移至再生培養基 IK與再生培養基I相同，具有3mg/l的除草膚）用于在光下發芽（25°C ,SO-I(K)地/WVs光強 度，16/化光周期）。再生的植物準備好在10-14天內移至±壤。
[0218] 高梁的±壤桿菌介導的轉化
[0219] 本發明中提供的載體可W遵循先前所描述的流程用于高梁的轉化(Zhao ,2006， Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol. I,pp 233-244,Humana Press)。
[0220] 植物材料:將在溫室、生長室或田地條件下生長的植物用作外植體來源。在授粉后 9-12天收獲未成熟的圓錐花序(panicle)并將單獨的核屯、化ernel)用50%的漂白劑表面殺 菌30分鐘隨后用無菌蒸饋水洗涂=次。
[0221] 外植體分離、侵染和共培養:將未成熟的合子胚（1-1.5mm)由單獨的核屯、無菌剖開 并在根瘤±壤桿菌菌株LBA4404懸浮液中（在PHI-I液體培養基(補充有的lg/1酪蛋白氨基 酸kasamino acid)、l .5mg/l的2,4-0、68.5旨/1薦糖、36旨/1葡萄糖和100測乙酷下香酬）中） 在室溫下溫育5分鐘。將侵染胚W胚軸向下移至共培養PHI-T培養基（瓊脂凝固的修改的 PHI-I 培養基，含有 2.0mg/l 的2,4-D、20g/l 薦糖、lOg/1 葡萄糖、0.5g/l 的 MES、0.7g/l 脯氨 酸、lOmg/1抗壞血酸和IOOiiM乙酷下香酬)并在25°C下在黑暗中溫育3天。為靜息，將胚移至 補充有lOOmg/1簇節青霉素的相同的培養基(沒有乙酷下香酬）中并在28°C下在黑暗中溫育 4天。
[0222] 愈合組織選擇：將胚移至第一選擇性培養基PHI-U(補充有1.5mg/l的2,4-D、 IOOmg^簇節青霉素和5mg/l的PPT而沒有葡萄糖和乙酷下香酬的上述PHI-T培養基)并在28 °(：下在黑暗中溫育2周隨后在含有1〇111肖八的??1'的選擇性培養基上繼代培養。在10周的選擇 過程中對于剩余的愈合組織通過在相同的培養基上每2周繼代培養來增殖和維持愈合組織 的增生塊。
[0223] 植物再生和選擇:將耐除草劑愈合組織移至再生培養基I (補充有0.5mg/l激動素 的PHI-U培養基)并在28°C下在黑暗中溫育2至3周用于愈合組織生長和胚發育。將培養物移 至再生培養基IK具有〇.5mg/l玉米素、700mg/l脯氨酸、60g/l薦糖和lOOmg/1簇節青霉素的 MS基礎培養基）用于芽(shoot)的形成(28°C，黑暗中）。2-3周之后，將芽移至生根培養基(補 充有20g/l薦糖、0.5mg/l的NAA和0.5mg/l的IBA的再生II培養基)并在25°C，270地/WVs的 光強度下W16/她的光周期生長。當再生的植物為8-lOcm高時，可W將它們移至±壤并在溫 室條件下生長。
[0224] 水稻的±壤桿菌介導的轉化
[0225] 本發明中提供的載體可W遵循先前所描述的流程用于水稻的±壤桿菌介導的轉 化（Herve and Kayano,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol. I,pp 213-222,Humana Press)。
[O。6]植物材料:將來自生長在溫室中的梗米（japonica rice)種類的成熟種子用作外 植體來源。
[0227]培養物轉化和選擇:將脫殼的種子用70%的乙醇表面殺菌1分鐘并用3%的次氯酸 鋼表面殺菌30分鐘隨后用無菌蒸饋水洗涂六次。將種子W胚側向上鋪板在誘導培養基 (Gelrite凝固的，補充有300mg/l酪蛋白氨基2.88g/l脯氨酸、30g/l薦糖和2mg/l的2,4-D的 N6基礎培養基)并在32°C下在連續光照下溫育5天。用根瘤±壤桿菌菌株LBA4404(來自再懸 浮在補充有IOOiiM乙酷下香酬、68.5g^薦糖和36g/l葡萄糖的N6培養基中的3天鋪板的培養 物)在室溫下侵染具有膨脹的盾片的發芽種子2分鐘，隨后移至共培養基(Gelrite凝固的N6 培養基，含有300mg/l酪蛋白氨基酸、30g/l薦糖、lOg/1葡萄糖、2mg/l的2,4-D和IOOiiM乙酷 下香酬)并在25°C下在黑暗中溫育3天。
[02%]對于轉化的胚胎發生組織的選擇，將用250mg/l頭抱嚷目虧洗涂的整個巧苗移至含 有300mg/l酪蛋白氨基酸、2.88g/l脯氨酸、30g/l薦糖、2mg/l的2,4-D、100mg/l頭抱嚷月虧、 IOOmg^萬古霉素和35111旨八的酸式硫酸鹽的N6瓊脂凝固的培養基上。將培養物在32°C下在 連續光照下溫育2-3周。
[0229] 植物再生和選擇:將抗性的增生愈合組織移至含有300mg/l酪蛋白氨基酸、500mg/ 1脯氨酸、30g/l薦糖、lmg/1的NAA、5mg/l的ABA、2mg/l激動素、lOOmg/1頭抱嚷目虧、lOOmg/1萬 古霉素和2〇111旨八的6418酸式硫酸鹽的瓊脂凝固的N6培養基上。在32°C下在連續光照下生長 一周之后，將成活的愈合組織移至補充有2g/l酪蛋白氨基酸、30g/l薦糖、30g/l山梨醇、 0.02mg/l的NAA、2mg/l激動素、lOOmg/1頭抱嚷目虧、lOOmg/1萬古霉素和20mg/l的G418酸式硫 酸鹽的MS培養基（用lOg/1的瓊脂糖凝固）并在相同的條件下另外溫育一周隨后移至具有 7g^瓊脂糖的相同的培養基上。2周之后，將出現的芽移至含有30g/l薦糖的Gelrite凝固的 不含激素的MS培養基上并在連續光照下生長1-2周W促進芽和根發育。當再生的植物為8-IOcm高時，可W將它們移至±壤并在溫室條件下生長。在10-16周之后收獲轉基因種子。
[0230] 用上壤桿菌遵循類似的流程轉化釉稻（indica rice varieties) (Datta and Datta,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,Vol. I,pp 201-212,Humana Press)。
[0231 ]甘薦的微粒轟擊介導的轉化
[0232] 可W將含有轉錄因子基因的表達盒與標記基因（例如npt)的盒子通過基因槍 (biolistics)遵循先前描述的流程共同引入甘薦之中（Taparia et al.,2012,In VUro Cell.Dev.Biol.48:15-22)。
[0233] 植物材料:將具有6-8個可見節的溫室生長的植物用作外植體來源。收集頂部并用 70%的乙醇表面殺菌。將最外的葉在無菌條件下移除并將未成熟的葉輪(leaf whorl)橫截 面(約2mm)由頂端節之上I-IOcm的區域切除。
[0234]培養起始、轉化和選擇:將分離的葉部分在補充有20g/l薦糖、1.86mg/l對氯苯氧 基乙酸(CPA)、1.86mg/l的NAA和0.09mg/l的BA的MS基礎培養基上在28°C，在30皿ol/m2/s的 光強度和16/她的光周期下培養7天。將胚發生培養物繼代培養至新鮮的培養基并用于轉 化。
[02：3日]為微粒轟擊(microprojectile bombardment)，將葉盤在基因轉移之前4小時鋪板 在補充有0.4M山梨醇的培養起始培養基上。將含有TF的表達盒和標記基因的質粒DNA (200ng)遵循先前所描述的流程沉淀在1 .Smg的金微粒(0.6皿)上(Altpeter and San^u, 2010,Genetic transformation-bioIistics,Davey&Anthony eds.,pp 217-237,Wiley, Hoboken)。將DNAQOng每次注射)通過PDS-1000 基因槍微粒遞送系統(Biorad)使用IlOOpsi 防爆片(rupture disk)、26.SmmHg的室真空和6cm.壓力的架距離遞送至外植體。將轟擊的 外植體移至上述的培養起始培養基并溫育4天。
[0236] 為選擇，將培養物移至補充有30mg/l遺傳霉素的起始培養基上并溫育10天繼W相 同條件下的另一選擇周期。
[0237] 植物再生和選擇:將培養物移至沒有CPA的上述選擇培養基上并在28°C，在10化 mol/mVs的光強度下用16/8h的光周期生長。將具有小芽（約0.5cm)的葉盤平鋪在具有 30mg/l遺傳霉素的不含激素的培養基上用于芽的生長和根的發育。在移至±壤之前，可W 將再生植物的根部浸入可商購的根部促進粉中。
[0238] 通過微粒轟擊的小麥的轉化
[0239] 本發明中提供的基因構建體可W用于通過遵循先前所描述的流程的微粒轟擊的 小麥轉化(Weeks et al.，1993,Plant I^ysiol. 102:1077-1084)。
[0240] 植物材料:來自春小麥栽培屬BobwMte的植物，生長在18-20°C日間和14-16°C夜 間溫度，1化的光周期下。在播種之后10-12周(開花之后12-16天)收集麥穗。將處于早期-中 期乳熟期（early-medium milk stage)的單獨的穎果用70%的乙醇殺菌5分鐘并用20%次 氯酸鋼殺菌15分鐘隨后用無菌水洗涂=次。
[0241] 培養起始、轉化和選擇:將未成熟的合子胚(0.5-1.5mm)在無菌條件下剖開，盾片 側向上置于培養誘導培養基(含有20g/l薦糖和1.5mg/l的2,4-D的化ytagel凝固的MS培養 基)并在27°C在光下(43皿ol/WVs)溫育3-5天。
[0242] 為微粒轟擊，將源自胚的愈合組織在基因轉移之前4小時平鋪在補充有0.4M山梨 醇的培養起始培養基上。將含有TF的表達盒和標記基因 bar的質粒DNA沉淀在0.6皿的金微 粒上并如對甘薦所描述的遞送至外植體。
[0243] 將轟擊的外植體移至愈合組織選擇培養基(含有l-2mg/l除草膚的上述培養起始 培養基)并每2周繼代培養。
[0244] 植物再生和選擇：在1-2個選擇周期之后，將培養物移至補充有0.5mg/l麥草畏 (dicamba)和2mg/l除草膚的MS再生培養基上。為根部形成，將得到的耐除草膚的芽移至不 含激素的半濃度MS培養基。將具有發育良好的根部的植物移至±壤并在移至溫室之前在21 °C下用16h的光周期(300皿ol/WVs)適應較低的濕度約2周。
[0245] 歐洲油菜的±壤桿菌介導的轉化
[0246] 植物材料:將成熟種子在10%的商用漂白劑中隨著溫和搖動表面殺菌30分鐘并用 無菌蒸饋水洗涂=次。
[0247] 培養起始和轉化:將種子平鋪在萌芽培養基(補充有30g/l薦糖的MS基礎培養基） 上并在24°C下用1化的光周期W60-8化E/mVs的光密度溫育4-5天。為轉化，將基部具有~ 2mm的葉柄的子葉自得到的巧苗切除，浸沒于根瘤±壤桿菌菌株EHAlOl懸浮液(在28°C下 4化生長自5ml的補充有適當的抗生素的最低培養基中的單個菌落）中Is并立即植入共培養 基巧有30g/l薦糖和20皿芐基腺嚷嶺的MS基礎培養基）中~2mm的深度。將接種的子葉在相 同的生長條件下溫育4她。
[024引植物再生和選擇:在共同培養之后，將子葉移至包含補充有30g/l薦糖和芐基 腺嚷嶺、300mg^特美汀(timentin)和20111旨八硫酸卡那霉素的MS培養基的再生培養基上。在 2-3周之后，將再生的芽切下并維持在含有30g/l薦糖、300111肖八特美汀和20mg^硫酸卡那霉 素的MS培養基上用于芽的伸長。將伸長的芽移至含有補充有30g/l薦糖、2mg/l嗎I噪下酸 (IBA)和500mg/L簇節青霉素的MS基礎培養基的生根培養基上。在根部形成之后，將植物移 至±壤并在生長室或溫室條件下生長至種子成熟。
[0249] 大豆的±壤桿菌介導的轉化
[0250] 將在本發明中確定的柳枝泰轉錄因子基因的大豆直系同源物（圖4)裝配至二重運 載體中（表9)并遵循先前所描述的流程用于±壤桿菌介導的大豆的轉化化O et al. ,2006， Agrobacterium Protocols Wang K.，ed.,Vol.1,PP 397-405,Humana Press)。
[0251] 植物材料:將來自生長在溫室或田地條件下的大豆植物的未成熟種子用作外植體 來源。收獲幼小的豆芙并用70%的2-丙醇表面殺菌30秒和25%次氯酸鋼(Clorox)表面殺菌 20分鐘隨后用無菌蒸饋水洗涂=次。
[0252] 培養物轉化和選擇:在無菌條件下，將未成熟種子自豆芙移出并將子葉與種皮分 離隨后在補充有30g/l薦糖、4〇111旨八的2,4-〇和40mg/l乙酷下香酬的共培養基(MS鹽和B5維 生素）中的根瘤上壤桿菌培養物(在28°C下由單個菌落生長過夜）中溫育60分鐘。將侵染的 外植體遠軸側向上鋪板在瓊脂凝固的共培養基上并在25°C下在黑暗中溫育4天。
[0253] 對于轉化組織的選擇，將用500mg/l頭抱嚷目虧洗涂的子葉遠軸側向上置于用于體 細胞胚形成的誘導的培養基上(含有30g/l薦糖、40mg/l的2,4-D、500mg/l頭抱嚷目虧和IOmg/ 1潮霉素的GelrUe凝固的MS培養基)并在25°C下W23h的光周期（10-20地/mVs)溫育2周。 在25mg/l潮霉素的存在下在相同的條件下生長另外的兩周之后，將耐抗生素的體細胞胚移 至補充有60g/l麥芽糖、500mg/l頭抱嚷目虧和1〇111旨八潮霉素的用于胚成熟的MS培養基上并W 2周的繼代培養區間在相同的條件下生長8周。
[0254] 植物再生和選擇:將得到的子葉階段的胚在25°C下在23h的光周期（60-80地/m2/ S)下干膽(desiccate)5-7天隨后在含有30g/l薦糖和500mg/l頭抱嚷目虧的MS再生培養基上 培養4-6周用于芽和根的發育。當植物為5-lOcm高時，將它們移至±壤并在環境適應7天之 后在溫室中生長。
[0255] 實施方式1.一種轉基因植物，包含異源碳酸氨鹽轉運體，其中，所述轉基因植物具 有比不包含所述異源碳酸氨鹽轉運體的相同種類的植物至少5%、至少10%、至少15%、至 少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的C〇2同化速率。
[0256] 實施方式2. -種轉基因植物，包含異源碳酸氨鹽轉運體，其中，所述轉基因植物具 有比不包含所述異源碳酸氨鹽轉運體的相同種類的植物至少5%、至少10%、至少15%、至 少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%更低的降低的蒸騰速率。
[0257] 實施方式3. -種轉基因植物，用包含與編碼異源碳酸氨鹽轉運體的多核巧酸可操 作地連接的可植物表達的轉錄調節序列的重組DNA構建體來轉化。
[0258] 實施方式4.根據實施方式1-3中任一項所述的轉基因植物，其中，不存在異源的碳 酸酢酶。
[0259] 實施方式5.根據實施方式1-4中任一項所述的轉基因植物，其中，所述碳酸氨鹽轉 運體局部化于葉綠體被膜。
[0260] 實施方式6.根據實施方式1-5中任一項所述的轉基因植物，其中，所述碳酸氨鹽轉 運體來自藍藻細菌。
[0261] 實施方式7.根據實施方式6所述的轉基因植物，其中，所述碳酸氨鹽轉運體是BicA 多膚或訊tA多膚。
[0262] 實施方式8.根據實施方式7所述的轉基因植物，其中，所述BicA多膚包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列或與SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。
[0263] 實施方式9.根據實施方式7所述的轉基因植物，其中，所述SbtA多膚包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列或與SEQ ID N0:2 95%同源的氨基酸序列。
[0264] 實施方式10.根據實施方式1-9中任一項所述的轉基因植物，其中，編碼所述碳酸 氨鹽轉運體的多核巧酸進一步包含與碳酸氨鹽轉運體編碼序列可操作地連接的編碼葉綠 體被膜祀向膚的序列。
[0265] 實施方式11.根據實施方式10所述的轉基因植物，其中，所述葉綠體被膜祀向膚的 序列包含沈Q ID NO: 10的氨基酸1至110。
[0266] 實施方式12.根據實施方式11所述的轉基因植物，其中，所述碳酸氨鹽轉運體來自 藻類。
[0267] 實施方式13.根據實施方式12所述的轉基因植物，其中，所述藻類是衣藻屬。
[0268] 實施方式14.根據實施方式13所述的轉基因植物，其中，所述碳酸氨鹽轉運體是 CCPl多膚、CCP2多膚或LCIA多膚。
[0269] 實施方式15.根據權利要求14所述的轉基因植物，其中，所述CCPl多膚包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列或與SEQ ID N0:6 95%同源的氨基酸序列。
[0270] 實施方式16.根據實施方式14所述的轉基因植物，其中，所述LCIA多膚包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與SEQ ID N0:8 95%同源的氨基酸序列。
[0271] 實施方式17.根據實施方式1-16中任一項所述的轉基因植物，其是選自由W下所 組成的組的油類作物植物:玻璃宦、蕓苔、歐洲油菜、憲菁、亞麻莽屬、大麻、紅花、挪子、海甘 藍、專距花屬、非洲油棟桐、美洲油棟桐、大豆、陸地棉、海島棉、草本棉、向日葵、亞麻、月見 草、油橄攬、水稻、篇麻、芝麻、小麥屬、玉米屬、胡桃和扁桃。
[0272] 實施方式18.根據實施方式1-17中任一項所述的轉基因植物，其中，所述植物是亞 麻莽。
[0273] 實施方式19.根據實施方式1-18中任一項所述的轉基因植物，包含至少兩種異源 碳酸氨鹽轉運體。
[0274] 實施方式20.-種重組體多核巧酸，包含與可植物表達的轉錄調節序列可操作地 連接的編碼異源碳酸氨鹽轉運體的核酸序列，其中，所述編碼碳酸氨鹽轉運體的核酸序列 可選地進一步可操作地連接至編碼葉綠體被膜祀向膚的核酸序列。
[0275] 實施方式21.根據實施方式20所述的重組體多核巧酸，其中，所述葉綠體被膜祀向 膚是擬南芥Tic20(atTic20)前體的轉運膚。
[0276] 實施方式22.根據實施方式21所述的重組體多核巧酸，其中，所述核酸序列包含 沈Q ID NO:9的殘基 1-330。
[0277] 實施方式23.根據實施方式20-22中任一項所述的重組體多核巧酸，其中，所述碳 酸氨鹽轉運體來自藍藻細菌。
[0278] 實施方式24.根據實施方式20-23中任一項所述的重組體多核巧酸，其中，所述碳 酸氨鹽轉運體是BicA多膚或訊tA多膚。
[0279] 實施方式25.根據實施方式24所述的重組體多核巧酸，其中，所述BicA多膚包含 SEQ ID N0:4的氨基酸序列或與SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。
[0280] 實施方式26.根據實施方式24所述的重組體多核巧酸，其中，所述SbtA多膚包含 SEQ ID N0:2的氨基酸序列或與SEQ ID N0:2 95%同源的氨基酸序列。
[0281 ]實施方式27.根據實施方式20所述的重組體多核巧酸，其中，所述碳酸氨鹽轉運體 來自藻類。
[0282] 實施方式28.根據實施方式27所述的重組體多核巧酸，其中，所述藻類是衣藻屬。
[0283] 實施方式29.根據實施方式20、27或28中任一項所述的重組體多核巧酸，其中，所 述碳酸氨鹽轉運體是CCPl多膚、CCP2多膚或LCIA多膚。
[0284] 實施方式30.根據權利要求29所述的重組體多核巧酸，其中，所述CCPl多膚包含 SEQ ID N0:6的氨基酸序列或與SEQ ID N0:6 95%同源的氨基酸序列。
[0285] 實施方式31.根據實施方式29所述的重組體多核巧酸，其中，所述LCIA多膚包含 SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與SEQ ID N0:8 95%同源的氨基酸序列。
[0286] 實施方式32.根據實施方式20-31中任一項所述的重組體多核巧酸，進一步包含編 碼選自FLAG、6X化S、谷脫甘膚-S-轉移酶(GST)、HA、cMyc或AcV5的表位標記的核酸。
[0287] 實施方式33.-種植物可表達的表達載體，包含根據實施方式20-32中任一項所述 的重組體多核巧酸。
[0288] 實施方式34.根據實施方式33所述的植物可表達的表達載體，包含祀arleyGate載 體。
[0289] 實施方式35.-種生產具有增強的光合作用的轉化植物的方法，所述方法包括用 根據實施方式20-32中任一項所述的重組體多核巧酸或根據實施方式33-34中任一項所述 的表達載體轉化植物細胞；由所述植物細胞生長植物直至所述植物產生種子；W及由其中 相比未表達所述異源碳酸氨鹽轉運體的相應的植物相比光合作用增強的植物選擇種子。
[0290] 實施方式36.根據實施方式35所述的方法，其中，所述植物是選自由W下所組成的 組的油類作物植物:玻璃宦、蕓苔、歐洲油菜、憲菁、亞麻莽屬、大麻、紅花、挪子、海甘藍、專 距花屬、非洲油棟桐、美洲油棟桐、大豆、陸地棉、海島棉、草本棉、向日葵、亞麻、月見草、油 橄攬、水稻、篇麻、芝麻、小麥屬、玉米屬、胡桃和扁桃。
[0291] 實施方式37.根據實施方式36所述的方法，其中，所述植物是亞麻莽。
[0292] 實施方式38.根據實施方式35-37中任一項所述的方法，其中，將光合作用的增強 測量為相對于野生型C〇2同化速率的增加或蒸騰速率的降低。
[0293] 實施方式39.根據實施方式35-38中任一項所述的方法，其中，光合作用增強至少 5%。
[0294] 實施方式40.-種嵌合蛋白，包含擬南芥atTic20轉運膚和與葉綠體被膜異源的膜 蛋白。
[02M]除非上下文另外明確表示，如在本文中所使用的單數形式"一個"、"一種"、和"該" 包括復數指示物。
[0296] 數值范圍包括限定該范圍的數值。貫穿本說明書中給出的每個最大的數字限制旨 在包括每個較低的數字限制，如同該較低的數字限制明確地寫入本文中。貫穿本說明書中 給出的每個最小的數字限制將包括每個較高的數字限制，如同該較高的數字限制明確地寫 入本文中。貫穿本說明書中給出的每個數值范圍將包括每個較窄的數字限制(落在較寬的 數字范圍），如同該較窄的數字限制明確地寫入本文中。與數量相關聯使用的修飾語"約"包 括所述值，并具有上下文所表示的含義(例如，包括與特定數量的測量有關的誤差程度）。
[0297] 本文描述了本發明的優選實施方式，包括發明人已知的實施本發明的最佳模式。 當閱讀前述描述時，那些優選實施方式的變化對本領域普通技術人員可W變得顯而易見。 發明人期望技術人員視情況采用運種變化，并且發明人希望W與本文中具體地描述的不同 地實施本發明。因此，如由適用的法律允許的，本發明包括如在附加于此的權利要求中陳述 的主題的所有變化和等同物。此外，在所有可能的變化中W上描述的要素的任何組合是由 本發明所包括，除非在本文中另有指出或另外與上下文明顯矛盾。
【主權項】
1. 一種轉基因植物，包含異源碳酸氫鹽轉運體，其中，所述轉基因植物具有比不包含所 述異源碳酸氫鹽轉運體的相同物種的植物至少5 %、至少10%、至少15%、至少20 %、至少 25%、至少30%、至少35%或至少40%更高的C02同化速率。2. -種轉基因植物，包含異源碳酸氫鹽轉運體，其中，所述轉基因植物具有比不包含所 述異源碳酸氫鹽轉運體的相同物種的植物至少5 %、至少10%、至少15%、至少20 %、至少 25%、至少30%、至少35%或至少40%更低的降低的蒸騰速率。3. -種轉基因植物，用包含與編碼異源碳酸氫鹽轉運體的多核苷酸可操作地連接的植 物能夠表達的轉錄調節序列的重組DNA構建體來轉化。4. 根據權利要求1-3中任一項所述的轉基因植物，其中，不存在異源的碳酸酐酶。5. 根據權利要求1-4中任一項所述的轉基因植物，其中，所述碳酸氫鹽轉運體局部化于 葉綠體被膜。6. 根據權利要求1-5中任一項所述的轉基因植物，其中，所述碳酸氫鹽轉運體來自藍藻 細囷。7. 根據權利要求6所述的轉基因植物，其中，所述碳酸氫鹽轉運體是BicA多肽或SbtA多 肽。8. 根據權利要求7所述的轉基因植物，其中，所述BicA多肽包含SEQ ID N0:4的氨基酸 序列或與SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。9. 根據權利要求7所述的轉基因植物，其中，所述SbtA多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸 序列或與SEQ ID NO:2 95%同源的氨基酸序列。10. 根據權利要求1-9中任一項所述的轉基因植物，其中，編碼所述碳酸氫鹽轉運體的 多核苷酸進一步包含與碳酸氫鹽轉運體編碼序列可操作地連接的編碼葉綠體被膜靶向肽 的序列。11. 根據權利要求10所述的轉基因植物，其中，所述葉綠體被膜靶向肽的序列包含SEQ ID NO: 10的氨基酸1至110。12. 根據權利要求11所述的轉基因植物，其中，所述碳酸氫鹽轉運體來自藻類。13. 根據權利要求12所述的轉基因植物，其中，所述藻類是衣藻屬物種。14. 根據權利要求13所述的轉基因植物，其中，所述碳酸氫鹽轉運體是CCP1多肽、CCP2 多肽或LCIA多肽。15. 根據權利要求14所述的轉基因植物，其中，所述CCP1多肽包含SEQ ID N0:6的氨基 酸序列或與SEQ ID N0:6 95%同源的氨基酸序列。16. 根據權利要求14所述的轉基因植物，其中，所述LCIA多肽包含SEQ ID N0:8的氨基 酸序列或與SEQ ID N0:8 95%同源的氨基酸序列。17. 根據權利要求1-16中任一項所述的轉基因植物，其是選自由以下所組成的組的油 類作物植物:玻璃苣、蕓苔、歐洲油菜、蕪菁、亞麻薺屬物種、大麻、紅花、椰子、海甘藍、萼距 花屬物種、非洲油棕櫚、美洲油棕櫚、大豆、陸地棉、海島棉、草本棉、向日葵、亞麻、月見草、 油橄欖、水稻、篦麻、芝麻、小麥屬物種、玉米屬、胡桃和扁桃。18. 根據權利要求1-17中任一項所述的轉基因植物，其中，所述植物是亞麻薺。19. 根據權利要求1-18中任一項所述的轉基因植物，包含至少兩種異源碳酸氫鹽轉運 體。20. -種重組體多核苷酸，包含 與植物能夠表達的轉錄調節序列可操作地連接的編碼異源碳酸氫鹽轉運體的核酸序 列，其中，編碼所述碳酸氫鹽轉運體的所述核酸序列可選地進一步可操作地連接至編碼葉 綠體被膜靶向肽的核酸序列。21. 根據權利要求20所述的重組體多核苷酸，其中，所述葉綠體被膜靶向肽是擬南芥 Tic20(atTic20)前體的轉運肽。22. 根據權利要求21所述的重組體多核苷酸，其中，所述核酸序列包含SEQ ID NO:9的 殘基1-330。23. 根據權利要求20-22中任一項所述的重組體多核苷酸，其中，所述碳酸氫鹽轉運體 來自藍藻細菌。24. 根據權利要求20-23中任一項所述的重組體多核苷酸，其中，所述碳酸氫鹽轉運體 是BicA多肽或SbtA多肽。25. 根據權利要求24所述的重組體多核苷酸，其中，所述BicA多肽包含SEQ ID N0:4的 氨基酸序列或與SEQ ID N0:4 95%同源的氨基酸序列。26. 根據權利要求24所述的重組體多核苷酸，其中，所述SbtA多肽包含SEQ ID NO:2的 氨基酸序列或與SEQ ID NO:2 95%同源的氨基酸序列。27. 根據權利要求20所述的重組體多核苷酸，其中，所述碳酸氫鹽轉運體來自藻類。28. 根據權利要求27所述的重組體多核苷酸，其中，所述藻類是衣藻屬物種。29. 根據權利要求20、27或28中任一項所述的重組體多核苷酸，其中，所述碳酸氫鹽轉 運體是CCP1多肽、CCP2多肽或LCIA多肽。30. 根據權利要求29所述的重組體多核苷酸，其中，所述CCP1多肽包含SEQ ID NO:6的 氨基酸序列或與SEQ ID NO:6 95%同源的氨基酸序列。31. 根據權利要求29所述的重組體多核苷酸，其中，所述LCIA多肽包含SEQ ID NO:8的 氨基酸序列或與SEQ ID NO:8 95%同源的氨基酸序列。32. 根據權利要求20-31中任一項所述的重組體多核苷酸，進一步包含編碼選自FLAG、6 XHis、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、HA、cMyc或AcV5的表位標記的核酸。33. -種植物能夠表達的表達載體，包含根據權利要求20-32中任一項所述的重組體多 核苷酸。34. 根據權利要求33所述的植物能夠表達的表達載體，包含pEarleyGate載體。35. -種生產具有增強的光合作用的轉化植物的方法，所述方法包括 用權利要求20-32中任一項所述的重組體多核苷酸或權利要求33-34中任一項所述的 表達載體轉化植物細胞； 由所述植物細胞生長植物直至所述植物產生種子；以及 選擇與不表達所述異源碳酸氫鹽轉運體的相應植物相比光合作用增強的植物的種子。36. 根據權利要求35所述的方法，其中，所述植物是選自由以下所組成的組的油類作物 植物:玻璃苣、蕓苔、歐洲油菜、蕪菁、亞麻薺屬物種、大麻、紅花、椰子、海甘藍、萼距花屬物 種、非洲油棕櫚、美洲油棕櫚、大豆、陸地棉、海島棉、草本棉、向日葵、亞麻、月見草、油橄欖、 水稻、篦麻、芝麻、小麥屬物種、玉米屬、胡桃和扁桃。37. 根據權利要求36所述的方法，其中，所述植物是亞麻薺屬。38. 根據權利要求35-37中任一項所述的方法，其中，將光合作用的增強測量為相對于 野生型，C02同化速率的增加或蒸騰速率的降低。39. 根據權利要求35-38中任一項所述的方法，其中，光合作用增強至少5%。40. -種嵌合蛋白，包含擬南芥atTic20轉運肽和與葉綠體被膜異源的膜蛋白。
【文檔編號】C12N15/29GK105873940SQ201480071736
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年12月24日
【發明人】丹尼·J·施內爾, 邁恩·O·卡納克吉, 比賓·保羅斯, 米歇爾·達科斯塔
【申請人】馬薩諸塞大學