一種用于檢測car-t轉導效率的引物、探針和方法
【專利摘要】本發明提供一種用于檢測CAR?T轉導效率的引物、探針和方法，屬于生物技術領域。本發明提供的檢測CAR?T轉導效率的引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為：GCTGTAGCTGCCGATTTCC，所述下游引物的序列為：TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA。本發明提供的引物和探針用于Real?Time PCR檢測的特異性好，能夠準確檢測CAR?T的轉導效率，提高了檢測效率，為其在免疫細胞治療技術的療效檢測提供有力的支持。
【專利說明】
-種用于檢測CAR-T轉導效率的引物、探針和方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，尤其設及一種用于檢測CAR-T轉導效率的引物、探針和 方法。
【背景技術】
[0002] 嵌合抗原受體 T細胞免疫療法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)，作為腫瘤免疫細胞治療的前言技術，在急性白血病和非霍奇金淋 己瘤的治療上有著顯著的療效。CAR-T的基本原理就是利用病人自身的T細胞，嵌合抗原受 體修飾后，可W特異性地識別腫瘤相關抗原，使效應T細胞的祀向性、殺傷活性和持久性均 較常規應用的免疫細胞高，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環境并打破宿主免疫耐受狀態。
[0003] 作為一種腫瘤疾病的療法，CAR-T在注射到患者體內實現免疫治療之前，需要有效 的質控手段，判斷CAR-T是否達到治療要求，即需要對CAR-T轉導效率進行檢測。現有的檢測 方法包括ReaI-Time PCR法，流式細胞術等。
[0004] 中國專利申請201610079872.0公開了檢測CAR-T細胞的捕獲探針、該細胞含量的 檢測方法;捕獲探針包括能夠結合在CAR-T細胞的配體，W及結合在該配體上的巧光分子， 通過流式細胞術進行CAR-T細胞的檢測。
[0005] Real-Time PCR法由于操作簡便、精確且成本較低，被作為檢測CAR-T轉導效率的 常用方法。
【發明內容】
[0006] 為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種用于檢測CAR-T轉導效率的引物、 探針和方法，引物和探針針對CAR-T基因序列中的保守序列進行設計，結合本發明提供的方 法，可W實現轉導效率的定量檢測，操作方便，準確性好，克服了現有技術對CAR-T檢測特異 性低、準確性低且易產生假陽性的問題。
[0007] 本發明提供一種用于檢測CAR-T轉導效率的引物，包括上游引物和下游引物;上游 引物的序列為：GCTGTAGCTGCCGATTTCC，即SEQ ID N0:1，下游引物的序列為： TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA，即SEQ ID N0:2。
[0008] 相應地，本發明還提供一種與上述引物配合使用的探針，所述探針的序列為： ACTCTCAGTTCACATC，即SEQ ID N0:3。
[0009] 本發明提供的引物和探針針對CAR-T基因序列中的保守序列進行設計，用于Real-Time PCR 檢測的特異性好，能夠準確檢測 CAR-T 的轉導效率，提高了檢測效率，為其在免疫 細胞治療技術的療效檢測提供有力的支持。上游引物和下游引物均無引物二聚體，且上游 引物和下游引物的退火溫度差距較小。
[0010] 優選地，所述探針的5'端標記有巧光報告基團，3'端標記有巧光澤滅基團。
[0011] 更優選地，所述巧光報告基團選自VIC;所述巧光澤滅基團為MGB。
[0012] 此外，本發明還提供一種用于檢測CAR-T轉導效率的方法，包括如下步驟：
[001引 SlDNA模板的制作:無菌環境中，取培養的CAR-T細胞，提取DNA;
[0014] S2系列標準品的制作:使用質粒CART-19scFv作為標準品母液，提取感染前T淋己 細胞DNA，用來稀釋CART-19scFv質粒，制成系列標準品；系列標準品的拷貝數分別為1.590E +08、1.590E+07、1.590E+06、1.590E+05、1.590E+04、1.590E+03、1.590E+02、1.590E+01;
[0015] S3Real-Time PCR檢測：配制反應體系，該反應體系包括權利要求1所述的引物W 及權利要求2至4任一項所述的探針，對DNA模板進行Real-Time PCR擴增反應，收集巧光信 號，繪制標準曲線，得出CAR-T基因拷貝數和CAR-T轉導效率。
[0016] 優選地，所述Real-Time PCR擴增反應的條件為：95°C15min;94°C5s，62°C 10s，72 °C 20s，共 40 個循環;72 °C 300s。
[0017] 優選地，所述步驟SI中的培養天數為10~14天。按現有培養方法，通過10~14天的 培養，得到對數生長期的細胞，即最終的CAR-T產物。
[001引 CART-19scFv質粒的構建方法為:將CAR重組基因全序列合成，通過Asisl/Nsil雙 酶切連入慢病毒質粒載體pLent-EFla中，得到CART-19scFv質粒。CART-19scFv質粒的譜圖 如圖1所示。
[0019] 與現有技術相比，本發明的有益效果包括:本發明提供的引物和探針針對CAR-T基 因序列中的保守序列進行設計，用于Real-Time PCR檢測的特異性好，能夠準確檢測CAR-T 的轉導效率，提高了檢測效率，為其在免疫細胞治療技術的療效檢測提供有力的支持。本發 明提供的Real-Time PCR檢測方法簡單，可W實現轉導效率的定量檢測，操作方便，準確性 好。
【附圖說明】
[0020] 圖 1 CART-19scFv 質粒的譜圖。
[0021] 圖2本發明引物組的擴增曲線。
[0022] 圖3對比引物組的擴增曲線。
[0023] 圖4本發明引物組檢測的標準曲線。
[0024] 圖5本發明實施例二中包含樣品的擴增曲線。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0026] 本發明中設及的材料可通過市售或本領域的常規技術獲得。如:DNA提取試劑盒購 自美國Axygen公司，Super Real Real PreMix購自天根生化科技(北京)有限公司，等。
[0027] 實施例一引物和探針
[0028] 用于檢測CAR-T轉導效率的引物，包括上游引物和下游引物，上游引物的序列為： GCTGTAGCTGCCGATTTCC，即沈Q ID NO: 1;下游引物的序列為：TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA，即 沈Q ID N0:2。
[00巧]與上述引物配合使用的探針，所述探針的序列為:ACTCTCAGTTCACATC，即SEQ ID N0:3。探針的5'端標記有巧光報告基團VIC，3'端標記有巧光澤滅基團MGB。設計的引物交由 通用生物系統(安徽)公司合成，探針交由Life Technology公司合成。
[0030] 本發明同時設計了對比引物組:上游引物的序列為:TGCCGATTTCCAGAAGAAG，即沈Q ID N0:4,下游引物的序列為:GCGCTCCTGCTGAACTTC，即沈Q ID N0:5。
[0031] 實施例二 Real-Time PCR檢測
[0032] 用于檢測CAR-T轉導效率的方法，包括如下步驟：
[0033] Sl DNA模板的制作:無菌環境中，取培養11天的CAR-T細胞，使用DNA提取試劑盒提 取DNA;使用培養后的CAR-T細胞數量為4*10 6個;提取的DNA使用化no化OP儀器進行DNA濃度 和純度分析，測得樣品DNA濃度為69ngAil。
[0034] S2系列標準品的制作:使用質粒CART-19scFv作為標準品母液，質粒CART-19scFv 的濃度為1.47iig/mL，提取感染前淋己細胞DNA，用來稀釋CART-19scFv質粒，制成系列標準 品；系列標準品的拷貝數分別為 1.590E+08、1.590E+07、1.590E+06、1.590E+05、1.590E+04、 1.590E+03、1.590E+02、1.5犯+01;
[0035] S3 Real-Time PCR檢測:配制反應體系如表1所示，擴增反應的條件如表2所示，對 DNA模板進行Real-Time PCR擴增反應，收集巧光信號，使用本發明提供的引物組（SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2)的擴增曲線如圖2所示，使用對比引物組(SEQ ID N0:4和沈Q ID NO: 5)的擴增曲線如圖3所示。通過對比圖2和圖3可知，本發明提供的引物組的擴增曲線效果更 好，引物與探針匹配良好。WCq值為縱坐標，^Starting Quantity的對數為橫坐標，繪制本 發明引物組的檢測標準曲線如圖4所示。
[0036] 表1反應體系
[Qm7l
[C
[C
[0040]本發明提供的Real-Time PCR檢測方法實現了CAR-T轉導效率的定量檢測，檢測的 單位為Copies/lOOng genomic DNA(每IOOng基因組中含的CAR-T基因拷貝數）。根據標準曲 線，對樣品的CAR-T拷貝數進行定量，換算出每IOOng基因組中含的CAR-T基因拷貝數，W此 得出轉導效率。此樣品為由90ng基因組DNA擴增得出，樣品DNA為從4.OX IO6個細胞中得到 的6.90ug基因組DNA取出，計算得樣品（Cq值為26.34)的轉導效率為0.55拷貝數/個細胞，陰 性對照的Cq值為39.80dCAR-T產品轉導效率的判斷標準為含0.2拷貝數/個細胞，作為判斷 CAR-T產品是否達到免疫治療的要求的判斷標準。
[0041] W上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限于運些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的 保護犯i圍。
【主權項】
1. 一種用于檢測CAR-T轉導效率的引物，其特征在于:包括上游引物和下游引物;所述 上游引物的序列為：GCTGTAGCTGCCGATTTCC，SP SEQ ID NO: 1;所述下游引物的序列為： TCGTCCTAGATTGAGCTCGTTA，SPSEQ ID N0:2。2. -種與權利要求1所述的引物配合使用的探針，其特征在于：所述探針的序列為： ACTCTCAGTTCACATCCTC，即SEQ ID N0:3。3. 根據權利要求2所述的探針，其特征在于:所述探針的5'端標記有熒光報告基團，3' 端標記有熒光淬滅基團。4. 根據權利要求3所述的探針，其特征在于:所述熒光報告基團選自VIC;所述熒光淬滅 基團為MGB。5. -種用于檢測CAR-T轉導效率的方法，其特征在于:包括如下步驟： SI DNA模板的制作:無菌環境中，取培養后的CAR-T細胞，提取DNA; S2系列標準品的制作:使用質粒CART-19scFV作為標準品母液，提取感染前T淋巴細胞 DNA，用來稀釋CART-19s cFv質粒，制成系列標準品； S3 Real-Time PCR檢測：配制反應體系，該反應體系包括權利要求1所述的引物以及權 利要求2至4任一項所述的探針，對DNA模板進行Real-Time PCR擴增反應，收集熒光信號，繪 制標準曲線，得出CAR-T基因拷貝數和CAR-T轉導效率。6. 根據權利要求5所述的用于檢測CAR-T轉導效率的方法，其特征在于:所述Real-Time PCR 擴增反應的條件為:95°(：151^11;941€58,62°(：1〇8,721€2〇8，共40個循環 ；721€30〇8。7. 根據權利要求5所述的用于檢測CAR-T轉導效率的方法，其特征在于:所述步驟S1中 的培養天數為10~14天。
【文檔編號】C12N15/11GK105861733SQ201610424108
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】孫秀蓮, 李欣, 徐鴻
【申請人】宜明細胞生物科技有限公司