一種檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態性的方法及引物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態性的方法及引物，該方法通過鯉IGF2b基因外顯子和內含子的全基因組擴增，獲得該基因的DNA全長，并劃分成不同模塊擴增，獲得IGF2b基因不同片段的SNP信息，完成整個基因的基因組掃描。結果顯示：用這種分析方法可用于檢測與經濟性狀相關的鯉IGF2b基因SNP位點，也可用起分析該位點與該基因表達量的關系等后續工作。
【專利說明】
-種檢測繩IGF化基因單核昔酸多態性的方法及引物
技術領域
[0001] 本發明屬于魚類分子設計育種技術領域，尤其設及一種經基因組中獲取候選基因 全基因組的SNP方法。
【背景技術】
[0002] 經是我國養殖面積廣、抗逆性強、產量大的重要淡水經濟魚類。據《中國漁業統計 年鑒》，2011年我國大宗淡水魚產量達1698.50萬噸，其中經魚產量為271.82萬噸。可W看 出，經魚的生產在我國占有舉足輕重的地位。
[0003] 類膜島素生長因子（insulin-like growth factor, IGF)是一種促細胞分裂的多 膚，包括IGFl和IGF2,其結構與膜島素相類似。IGF是生長激素發揮作用的中間信使，即生長 激素首先作用于IGF，再由IGF作用于祀器官，進而發揮其促進生長發育的作用。目前IGF2已 經在金頭觸、羅非魚、斑馬魚、河豚、經、大麻哈魚中是確定表達的。值得提出的是，斑馬魚存 在IGF2a和IGF2b 2種基因。在對經的IGF2基因進行研究發現，Tse等在2002年首先成功克隆 了經的IGF2基因，其在經肝臟、屯、臟、腦等組織中廣泛表達。同樣Su等2012年發現在經體內 同樣存在IGF2a、IGF化巧巾基因，并證實Tse等在2002年發現的為IGF2b基因。但目前為止還 未見到對該基因進行基因組掃描尋找單核巧酸多態性（single nucleotide polymor地ism, SNP)的報道，無法從根本上、整體上檢測該基因 SNP位點與與經生長性狀的 相關性。本研究為了克服運些不足，研究透該基因 SNP位點與經生長形狀的相關性，需要找 到一種可W檢測到與經生長形狀有關的所有該基因的SNP位點的方法。
【發明內容】
[0004] 解決的技術問題:本發明的目的在于為了克服W上現有技術的不足，尋找與生長 性狀關聯的IGF化基因潛在SNPs的檢測手段，提供一種檢測經IGF化基因單核巧酸多態性的 方法及引物。
[0005] 技術方案：
[0006] 一種引物組，該引物組用于擴增經魚IGF2b基因 CDNA序列，該引物組包括W下引 物：IGF2bi"正向引物5 ' -3 ' ： GGGGAAACTAAACCGACATT，IGF2bi"反向引物5 ' -3 ' ： GGCATTCGTATGGACCAGTA;IGF化 22#正向引物5'-3' ：tACTGGTCCATACGAATGCC，IGF化 22#反向 引物5 ' -3 ' ： GGGAAGGAAGAAGGGTTGT; IGF2b33#正向引物5 ' -3 ' ： TTTAACCCTGTCTGCCTTCG， IGF2b33#反向引物5'-3' ：ACTTGGACGTAATCCGTGGC。
[0007] -種引物組，該引物組用于擴增經魚IGF2b基因全序列，該引物組包括W下引物： IGF2b2# 正向引 物5'-3' ：GCGATTCGCGTAATGCA，IGF2b2# 反向引 物5'-3' ： ATCCTCAACCTCGTTCCTCT; IGF化3#正向引物5 ' -3 ' ： TCATCCTCTAGCGTTAAGCA，IGF2b3#反向引物 5 ' -3 ' ： GGCATTCGTATGGACCAGTA; IGF化4#正向引物5 ' -3 ' ： TTAACCCTGTCTGCCTTCG，IGF化4#反 向引物5 ' -3 ' ： TGAGTGTAGCCTGGGAACAT; IGF2bS#正向引物5 ' -3 ' ： AGGGAAAGTAATAGTACCCA， IGF2bS#反向引物5'-3' ：AAGAGTGGATCTGGTGCATA; IGF2bS#正向引物5'-3' ： CTGTCCACGCAACAAAAGT，IGF2bS#反向引物5 ' -3 ' ： GCACAAGTTCAGCAGAAAG; IGF2b9#正向引物 5 ' -3 ' ： CACATCCCTACAGGTCATCC，IGF化9#反向引物5 ' -3 ' ： GTGCTCCACAGAAGAAAGT; IGF化 1腳正 向引物5 ' -3 ' ： TGGAACTGCCATTACCCC，IGF2bi°#反向引物5 ' -3 ' ： ACAGATTCTACTGGATGACC; IGF2bi"正向引物5'-3' ：TGAGTTTTATAGGGTCATCC，IGF2bi"反向引物5'-3' ： TTGGACGTAATCCGTGGC。
[000引一種通過基因組掃描經IGF2b基因單核巧酸多態性的方法，步驟如下：
[0009] (1)對待測經魚樣本IGF化基因 CDNA序列利用權利要求1中所述引物組進行對應段 擴增，得到不同待測經魚的擴增片段；
[0010] (2)對待測經魚樣本IGF2b基因通過權利要求2所述的引物組進行對應段擴增，得 到擴增后的片段；
[0011] (3)將步驟(1)得到的不同待測經魚的擴增片段與步驟(2)得到擴增后的片段分別 進行瓊脂糖凝膠電泳，然后回收、純化、測序，再按照斑馬魚基因組序列排列順序進行拼接， 最后得到擴增后的待測經魚樣本IGF2b基因全基因組序列，同時通過與斑馬魚基因組序列 對比選出具有差異的目標位點；
[0012] (4)將任意兩個不同的待測經魚樣本進行正反交組合，對子代利用權利要求1和2 所述的引物組按照步驟（1)和步驟(2)的擴增條件進行基因組擴增，并按照步驟(3)中的方 式最后參照斑馬魚基因組序列排列方式進行拼接，得到子代IGF2b基因序列；
[0013] (5)將子代IGF2b基因序列與親本原始IGF2b基因進行比對，通過檢測進一步確認 目標序列的變異位點，即得到單核巧酸多態性位點。
[0014] 所述的通過基因組掃描經IGF2b基因單核巧酸多態性的方法，步驟（1)或（2)中擴 增的體系均為 10Xbuffer，25mmol/L的Mg2+，各2mmol/L的dNTPs，10mmol/L的正向引物、 1 Ommo 1 /L的反向引物、模板DNA，I^qDNA聚合酶，dd出0。
[0015] 所述的通過基因組掃描經IGF2b基因單核巧酸多態性的方法，步驟（1)或（2)中擴 增的條件均為94°C預變性3min;94°C變性20s，溫度53~58°C退火20s，72°C延伸30s，33個循 環；72°C 延伸 lOmin。
[0016] 所述的通過基因組掃描經IGF2b基因單核巧酸多態性的方法，步驟（1)中所述引物 組進行對應段擴增過程中，引物IGF2biw的擴增退火溫度為56°C，引物IGF2b 22#的擴增退火 溫度為53°C，引物IGF2b33#的擴增退火溫度為55°C。
[0017] 所述的通過基因組掃描經IGF2b基因單核巧酸多態性的方法，步驟(2)中所述引物 組進行對應段擴增過程中，引物IGF化的擴增退火溫度為56°C，引物IGF2b 3#的擴增退火溫 度為55°C，引物IGF2b4#的擴增退火溫度為58°C，引物IGF2b 5#的擴增退火溫度為55°C，引物 IGF2b8#的擴增退火溫度為56°C，引物IGF2b9#的擴增退火溫度為53°C，引物IGF2bW#的擴增 退火溫度為55°C，引物IGF2bii#的擴增退火溫度為56°C。
[0018] 所述的通過基因組掃描經IGF2b基因單核巧酸多態性的方法，步驟(2)中瓊脂糖凝 膠電泳使用的是8%非變性聚丙締酷胺凝膠。
[0019]有益效果
[0020] 本發明提供的IGF2b基因全基因組SNPs檢測方法，可對該基因整個基因組序列進 行掃描，提供的引物都適合直接測序或是結合酶切展開大樣本分析，也可針對某一選定區 域進行單核巧酸位點檢測，實驗結果顯示運種分析方法可W找出與體重相關的SNP位點，也 可用于分析該位點與該基因表達量的關系等后續工作。
[0021] 本發明提供的檢測方法應用于魚類W分子標記輔助選擇為基礎的新品種選育，也 可用于開展候選基因功能研究的科學實驗，為研究該多態位點與生長性狀的關系W及為分 子輔助選擇育種奠定基礎。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發明實施例1中黃河經和建經正反交后親代與子代IGF2b基因序列比對結 果圖；
[0023] 圖2為本發明實施例1中IGF2b3#引物檢測到的227號多態位點與建經體重的關系 圖。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1
[0025] 從 NCBKwww.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫中查取 IGF2b 基因 cDNA序列（AF402958)， 設計引物(見表1和表2)。
[0026] 表1經IGF2b cDNA擴增所需引物 r〇027l
[0029] 表2經IGF2bDNA擴增所需引物 「nnqn1
[0031] 對待測黃河經和建經各3尾的IGF化基因 cDNA序列通過表1中提供的引物進行外顯 子擴增，然后將W上黃河經和建經的IGF2b基因序列通過表2提供的引物進行擴增，對W上 擴增后的產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，然后進行PCR產物的切膠回收及純化、測序，最后 按照斑馬魚基因組序列排列順序進行拼接，得到黃河經和建經的IGF2b基因全序列。
[0032] W上具體過程為:通過化KaRaDNA和RNA提取試劑盒提取黃河經和建經基因組DNA 模板和總RNA模板，使用TaKaRad的RNA反轉錄試劑盒，經過PCR擴增，其反應體系和條件如 下：
[0033] W上擴增反應體系為10Xbufferl扣L，25mmol/L的Mg化化L，各2mmol/L的dNTPs 化L，1 Ommo 1 /L的上游引物1UL、1 Ommo 1 /L的下游引物化L、模板DNA化L (外顯子使用cDNA做 模板），化qDNA聚合酶1U，其余為dd肥0,總量25化。
[0034] W上PCR反應程序為:94 r預變性3min; 94 r變性20s，溫度53~58 r退火20s，72 r 延伸3〇8,33個循環；72°(：延伸1〇111111。
[0035] W上瓊脂糖凝膠電泳中使用的是8%非變性聚丙締酷胺凝膠。
[0036] W上所有IGF2b基因組掃描包含經待測全基因組DNA為模板，W引物對目標基因組 進行PCR擴增，再進行瓊脂糖凝膠電泳，然后進行PCR產物的切膠回收及純化、測序和拼接， 得到待測黃河經和建經IGF2b基因組全序列。其中黃河經IGF2b基因組全序列如SEQ ID NO. 23所示，其中第896位-2170位，第2322位-4146位，第4328位-5205位為內含子序列，其余 為cDNA。
[0037] 根據擴增到的DNA基因組序列和擴增所需引物，W黃河經和建經的正反交組合為 例（正交就是黃河經雄魚和建經雌魚進行雜交的后代，而反交則是黃河經雌魚和建經雄魚 雜交的后代，各30尾），進行擴增和候選SNP位點的篩選，擴增采取上述表1和表帥不同片段 的引物和PCR反應體系進行PCR擴增，篩選是根據測序的結果進行多重序列比對，找出所關 注序列的變異位點，即篩選出的SNP位點。首先是直接測序法測序，然后進行序列比對，見圖 1，黑色字體是原始序列，黑色背景白色字體分別是黃河經作父本建經作母本的后代和建經 作父本黃河經做母本的后代樣本中IGF2b的測序結果。
[0038] 在篩選到潛在的SNP位點后，分析所在的序列的特點（可采取酶切方法或直接測序 法進行檢測），本發明采用直接測序法檢測多態性位點，表3為檢測到各個位點的位置。
[0039] 表3經IGF2bDNA擴增所需引物及檢測到的SNP位點
E。。>1。~1 [
[0042] 如果檢測多個樣本，可從關屯、的潛在SNP位點，尋找引物進行PCR擴增，然后直接測 序比對，獲得所需要的檢測信息。綜合W上步驟，我們可W得到一種通過基因組掃描經 IGF化基因 SNP的方法，該方法通過經IGF化基因外顯子和內含子的全基因組擴增，獲得該基 因的DNA全長，并劃分成不同模塊擴增，獲得經IGF2b基因不同片段的SNP信息，完成整個基 因的基因組掃描，并通過潛在SNPs位點的統計，根據實際需要選擇對應引物進行該標記位 點的檢測。
[0043] 基于本發明檢測到的位點基礎上，采集建經60尾，對其進行IGF2b3#引物多態位點 檢測，使用上述方法提取DNA，并用對應的反應體系進行PCR擴增，然后進行測序、比對，顯著 性檢測，發現227號位點處存在A至化的突變，發現雜合基因型AC體重比純合基因型AA大，見 圖2。
【主權項】
1. 一種引物組，該引物組用于擴增鯉魚IGF2b基因 cDNA序列，其特征在于，該引物組包 括以下引物： IGF2b11#正向弓丨物5'-3' ：GGGGAAACTAAACCGACATT，IGF2b11#反向弓| 物5'-3' ： GGCATTCGTATGGACCAGTA;IGF2b 22#正向引物5'-3' ：TACTGGTCCATACGAATGCC，IGF2b 22#反向引 物5'-3' ：GGGAAGGAAGAAGGGTTGT; IGF2b33#E向引物5'-3' ：TTTAACCCTGTCTGCCTTCG，IGF2b33# 反向引物5'_3' ：ACTTGGACGTAATCCGTGGC。2. -種引物組，該引物組用于擴增鯉魚IGF2b基因全序列，其特征在于，該引物組包括 以下引物： IGF2b2#正向弓| 物5'-3' ：GCGATTCGCGTAATGCA，IGF2b2#反向弓| 物5'-3' ： ATCCTCAACCTCGTTCCTCT; IGF2b3#E 向引物5'-3' ：TCATCCTCTAGCGTTAAGCA，IGF2b3#i向引物 5' -3' ： GGCATTCGTATGGACCAGTA; IGF2b4#E向引物5' -3' ： TTAACCCTGTCTGCCTTCG，16卩21/#反向 引物5'-3' ：TGAGTGTAGCCTGGGAACAT;IGF2b5#E 向引物5'-3' ：AGGGAAAGTAATAGTACCCA，IGF2b5# 反向引物5'_3' ：AAGAGTGGATCTGGTGCATA; IGF2b8#E向引物5'-3' ：CTGTCCACGCAACAAAAGT， IGF2b8# 反向弓| 物5'-3' ：GCACAAGTTCAGCAGAAAG; IGF2b9# 正向弓| 物5'-3' ： CACATCCCTACAGGTCATCC，IGF2b9#i向引物5'-3' ：GTGCTCCACAGAAGAAAGT; IGF2b1()#E向引物 5'-3' ： TGGAACTGCCATTACCCC，IGF2b10#i 向引物5'-3' ： ACAGATTCTACTGGATGACC; IGF2b11#正向 引物5'_3' ：Τ6Α6ΤΤΤΤΑΤΑ666??ΑΤ(Χ，Ι6Ρ21311#Η向引物5'_3' ：TTGGACGTAATCCGTGGC〇3. -種檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于，步驟如下： (1) 對待測鯉魚樣本IGF2b基因 cDNA序列利用權利要求1中所述引物組進行對應段擴 增，得到不同待測鯉魚的擴增片段； (2) 對待測鯉魚樣本IGF2b基因通過權利要求2所述的引物組進行對應段擴增，得到擴 增后的片段； (3) 將步驟（1)得到的不同待測鯉魚的擴增片段與步驟(2)得到擴增后的片段分別進行 瓊脂糖凝膠電泳，然后回收、純化、測序，再按照斑馬魚基因組序列排列順序進行拼接，最后 得到擴增后的待測鯉魚樣本IGF2b基因全基因組序列，同時通過與斑馬魚基因組序列對比 選出具有差異的目標位點； (4) 將任意兩個不同的待測鯉魚樣本進行正反交組合，對子代利用權利要求1和2所述 的引物組按照步驟（1)和步驟(2)的擴增條件進行基因組擴增，并按照步驟(3)中的方式最 后參照斑馬魚基因組序列排列方式進行拼接，得到子代IGF2b基因序列； (5) 將子代IGF2b基因序列與親本原始IGF2b基因進行比對，通過檢測進一步確認目標 序列的變異位點，即得到單核苷酸多態性位點。4. 根據權利要求3所述的檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于，步驟 (1)或（2)中擴增的體系均為10父13肚€6廣25111111〇1/1的]\% 2+，各2111111〇1/1的(1犯1^，10 111111〇1/1的 正向引物、10 mm〇l/L的反向引物、模板DNA，TaqDNA聚合酶，dd H20。5. 根據權利要求3所述的檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于，步驟 (1)或(2)中擴增的條件均為94°C預變性3 min;94°C變性20s，溫度53~58°C退火20s，72°C延 伸30s，33個循環；72°C延伸lOmin。6. 根據權利要求5所述的檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于，步驟 (1)中所述引物組進行對應段擴增過程中，引物IGF2b 11#的擴增退火溫度為56°C，引物IGF2b 22#的擴增退火溫度為53°C，引物16?21333#的擴增退火溫度為55°C。7. 根據權利要求5所述的檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于，步驟 (2)中所述引物組進行對應段擴增過程中，引物IGF2b 2#的擴增退火溫度為56°C，引物 16卩2133#的擴增退火溫度為55°C，引物IGF2b1^/·增退火溫度為58°C，引物IGF2b 5^擴增退 火溫度為55°C，引物IGF2b8#的擴增退火溫度為56°C，引物IGF2b 9#的擴增退火溫度為53°C， 弓丨物IGF2b1Q^r增退火溫度為55°C，引物IGF2b n^r增退火溫度為56°C。8. 根據權利要求3所述的檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態性的方法，其特征在于，步驟 (2)中瓊脂糖凝膠電泳使用的是8%非變性聚丙烯酰胺凝膠。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861732SQ201610421692
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】蘇勝彥, 董在杰
【申請人】中國水產科學研究院淡水漁業研究中心