一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法
【專利摘要】一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，屬于生物醫藥技術領域。其包括以下步驟：提取檢測對象的基因組DNA；對提取的基因組DNA進行定量，并取3μg進行如下步驟建庫；將基因組DNA進行片段化；將片段化的基因組DNA進行末端修復和3’末端添加堿基A；將3’末端添加堿基A的產物連接擴增接頭，以便進行有效連接產物的富集；將連接產物進行PCR擴增，富集有效產物；使用探針對富集的模板中的目標區域進行捕獲；將捕獲的目標片段分離；加上完整接頭獲得捕獲文庫；對文庫進行定量操作；上機測序；數據分析得到致病位點相關信息。本發明能夠同時對一個樣本的多個神經肌肉病相關突變進行分析。
【專利說明】
-種針對神經肌肉病的高通量檢測方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，具體設及一種針對神經肌肉病的高通量檢測方 法。
【背景技術】
[0002] 遺傳性神經肌肉病化ereditary neuromuscular disease)是W運動功能障礙為 主要臨床特征的一組遺傳性疾病，主要包括遺傳性肌病、周圍神經病、運動神經病和神經肌 肉接頭病等，每類疾病根據臨床特點、遺傳方式W及基因突變位點的不同又分為若干個亞 類。各種亞型之間臨床表現存在很大重疊，通過肌肉活檢、免疫組化、免疫巧光染色等檢查 可W幫助確定部分亞型，但仍有一大部分無法確定具體類型。
[0003] 遺傳性神經肌肉病的致病基因不僅數目眾多，且多數基因龐大，外顯子多。W往的 分子學診斷依賴Sanger測序，而常規的一代測序中每個基因需要多次PCR，DNA用量大，花費 高且實驗周期長，往往需要逐一檢測多個候選基因，在成本與耗時方面不能滿足大規模測 序的需求。而祀向捕獲二代測序技術對于遺傳性肌病的分子診斷具有明顯優勢，彌補了一 代測序的缺陷，可實現同時篩查多個樣本及同一類疾病的多個致病基因，為遺傳性肌病的 診斷開辟了新的領域。
【發明內容】
[0004] 針對神經肌肉病致病突變檢測的技術現狀，本發明提出一種針對神經肌肉病的高 通量檢測方法，該方法能夠在一輪測序中檢測多個神經肌肉病相關致病突變位點突變狀 況。該方法具有靈敏度高、針對性強、覆蓋全面、通量大、準確性高等優點。
[0005] 所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于包括W下步驟： 1) 提取檢測對象的基因組DNA; 2) 對提取的基因組DNA進行定量，并取化g進行如下步驟建庫； 3) 將基因組DNA進行片段化； 4) 將片段化的基因組DNA進行末端修復和3'末端添加堿基A; 5) 將3'末端添加堿基A的產物連接擴增接頭，W便進行有效連接產物的富集； 6) 將連接產物進行PCR擴增，富集有效產物； 7) 使用探針對富集的模板中的目標區域進行捕獲； 8) 將捕獲的目標片段分離； 9) 加上完整接頭獲得捕獲文庫； 10) 對文庫進行定量操作； 11) 上機測序； 12) 數據分析得到致病位點相關信息。
[0006] 所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步驟1)中基因 組DNA來源于人類。
[0007] 所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步驟I)中提取 方法包括純化柱純化、磁珠純化或酪氯仿提取。
[0008] 所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步驟2)中定量 方法包括基于巧光定量原理的定量裝置定量、Q-PCR定量和電泳。
[0009] 所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步驟3 )中DNA 片段化方法包括超聲破碎、轉座酶酶切和限制性內切酶酶切。
[0010] 所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步驟7)中探針 為針對神經肌肉病相關基因、相關突變點設計得到。
[0011] 所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步驟7)中探針 包括化 CNl、SCMA、CACNAl S、KCNJ2、TI Al、G肥、MYH7、肥B、化NC、SEPNl、P0MT2、VCP、DMD、 MYOT、LMNA、CAV3、CAPN3、DYSF、SGCG、SGCA、SGCB、SGCD、TCAP、TRIM3 2、POMT1、AN05、FKTN、 BAG3、AGL、DAG1、PLEC、EMD 的至少一種。
[0012] 所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步驟7)中捕獲 方法包括液相探針捕獲、固相忍片雜交捕獲和PCR富集。
[0013] 所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步驟10 )中定 量方法包括基于巧光定量原理的定量裝置定量、Q-PCR定量和電泳。
[0014] 所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步驟11)中上 機測序通過二代測序平臺進行。
[0015] 所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步驟12)通過 對所得測序數據與人類基因組的參考序列進性對比，最終對所測基因的每個突變位點情況 進行分析，得到致病突變相關信息。
[0016] 所述的利用所述的方法檢測神經肌肉病相關致病突變位點基因的試劑盒。
[0017]所述的一種檢測神經肌肉病相關致病突變位點的系統，包括： 核酸抽提裝置，所述核酸抽提裝置適用于從檢測對象中分離基因組DNA; 文庫制備裝置，所述文庫制備裝置適用于W基因組DNA為樣品進行神經肌肉病相關基 因的捕獲文庫的制備； 測序裝置，所述測序裝置適用于對所述擴增產物進行測序，W便得到測序結果； 分析裝置，所述分析裝置適用于基于所述測序結果，確定神經肌肉病治病突變情況。
[0018] 所述的系統，其特征在于所述分析裝置進一步包括比對單元，所述比對單元中存 儲有參考序列，用于將所述測序結果與參照序列進行比對，W便確定所述核酸樣本是否存 在突變。
[0019] 本發明采用上述技術方案，W現有技術相比，具有如下技術效果:本發明針對神經 肌肉病相關突變檢測，提供了一種針對神經肌肉病多個相關位點的高通量檢測方法，該方 法能夠同時對一個樣本的多個神經肌肉病相關突變進行分析。
【附圖說明】
[0020] 圖1是根據本發明一個實施例的檢測神經肌肉病相關突變位點的方法流程示意 圖； 圖2是根據本發明一個實施例的檢測神經肌肉病相關突變位點的系統的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0021] 如圖1和2,本發明提供了一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，包括W下步驟： 1) 提取檢測對象的基因組DNA; 2) 對提取的基因組DNA進行定量，并取化g進行如下步驟建庫； 3) 將基因組DNA進行片段化； 4) 將片段化的基因組DNA進行末端修復和3'末端添加堿基A; 5) 將3'末端添加堿基A的產物連接擴增接頭，W便進行有效連接產物的富集； 6) 將連接產物進行PCR擴增，富集有效產物； 7) 使用探針對富集的模板中的目標區域進行捕獲； 8) 將捕獲的目標片段分離； 9) 加上完整接頭獲得捕獲文庫； 10) 對文庫進行定量操作； 11) 上機測序； 12) 數據分析得到致病位點相關信息。
[0022] 本發明提供了一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，主要技術流程:提取基因 組DNA、文庫制備、文庫質檢定量、上機測序及數據分析。具體如下： 根據本發明的一個實施例，目標基因捕獲的方法不受限制。可W使用PCR富集的方法捕 獲目標基因。根據本發明的一個實施，可W使用生物素標記的液相探針與待測樣品中的目 標區域進行雜交，之后使用鏈霉親和素標記的磁珠將雜交產物分離出來，最后通過PCR富集 目標區域同時在目標區域兩側連接完整的接頭，形成文庫。由此，可W將目標基因序列從基 因組中捕獲并富集。
[0023] 根據本發明的一個實施例，基因組DNA樣本的來源并不受特別限制。根據本發明的 一些具體實施例，基因組DNA樣本從是受檢人的血漿中分離。根據本發明的進一步的實施 例，優選基因組DNA樣本是從神經肌肉型患者血漿中分離的。由此，可W有效地對神經肌肉 病患者的基因組DNA樣本進行檢測。
[0024] 根據本發明的一個實施例，探針是針對神經肌肉病32個基因的相關位點進行設 計。
[0025] 根據本發明的一個實施例，使用純化柱純化基因組DNA，之后進行凝膠回收電泳， 確認DNA質量。
[0026] 根據本發明的一個實施例，基因組DNA純化定量，之后取化g進行DNA片段化，其中 使用的片段化方法包括但不限于超聲破碎、轉座酶酶切、限制性內切酶酶切，優先選用超聲 破碎。
[0027] 根據本發明的一個實施例，將片段化DNA進行末端修復及3'末端添加堿基A。
[002引根據本發明的一個實施例，將3'末端添加堿基A的產物連接擴增接頭。
[0029] 根據本發明的一個實施例，將連接產物進行PCR擴增。
[0030] 根據本發明的一個實施例，將生物素標記探針與富集的樣品中的目標區域進行雜 交。
[0031] 根據本發明的一個實施例，使用鏈霉親和素標記磁珠將雜交有目區域DNA的探針 捕獲下來。
[0032] 根據本發明的一個實施例，使用PCR富集捕獲的目標區域DNA，同時在兩端加上完 整的文庫接頭序列。
[0033] 根據本發明的一個實施例，將文庫定量，使用的巧光定量分析儀定量包括但不限 于Qubit。
[0034] 根據本發明的一個實施例，使用W下引物序列進行第一次PCR擴增： Primer F: 5 '-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 ' Primer R: 5 '-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3 ' 根據本發明的一個實施例，使用Illumina公司通用的建庫PCR引物進行第二次PCR擴 增，包括一條通用的上游引物，和一條帶有標簽(Index)序列的下游引物，使用高效的PCR擴 增酶進行PCR。使用帶有標簽(Index)序列的引物進行PCRW后，可W將不同來源的文庫進行 混合，然后上機測序。
[0035] PCR引物序列如下： TrueSeq Universal Primer: 5 - AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'； TrueSeq Primer-Index X : 5 - CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3^ 其中，下劃線N部分的堿基可W依據Illumina的官方說明使用多種堿基組合，從而產生 更多的、不同標簽的引物，用于不同的文庫的區分。
[0036] 根據本發明的一個實施例，為了有效提高建庫各步驟中的產物純度、減少雜質干 擾、有利于后續步驟的進行，可W對文庫制備中各步驟的產物進行純化回收，純化方法包括 但不限于磁珠純化、純化柱純化、瓊脂糖膠電泳純化、優選磁珠純化。
[0037] 根據本發明的一個實施例，使用Q-PCR的方法對測序文庫進行質檢定量，其中W Ilumina P5、P7作為引物，使用Illumina phix control kit v3作為標準品。
[0038] 根據本發明的一個實施例，通過高通量測序平臺進行測序，優選Illumina Miseq 平臺，并進行數據分析，確定是否存在突變。
[0039] 下面將結合實施例1具體地對本發明的方案進行解釋。
[0040] 實施例1 本實施例是采用Miseq測序技術對受檢人血漿中的基因組DNA進行檢測的，具體操作步 驟如下： 1、按照說明書操作，使用Roche的Hi曲Pure PCR Template Preparation Kit提取受 檢人的血漿中的基因組DNA。
[0041 ] 2、使用超聲破碎儀將基因組DNA破碎成5(K)bp左右的小片段。
[0042] 本實施例中，使用Covaris超聲破碎儀，按照標準操作，將化g DNA片段化。
[0043] 3、使用Agencourt AMPure XP磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.5:1，用SOiil 去核酸酶水洗脫，具體操作化下：
[0044] 5、使用Agencourt AMPure XP磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.5:1，用32iil 洗脫，具體操作如下： 反應條件為:37°C，30min。
[0045] 7、使用Agencourt AMPure XP磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.5:1，用15iil 媒脫.且化蠟化力n下.
iXJ地承'I下:乙W L ? iJjm丄Ho
[0046] 9、使用Agencourt AMPure XP磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.5:1，用32iil 化化目化喊化*n 了.
PCR反應條件為:98°C預變性2min;98°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸Imin,共循環4 次;最終72°C延伸lOmin。由此，獲得PCR產物。
[0047] 備注； Primer F: 5 '-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 ' ； Primer 民： 5 '-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3 '。
[004引 11、使用Agencourt AMPure XP磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.5:1，用30y 1親脫，旦化極化血下：
反應余件為：95 "C，5min變性，之后化持在65 "C，16-24h 13、使用鏈霉親和素標記的磁珠，通過生物素與鏈霉親和素結合，將雜交有樣品目標序 列的探針捕獲到磁珠上。步驟如下：
PCR反應條件為：98°C頓變性2min; 98°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸Imin，巧循環 12次;最終72°C延伸lOmin。由此，獲得PCR產物。
[0049] 備注:PCR引物序列如下： TrueSeq Universal Primer: 5 - AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'； TrueSeq Primer-Index4 : 5 - CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'o
[0050] 15、使用Agencourt AMPure XP磁珠純化樣品，磁珠與樣品體積比為1.8:1，用30y 1去核瞞酪水雜脫.且化極化如下，
16、文庫質檢定量。
[0051] 將上一步得到的文庫如bit? 2.0(Invitrogen)進行定量，使用Q-PCR進行質檢。
[0化2] 17、機測序及數據分析。
[0053] 將樣本使用Illumina Miseq陽-300程序進行雙末端測序，W便獲得測序結果，具 體操作流程詳見Mi seq操作說明書。
[0054] 18、數據分析。
[0化日]Miseq產出的測序結果是化Stq形式的DNA序列，對于illumina Miseq產生的原始 數據進行質控W獲得高質量數據，將reads在人類基因組上進行定位，根據reads定位信息 獲取原始SNP信息，對原始SNP信息進行質控W獲得高質量的SNP位點，利用多個數據庫對產 生的高質量SNP位點進行注釋，將注釋過的SNP位點信息更新到ALMD (Ampl icongene Leiden Muscular Dystro地y Database)中，并使用ALMD對SNP位點進行進一步注釋，配合 臨床表型對可疑位點進行篩選，對于未找到可疑位點的樣本進行CNV(拷貝數據變異)篩選， 整理診斷報告，具體結果如下：
在本文中所使用的術語"SNP"為單核巧酸多態性（英文：Single Nucleotide Polymo巧hi sms,縮寫為SNP)指在基因組上單個核巧酸的變異，包括轉換、顛換、缺失和插 入。
[0056]在本文中所使用的術語"DNA"為脫氧核糖核酸（英文:Deo巧ribonucleicacid，縮 寫為DNA)是一種由脫氧核糖核巧酸組成的雙鏈分子。可組成遺傳指令，引導生物發育與生 命機能運行，其堿基排列順序構成了遺傳信息，所W在遺傳病的診斷中具有重要的作用。
[0057] 在本文中所使用的術語"Q-PCR"為實時巧光定量核酸擴增（英文：Real-time 如anti化tive PCR)。一種利用巧光檢測達到實時檢測PCR狀況的PCR技術。
[0058] 在本文中所使用的術語"高通量測序技術"指的是第二代高通量測序技術及之后 發展的更高通量的測序方法。第二代高通量測序平臺包括但不限于I Ilumina-Solexa (Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、Hiseq X ten等XABI-Solid和Roche-454測序平臺等。隨 著測序技術的不斷發展，本領域技術人員能夠理解的是還可W采用其他方法的測序方法和 裝置進行本檢測。根據本發明的具體示例，可W將根據本發明實施例的核酸標簽用于 I Ilumina-Solexa、ABI-Sol id和Roche-454測序平臺等的至少一種進行測序。
[0059] 高通量測序技術，例如Miseq測序技術具有W下優勢：（1)高靈敏度:高通量測序， 例如Miseq的測序通量大，目前一個實驗流程下來可W產生最多15G堿基數據，高的數據通 量可W再測序序列數確定的情況下，使得每條序列獲得高的測序深度，所W可W檢測到含 量更低的突變，同時因其測序深度高，其測序結果也更為可靠。（2)高通量，低成本:利用根 據本發明實施例的標簽序列，通過一次測序可W檢測上萬份樣本，從而大大降低了成本。
[0060] W上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限 制于W上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和 替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
【主權項】
1. 一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 提取檢測對象的基因組DNA; 2) 對提取的基因組DNA進行定量，并取3yg進行如下步驟建庫； 3) 將基因組DNA進行片段化； 4) 將片段化的基因組DNA進行末端修復和3'末端添加堿基A; 5) 將3 '末端添加堿基A的產物連接擴增接頭，以便進行有效連接產物的富集； 6) 將連接產物進行PCR擴增，富集有效產物； 7) 使用探針對富集的模板中的目標區域進行捕獲； 8) 將捕獲的目標片段分離； 9) 加上完整接頭獲得捕獲文庫； 10) 對文庫進行定量操作； 11) 上機測序； 12 )數據分析得到致病位點相關信息。2. 如權利要求1所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步 驟1)中基因組DNA來源于人類。3. 如權利要求1所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步 驟1)中提取方法包括純化柱純化、磁珠純化或酚氯仿提取。4. 如權利要求1所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步 驟2)中定量方法包括基于熒光定量原理的定量裝置定量、Q-PCR定量和電泳。5. 如權利要求1所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步 驟3 )中DNA片段化方法包括超聲破碎、轉座酶酶切和限制性內切酶酶切。6. 如權利要求1所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步 驟7)中探針為針對神經肌肉病相關基因、相關突變點設計得到。7. 如權利要求1或6所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的 步驟 7)中探針包括 CLCN1、SCN4A、CACNA1S、KCNJ2、TIA1、GNE、MYH7、NEB、FLNC、SEPN1、P0MT2、 VCP、DMD、MYOT、LMNA、CAV3、CAPN3、DYSF、SGCG、SGCA、SGCB、SGCD、TCAP、TR頂32、POMT1、AN05、 FKTN、BAG3、AGL、DAG 1、PLEC、EMD 的至少一種。8. 如權利要求1所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步 驟7)中捕獲方法包括液相探針捕獲、固相芯片雜交捕獲和PCR富集。9. 如權利要求1所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步 驟10)中定量方法包括基于熒光定量原理的定量裝置定量、Q-PCR定量和電泳。10. 如權利要求1所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步 驟11)中上機測序通過二代測序平臺進行。11. 如權利要求1所述的一種針對神經肌肉病的高通量檢測方法，其特征在于所述的步 驟12)通過對所得測序數據與人類基因組的參考序列進性對比，最終對所測基因的每個突 變位點情況進行分析，得到致病突變相關信息。12. -種利用權利1-10任意一項所述的方法檢測神經肌肉病相關致病突變位點基因的 試劑盒。13. -種檢測神經肌肉病相關致病突變位點的系統，包括： 核酸抽提裝置，所述核酸抽提裝置適用于從檢測對象中分離基因組DNA; 文庫制備裝置，所述文庫制備裝置適用于以基因組DNA為樣品進行神經肌肉病相關基 因的捕獲文庫的制備； 測序裝置，所述測序裝置適用于對所述擴增產物進行測序，以便得到測序結果； 分析裝置，所述分析裝置適用于基于所述測序結果，確定神經肌肉病治病突變情況。14.如權利要求13所述的系統，其特征在于所述分析裝置進一步包括比對單元，所述比 對單元中存儲有參考序列，用于將所述測序結果與參照序列進行比對，以便確定所述核酸 樣本是否存在突變。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861700SQ201610325050
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】徐敏杰, 朱雯華, 林潔, 奚劍英, 羅蘇珊, 王曦路
【申請人】湖州昂樸醫學檢驗有限公司, 復旦大學附屬華山醫院