一種cyp3a5*3的檢測引物組合物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發明涉及生物檢測技術領域，尤其是涉及一種CYP3A5*3的檢測引物組合物、試劑盒及方法，采用PNA Clamp LAMP技術，將PNA與LAMP法結合，利用PNA—A封閉rs776746的A位點，PNA?G封閉rs776746的G位點，PNA?I封閉高度相似基因CYP3A4，從而使得對應的LAMP反應無法繼續，以此達到CYP3A5基因分型檢測的目的。該發明具有的優點在于該方法步驟簡單，特異性高，鑒定簡便，成本低廉。
【專利說明】
-種CYP3A5巧的檢測引物組合物、試劑盒及方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物檢測技術領域，尤其是設及一種CYP3A5*3的檢測引物組合物、試 劑盒及方法。
【背景技術】
[0002] 細胞色素 P450(c}rtochromeP450或CYP450)簡稱CYP450,主要存在于肝臟、腸道中 的單加氧酶，是人體內參與內源性物質和外源性化合物代謝過程的一組超家族酶類，尤其 在藥物的體內代謝過程中扮演重要角色。其中，CYP3A5參與他克莫司、咪達挫侖、氨苯諷、可 的松、尼菲地平等多種藥物的代謝。該基因的一個SNP，rs776746(CYP3A5*3,6986A〉G)，會導 致CYP3A5基因的mRNA過短地剪切，形成一個"不完整的"CYP3A5蛋白，從而導致CYP3A5酶蛋 白活性的降低甚至消失。據統計，CYP3A5*3等位基因在中國人群中出現的頻率約為75%，而 攜帶突變型等位基因的患者在臨床藥物治療過程中的表現與野生型攜帶者大相徑庭。例 如，在臨床器官移植術后使用的主要免疫抑制劑類藥物他克莫司（tacrolimus, FK506)，其 代謝過程主要由CYP3A5進行調控。如果CYP3A5基因出現突變，則會導致病人體內他克莫司 的血藥濃度大幅度增高，并出現腎毒性、神經毒性、高血壓和胃腸道素亂等一系列藥物毒副 作用。因此，在臨床中檢巧UCYP3A5基因分型對于臨床治療，特別是器官移植術后病人的臨床 用藥治療實現個體化安全用藥具有重要的指導作用。
[0003] 目前，關于CYP3A5基因分型的檢測多采用巧光定量PCR，基因測序W及基因忍片等 技術手段。使用運些方法進行CYP3A5基因分型檢測均不同程度存在購買儀器成本高，操作 程序復雜，檢測周期較長等問題，不利于提高檢測效率并實現臨床推廣普及。因此，尋找一 種高效且價格容易被患者接受的檢測手段，對于CYP3A5基因分型檢測有著重要的現實意 義。環介導的等溫擴增(LAMP)技術是日本科學家于2000年提出的一種等溫擴增技術，其主 要特點是針對祀基因的6個區域設計4條特異引物，在鏈置換DM聚合酶（Bst DM polymerase)的作用下進行恒溫擴增，僅需15-90分鐘即可產生IO9-IOW數量級的產物。具有 敏感性高、特異性好、操作簡便、成本低廉且結果易于判定的優點。
[0004] LAMP法具有操作簡單，特異性強和成本低廉的優點。目前LAMP法較多用于病原體 和其他一些微生物的檢測中，雖然對于使用LAMP法進行基因突變的檢測也偶見報道，但運 些等位基因特異性引物的LAMP法在實際的應用中很不穩定，因此在市場上還沒有WLAMP法 為基礎的基因突變檢測試劑盒出售。膚核酸(PM)是具有類多膚骨架的DNA類似物，骨架是 由N(2-氨基乙基)-甘氨酸與核酸堿基通過亞甲基幾基連接而成的。PNA可W特異性地和與 之互補的DNA或RNA雜交，形成穩定的復合體。當PNA與祀序列完全互補時，運種復合體的穩 定性要遠遠高于普通的DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA的雙鏈結構。然而，當PNA與祀序列不完 全配對甚至只有一個堿基錯配的時候，運種PNA-DNA復合物就變得非常不穩定，很容易打開 雙鏈。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是現有的CYP3A5基因分型的檢測存在費用高，操作程序 復雜，檢測周期較長等問題，不利于提高檢測效率并實現臨床推廣普及。
[0006] 為解決上述問題，本發明采用PNA Clamp LAMP技術，將PNA與LAMP法結合，利用 PNA-A封閉r S 7 7 6 7 46的A位點，PNA-G封閉r S 7 7 6 7 46的G位點，PM-1封閉高度相似基因 CYP3A4，從而使得對應的LAMP反應無法繼續，W此達到CYP3A5基因分型檢測的目的，該方法 既快速靈敏又成本低廉。
[0007] 本發明的第一個目的在于提供一種CYP3A5*3的檢測引物組合物，包括：
[000引正向外側引物F3:
[0009] 5'-TACCACCCAGCTTAACGA-3'（SEQ ID No.l);
[0010] 反向外側引物B3:
[0011] 5'-CCATACCCCTAGTTGTACG-3'（沈Q ID No.2);
[001 ^ 正向內側引物FIP:
[0013] 5'-TCCAAACAGGGAAGAGATATTGAAAATGCTCTACTGTCATTTCTAACC-3'（沈Q ID No.3);
[0014] 反向內側引物BIP:
[0015] 5'-GCTCCTGTGTGAGACTCTTGCACACACAGCAACCTTAGG-3'（沈Q ID No.4);W及
[0016] 用于封閉rs776746A位點的膚核酸序列PNA-A:
[0017] 5'-CAATATCTCTTCCCTGT-3'（SEQ ID No.5);
[001引用于封閉rs776746G位點的膚核酸序列PNA-G:
[0019] 5'-AGTATCTCTTCCCTGTT-3'（沈Q ID No.6);
[0020] 用于封閉CYP3A4的膚核酸序列PNA-I:
[0021] 5'-TTGTTTGGCCCACATTA-3'（沈Q ID No.7)。
[0022] 本發明的第二個目的在于提供一種CYP3A5*3的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包 括上述的引物和膚核酸序列。
[0023 ] 進一步地，所述檢測試劑盒中還包括dNTP、緩沖液、Bs t聚合酶和超純水。
[0024] 進一步地，所述檢測試劑盒分為兩個反應體系，分別記為反應體系A和反應體系G:
[0025] 反應體系A中包括。3、83少1?、81?、？魁-4、？魁-1、(1^?、緩沖液、831聚合酶和超純 水;反應體系G中包括。3、83^1?、81?、？臟-6、？臟-1、(1饑1\緩沖液、831聚合酶和超純水。
[0026] 進一步地，所述兩個反應體系中還包括用于顯示體系顏色的指示劑。
[0027] 優選地，所述指示劑為徑基糞酪藍。
[0028] 優選地，所述指示劑在反應體系A和反應體系G中的濃度相同，徑基糞酪藍的濃度 為 120iiM。
[0029] 進一步地，所述兩個反應體系中還包括添加劑，所述添加劑在兩反應體系中的濃 度一致。
[0030] 優選地，所述添加劑為甜菜堿，甜菜堿的濃度為0.8M。
[003。 優選地，所述兩個反應體系中緩沖液的濃度相同，其包括：TriS-HCl 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S04 10mM，MgS04 4mM，Tween-20 0.1 % (體積分數）。
[0032]優選地，所述兩個反應體系中：F3的濃度相同，均為0.4iiM;B3的濃度相同，均為0.4 iiM;FIP的濃度相同，均為1.6iiM;BIP的濃度相同，均為1.6iiM，PNA-I的濃度相同，均為0.4iiM; 反應體系A中的PNA-A的濃度和反應體系G中PNA-G的濃度相同，均為0.4iiM。
[0033] 優選地，兩個反應體系中dNTP的濃度相同，均為1.4mM;兩個反應體系中Bst聚合酶 的濃度相同，均為8U。
[0034] 本發明的第S個目的在于提供一種CYP3A5*3的檢測方法，其使用上述的檢測試劑 盒，包括如下步驟：
[0035] (1)取新鮮血液，W邸TA抗凝管保存；
[0036] (2)將上述新鮮血液與超純水混勻，在95 °C下加熱15min W裂解血液中的白細胞使 其釋放出DNA;
[0037] (3)將上述處理后的血水混合物在12000g下離屯、Imin,取上清液作為待檢測的模 板，同時W超純水代替模板做陰性對照；
[003引 （4)采用PNA Clamp LAMP技術，進行LAMP反應，將模板和超純水分別加入到反應體 系A和反應體系G中，于60°C下反應，然后升溫至80°C保持20min進行酶滅活處理，之后自然 降溫，觀察體系顏色變化即可。
[0039] 進一步地，所述反應時間為60~SOmin。
[0040] 在本發明的兩個反應體系中，當反應體系中存在指示劑時，選用徑基糞酪藍作為 指示劑時，反應前體系中的儀離子與dNTP馨合，體系呈現紫羅蘭色；當有陽性反應時，儀離 子與副產物焦憐酸形成沉淀，溶液pH發生改變，顏色逐漸由紫羅蘭色變為天藍色。因此，觀 察反應體系顏色的變化就可W直接判定是否發生擴增反應。
[0041] 本發明具有的優點和積極效果是：
[0042] 本發明采用PNA Clamp LAMP技術，將PNA與LAMP法結合，利用PNA將相應的等位基 因"封閉"，從而使得LAMP反應無法繼續;而當檢測樣本中存在另外一個或者幾個等位基因 時，PNA由于不能有效對其進行"封閉"，使得LAMP反應得W順利進行，W此達到CYP3A5基因 分型檢測的目的。
[0043] 與現有技術相比，PNA clamp LAMP法具有如下有益效果：
[0044] (1)步驟簡單:LAMP法本身對模板的要求并不嚴格，因此可W直接W血液樣本經過 簡單處理后直接擴增，無需提取DNA，而且只需反應體系配置完畢后放置在恒溫水浴鍋中進 行反應擴增即可，不需要預先進行雙鏈DNA的變性及類似于PCR循環反應中的反復變性、退 火、延伸等變溫過程；
[0045] (2)高特異性:典型的LAMP反應需要四條引物，它們共六個不同的模板結合區域， 遠遠高于普通PCR的兩條引物，因此LAMP擴增的特異性很高，可W根據是否擴增就能判斷目 標基因的存在與否；
[0046] (3)擴增反應快速、高效:整個擴增過程不超過1.化，且產率高；
[0047] (4)鑒定簡便:反應完成后通過肉眼觀察顏色變化即可判定結果，結果的觀察可W 脫離凝膠成像的操作要求和儀器限制；
[0048] (5)成本低廉:整個檢測反應僅需要水浴鍋就可開展，無需任何其他檢測設備。
【附圖說明】
[0049] 圖1-圖5分別是檢測樣本M1-M5用PCR測序分型得到的測序圖譜。
【具體實施方式】
[0050]為了更好的理解本發明，下面結合具體實施例和附圖對本發明作進一步說明，但 不限定本發明的保護范圍。
[0化1 ] 一種CYP3A5*3的檢測引物組合物，包括：
[0化2] 正向外側引物F3:
[0053] 5'-TACCACCCAGCTTAACGA-3'（SEQ ID No.l);
[0化4] 反向外側引物B3:
[0055] 5'-CCATACCCCTAGTTGTACG-3'（沈Q ID No.2);
[0化6] 正向內側引物FIP:
[0057] 5 '-TCCAAACAGGGAAGAGATATTGAAAATGCTCTACTGTCATTTCTAACC-3 '（沈Q ID No.3);
[0化引反向內側引物BIP:
[0059] 5'-GCTCCTGTGTGAGACTCTTGCACACACAGCAACCTTAGG-3'（沈Q ID No.4);W及
[0060] 用于封閉rs776746A位點的膚核酸序列PNA-A:
[0061] 5'-CAATATCTCTTCCCTGT-3'（SEQ ID No.5);
[0062] 用于封閉rs776746G位點的膚核酸序列PNA-G:
[0063] 5'-AGTATCTCTTCCCTGTT-3'（沈Q ID No.6);
[0064] 用于封閉CYP3A4的膚核酸序列PNA-I:
[00化]5，-TTGTTTGGCCCACATTA-3,（沈Q ID No.7)。
[0066] 一種CYP3A5*3的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包括上述的引物和膚核酸序列， 還包括dNTP、緩沖液、Bst聚合酶、超純水、徑基糞酪藍和甜菜堿。
[0067] 所述檢測試劑盒分為兩個反應體系，分別為檢測rs776746A位點的反應體系A和檢 ^irs776746G位點的反應體系G。反應體系A中包括。3、83立1口、81口、口魁-4、口酷-1、(1饑1\緩沖 液、Bst聚合酶、超純水、徑基糞酪藍和甜菜堿；反應體系G中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-G、 PNA-I、dNTP、緩沖液、Bs t聚合酶、超純水、徑基糞酪藍和甜菜堿。
[0068] 兩反應體系中各組分的濃度可按正常LAMP反應的濃度設置，作為一種實施方案， 兩個反應體系中：F3的濃度相同，均為0.4iiM;B3的濃度相同，均為0.4iiM;FIP的濃度相同，均 為1.6咖;BIP的濃度相同，均為1.6咖，PNA-1的濃度相同，均為0.4咖;反應體系A中的PNA-A 的濃度和反應體系G中PNA-G的濃度相同，均為0.4測;dNTP的濃度相同，均為1.4mM;Bst聚合 酶的濃度相同，均為洲;緩沖液的濃度相同，均包括:TriS-HCl 20mM，KCl 50mM，（畑4)2S化 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1 % (體積分數）；徑基糞酪藍的濃度相同，均為120測;甜菜堿 的濃度相同，均為0.8M。
[0069] 一種CYP3A5*3的檢測方法，使用上述的檢測試劑盒，具體為：取新鮮血液，W抓TA 抗凝管保存;將上述新鮮血液與超純水混勻，在95°C下加熱ISminW裂解血液中的白細胞使 其釋放出DNA;將上述處理后的血水混合物在12000g下離屯、Imin,取上清液作為檢測的模 板，同時W超純水代替模板做陰性對照;采用PNA Clamp LAMP技術，進行LAMP反應，將模板 和超純水分別加入到反應體系A和反應體系G中，于60°C下反應，然后升溫至80°C保持20min 進行酶滅活處理，之后自然降溫，觀察體系的顏色變化。作為優選，所述反應時間為60~ 80min〇
[0070] 具體實施時，取5人新鮮血液，W抓TA抗凝管保存，標記為Ml、M2, W此類推至M5,另 有一 W超純水代替模板的陰性對照，記為M6。取出化L新鮮血液與45化的超純水混勻，在95 °C下加熱15minW裂解血液中的白細胞使其釋放出DM;立即將上述處理后的血水混合物在 12000g下離屯、Imin,取上清液做待檢測的模板;對模板Mn(n為組別編號，n為1-6)進行LAMP 反應，將模板Mn分別加入到反應體系A和反應體系G中，各反應體系于60 °C下反應60min，然 后升溫至80°C保持20min進行酶滅活處理，之后自然降溫，觀察體系顏色變化。
[0071] 利用檢測試劑盒對模板Mn進行檢測，作為一種實施方式，檢測試劑盒的兩個反應 體系各為2如L，其內的組分和含量如下表1和表2所示：
[0072] 親1巧府化系A的紀A巧含量
[0075] 表2反應體系G的組分和含量
[0073]
[0074]
[0076]
[0077] 反應按照上述的檢測方法進行，反應前，體系顏色均為紫羅蘭色，反應后，各組別 反應體系的顏色及基因型判斷如下表3所示：
[0078] 表3各組別反應體系的顏色及基因型判斷
[0079]
[0080] 為進一步驗證反應的準確性，將上述5個實驗組別的模板M1-M5分別用PCR測序法 進行分型，得到的測序圖譜參見圖1-圖5。
[0081] 對比基因測序圖譜和本發明提供的檢測試劑盒的檢測結果可知，二者的檢測吻合 率100%，驗證了本發明的結果精確。
[0082] W上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例， 不能被認為用于限定本發明的實施范圍。凡依本發明申請范圍所作的均等變化與改進等， 均應仍歸屬于本發明的專利涵蓋范圍之內。
【主權項】
1. 一種CYP3A5*3的檢測引物組合物，包括： 正向外側引物F3: 5'-TACCACCCAGCTTAACGA-3'（SEQ ID No.l); 反向外側引物B3: 5'-CCATACCCCTAGTTGTACG-3'（SEQ ID No.2); 正向內側引物FIP: 5 '-TCCAAACAGGGAAGAGATATTGAAAATGCTCTACTGTCATTTCTAACC-3 '（SEQ ID No.3); 反向內側引物BIP: 5 ' -GCTCCTGTGTGAGACTCTTGCACACACAGCAACCTTAGG-3 '（ SEQ ID No · 4);以及 用于封閉rs776746A位點的肽核酸序列PNA-A: 5'-CAATATCTCTTCCCTGT-3'（SEQ ID No.5); 用于封閉rs776746G位點的肽核酸序列PNA-G: 5'-AGTATCTCTTCCCTGTT-3'（SEQ ID No.6); 用于封閉CYP3A4的肽核酸序列PNA-I: 5'-TTGTTTGGCCCACATTA-3'（SEQ ID No.7)。2. -種CYP3A5*3的檢測試劑盒，其特征在于：包括權利要求1所述的引物和肽核酸序 列。3. 根據權利要求2所述的CYP3A5*3的檢測試劑盒，其特征在于：還包括dNTP、緩沖液、 Bst聚合酶和超純水。4. 根據權利要求3所述的CYP3A5*3的檢測試劑盒，其特征在于:所述檢測試劑盒分為兩 個反應體系，分別記為反應體系A和反應體系G: 反應體系A中包括?3、83、？1?、81?、？嫩4、？嫩-1、(1犯1\緩沖液、88七聚合酶和超純水； 反應體系G中包括?3、83、？1?、81?、？嫩-6、？嫩-1、(1犯1\緩沖液、88七聚合酶和超純水。5. 根據權利要求4所述的CYP3A5*3的檢測試劑盒，其特征在于:所述兩個反應體系中還 包括用于顯示體系顏色的指示劑。6. 根據權利要求5所述的CYP3A5*3的檢測試劑盒，其特征在于:所述指示劑為羥基萘酚 藍。7. 根據權利要求6所述的CYP3A5*3的檢測試劑盒，其特征在于:所述指示劑在反應體系 A和反應體系G中的濃度相同，羥基萘酚藍的濃度為120μΜ。8. 根據權利要求4所述的CYP3A5*3的檢測試劑盒，其特征在于:所述兩個反應體系中還 包括添加劑，所述添加劑在兩反應體系中的濃度一致。9. 根據權利要求8所述的CYP3A5*3的檢測試劑盒，其特征在于:所述添加劑為甜菜堿， 甜菜堿的濃度為0.8M。10. 根據權利要求4-9中任一項所述的CYP3A5*3的檢測試劑盒，其特征在于:所述兩個 反應體系中緩沖液的濃度相同，其包括:Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S〇4 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1% (體積分數）。11. 根據權利要求4-9中任一項所述的CYP3A5*3的檢測試劑盒，其特征在于:所述兩個 反應體系中：F3的濃度相同，均為0.4μΜ; B3的濃度相同，均為0.4μΜ; FIP的濃度相同，均為 1.6μΜ;ΒΙΡ的濃度相同，均為1.6μΜ，ΡΝΑ-Ι的濃度相同，均為0.4μΜ;反應體系Α中的ΡΝΑ-Α的 濃度和反應體系G中PNA-G的濃度相同，均為0.4μΜ。12. 根據權利要求4-9中任一項所述的CYP3A5*3的檢測試劑盒，其特征在于:兩個反應 體系中dNTP的濃度相同，均為1.4mM;兩個反應體系中Bst聚合酶的濃度相同，均為8U。13. -種CYP3A5*3的檢測方法，使用權利要求3-12任一所述的檢測試劑盒，其特征在 于:包括如下步驟： (1) 取新鮮血液，以Η)ΤΑ抗凝管保存； (2) 將上述新鮮血液與超純水混勻，加熱使其釋放出DNA; (3) 將上述處理后的血水混合物在離心取上清液作為待檢測的模板，同時以超純水代 替模板做陰性對照； (4) 采用PNA Clamp LAMP技術，進行LAMP反應，將模板和超純水分別加入到反應體系A 和反應體系G中，于60°C下反應，然后升溫至80°C保持20min進行酶滅活處理，之后自然降 溫，觀察體系顏色變化即可。14. 根據權利要求13所述的CYP3A5*3的檢測方法，其特征在于：所述反應時間為60~ 80min〇
【文檔編號】C12N15/11GK105861689SQ201610298757
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月6日
【發明人】汪大為, 張井存
【申請人】北京晉祺生物科技有限公司