用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人cyp2c19基因分型參比品及其制備方法
【專利摘要】本發明是一種用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品及其制備方法，參比品為人CYP2C19（CYP2C19*2和CYP2C19*3）重組質粒，人CYP2C19（CYP2C19*2和CYP2C19*3）重組質粒包括野生型和突變型。本發明極大地方便了結果的判定，保證了判定的準確性，可將以上參比質粒制備成試劑盒，將為基因分型提供便利，有助于同型輸注的開展，并為評估基因分型方法的準確性、特異性和靈敏度提供重要的參考依據。
【專利說明】
用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品及其制備方法
[0001 ] 技術領域:
本發明涉及幽門螺桿菌檢測技術，特別涉及一種人類幽門螺旋桿菌抗原基因分型參比品及其制備方法。
[0002]【背景技術】:
全球半數以上人口感染幽門螺桿菌(Helicobacter pylori ,H.pylori),中國是一個
H.pylori感染率較高的國家，達56.22 %，某些地區高達77.22 %。幾乎所有感染幽門螺桿菌的人均患有慢性胃炎，只有少數會發展成為消化性潰瘍，而其中有約I % - 2 %發展成為胃癌。幽門螺桿菌感染與臨床消化道疾病發生發展密切相關，如慢性胃炎，消化性潰瘍，十二指腸潰瘍，胃癌和淋巴細胞增生等。1994年WHO將HP列為I類致癌因子。研究表明，幽門螺桿菌感染為胃癌發生的病因，對幽門螺桿菌的根除可明顯降低人群胃癌的發生風險。因此，HP感染的根除治療一直是HP研究領域中的重點和熱點，具有重要的臨床意義。
[0003]HP耐藥是全球性問題，是HP根治率下降的主要原因。以質子栗抑制劑(PPI)結合阿莫西林和克拉霉素(或甲硝唑)的三聯療法，是國內外公認的一線抗HP感染治療組合。喹諾酮類藥物是HP根治的二線藥物。抗HP治療的療效主要受到以下兩個因素影響:一是抗生素耐藥，由于近年來抗生素的濫用，克拉霉素、甲硝唑、喹諾酮耐藥不斷上升，使得三聯療法或喹諾酮的有效率下降；另外一個重要因素是PPI的使用。PPI代謝與人細胞色素P450(CYP450)同工酶CYP2C 19密切相關，CYP2C19的基因多態性(強代謝、中代謝和弱代謝)決定了PPI在人體內的代謝速度。因此，在使用三聯療法之前，提供準確的抗生素耐藥信息和CYP2C19的類型，針對性地選擇藥物進行個體化用藥，能夠提高幽門螺桿菌根除率，同時減少抗生素濫用帶來的不良反應和資源浪費。
[0004]因此，為促進對幽門螺桿菌個體化治療的研究，提供一種用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，用于評估人類幽門螺旋桿菌抗原基因分型方法的準確性、特異性和靈敏度，具有十分重要的意義。
[0005]
【發明內容】
:
本發明的目的就是針對現有技術之不足，而提供一種用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品及其制備方法。
[0006]本發明的技術方案如下:
用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人C Y P 2 C19基因分型參比品，參比品為人C Y P 2 C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質粒，所述人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質粒包括野生型和突變型。
[0007]作為優選，人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)重組質粒中CYP2C19*2的第5個外顯子第681位堿基是G，CYP2C19*3的第4個外顯子第636位堿基是G。
[0008]作為優選，野生型的制備方法為:
A、擴增步驟:提取正常人基因組DNA模板，先對CYP2C19基因進行PCR擴增得到中間產物； B、混合步驟:所述中間產物通過T4 DNA連接酶連接至PGEM ? T4_vector，連接中間產物轉化感受態大腸桿菌JM109，在37 °C恒溫過夜培養后培養12-14小時挑選單克隆，再搖菌15小時，提取質粒后測序，保存測序正確的人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)野生型重組質粒。
[0009]作為優選，擴增步驟中，擴增引物包括正向引物和反向引物:正向引物為ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG;反向引物為TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG；擴增條件為:94°C，預變性 5min;94°C 變性 30s，60°C 退火 30s，72°C 延伸 208，30個循環；72°(:延伸21^11。
[0010]作為優選，混合步驟中搖菌轉速為200rpm。
[0011]作為優選，突變型的制備方法為:
在特定位點采用定點突變方法弓I入突變堿基，首先以引進的突變堿基在引物序列中為目標，結合突變位點的具體情況設計上下游突變引物FM、RM;
第一輪PCR反應，用突變引物RM(CYP2C19 *2_RM: GGGTTCTCGGGAAATAATCAAT;
CYP2C19 *3-RM: CTGGATTCAGGGGGTGCTTAC)及正向側引物F(ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG)擴增含突變位點的DNA片段；
反應體系:
模板DNA 10ng
10 X擴增緩沖液1ul
20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物FM (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物R (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反應條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個循環94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ；
第二輪PCR反應，用突變引物FM(CYP2C19 *2_FM: ATTATTTCCCAGGAACCCATAAC；CYP2C19 *3-FM: GCACCCCCTGMTCCAGATATG)與反向側弓丨物R (TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG)同樣以野生型質粒為模板擴增含突變位點及其下游的DNA片段。
[0012]反應體系:
模板DNA 10ng
10 X擴增緩沖液1ul
20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物RM (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反應條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個循環94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ； 第三輪PCR反應，PCRl和PCR2產物經瓊脂糖凝膠電泳分離、試劑盒回收純化后等比例混合。取上述混合物為模板，用引物F和R擴增全長片段。
[0013]反應體系:
PCRl擴增產物50ng PCR2擴增產物50ng 10 X擴增緩沖液1ul
20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul
5umol/L 引物R(30pmols)6.0ulTaq DNA聚合酶I?2 U加水至10ul反應條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個循環94 °C, Imin ； 72 °C, 1min
純化后的定點突變的目標片段被T4 DNA連接酶連接至PGEM ? T4-vector，同樣將產物轉化感受態大腸桿菌JM109，在37°C恒溫過夜培養后挑選單克隆，再搖菌15小時，提取質粒后測序，保存測序正確的突變型重組質粒。
[0014]作為優選，突變堿基和特定點位具體為CYP2C19*2的第5個外顯子第681位堿基G突變為A，CYP2C19*3的第4個外顯子第636位堿基G突變為A。
[0015]本發明的有益效果在于:
本發明利用分子生物學技術，包括PCR擴增，載體連接，轉化克隆，以及定點突變技術建立了人類幽門螺旋桿菌抗原基因分型參比質粒，該參比質粒含有正確的基因序列，并在不同的基因分型方法中起到了預期的效果，并且也可以作為陽性對照，極大地方便了結果的判定，保證了判定的準確性，可將以上參比質粒制備成試劑盒，將為基因分型提供便利，有助于同型輸注的開展，并為評估基因分型方法的準確性、特異性和靈敏度提供重要的參考依據。
[0016]【具體實施方式】:
實施例1:用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，參比品為人CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質粒，所述人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質粒包括野生型和突變型。
[0017]人CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質粒中 CYP2C19*2 的第 5 個外顯子第 681位堿基是G，CYP2C19*3的第4個外顯子第636位堿基是G。
[0018]野生型的制備方法為:
A、擴增步驟:提取正常人基因組DNA模板，先對CYP2C19基因進行PCR擴增得到中間產物；
B、混合步驟:所述中間產物通過T4DNA連接酶連接至PGEM ? T4_vector，連接中間產物轉化感受態大腸桿菌JM109，在37 °C恒溫過夜培養后培養12-14小時挑選單克隆，再搖菌15小時，提取質粒后測序，保存測序正確的人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)野生型重組質粒。
[0019]擴增步驟中，擴增弓I物鈕証向弓I物和反向弓I物:正向弓I物為ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG ；反向引物為TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG ；擴增條件為:94°C，預變性5min ； 94°C 變性30s，60°C退火30s，72°C延伸20s，30個循環；72°C延伸2min。
[0020]混合步驟中搖菌轉速為200 rpm。
[0021]突變型的制備方法為:
在特定位點采用定點突變方法弓I入突變堿基，首先以引進的突變堿基在引物序列中為目標，結合突變位點的具體情況設計上下游突變引物FM、RM;
第一輪PCR反應，用突變引物RM(CYP2C19 *2_RM: GGGTTCTCGGGAAATAATCAAT;
CYP2C19 *3-RM: CTGGATTCAGGGGGTGCTTAC)及正向側引物F(ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG)擴增含突變位點的DNA片段；
反應體系:
模板DNA 10ng
10 X擴增緩沖液1ul
20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物FM (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物R (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反應條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個循環94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ；
第二輪PCR反應，用突變引物FM(CYP2C19 *2_FM: ATTATTTCCCAGGAACCCATAAC；CYP2C19 *3-FM: GCACCCCCTGMTCCAGATATG)與反向側弓丨物R (TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG)同樣以野生型質粒為模板擴增含突變位點及其下游的DNA片段。
[0022]反應體系:
模板DNA 10ng
10 X擴增緩沖液1ul
20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul
5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul
5 umol/L 引物RM (30pmols)6.0ul
Pfu DNA聚合酶I?2 U
加水至10ul
反應條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個循環94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ；
第三輪PCR反應，PCRl和PCR2產物經瓊脂糖凝膠電泳分離、試劑盒回收純化后等比例混合。取上述混合物為模板，用引物F和R擴增全長片段。
[0023]反應體系:
PCRl擴增產物50ng PCR2擴增產物50ng 10 X擴增緩沖液1ul 20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物R(30pmols)6.0ul Taq DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反應條件:
94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個循環94 °C, Imin ； 72 °C, 1min
純化后的定點突變的目標片段被T4 DNA連接酶連接至PGEM ? T4-vector，同樣將產物轉化感受態大腸桿菌JM109，在37°C恒溫過夜培養后挑選單克隆，再搖菌15小時，提取質粒后測序，保存測序正確的突變型重組質粒。
[0024]突變堿基和特定點位具體為CYP2C19*2的第5個外顯子第681位堿基G突變為A，CYP2C19*3的第4個外顯子第636位堿基G突變為A。
[0025]以上所述僅為本發明的較佳實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都應當屬于本發明保護的范圍。
【主權項】
1.用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述參比品為人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質粒，所述人 CYP2C19(CYP2C19*2 和 CYP2C19*3)重組質粒包括野生型和突變型。2.根據權利要求1所述的用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)重組質粒中CYP2C19*2的第5個外顯子第681位堿基是G，CYP2C19*3的第4個外顯子第636位堿基是G。3.根據權利要求1所述的用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述野生型的制備方法為: A、擴增步驟:提取正常人基因組DNA模板，先對CYP2C19基因進行PCR擴增得到中間產物； B、混合步驟:所述中間產物通過T4DNA連接酶連接至PGEM ? T4_vector，連接中間產物轉化感受態大腸桿菌JM109，在37 °C恒溫過夜培養后培養12-14小時挑選單克隆，再搖菌15小時，提取質粒后測序，保存測序正確的人CYP2C19(CYP2C19*2和CYP2C19*3)野生型重組質粒。4.根據權利要求3所述的用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述擴增步驟中，擴增引物包括正向引物和反向引物:正向引物為ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG;反向引物為TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG；擴增條件為:94°C，預變性 5min;94°C 變性 30s，60°C 退火 30s，72°C 延伸 208，30個循環；72°(:延伸21^11。5.根據權利要求3所述的用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述混合步驟中搖菌轉速為200 rpm。6.根據權利要求1所述的用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:所述突變型的制備方法為: 在特定位點采用定點突變方法引入突變堿基，首先以引進的突變堿基在引物序列中為目標，結合突變位點的具體情況設計上下游突變引物FM、RM; 第一輪PCR反應，用突變引物RM(CYP2C19 *2-RM:GGGTTCTCGGGAAATAATCAAT; CYP2C19 *3-RM: CTGGATTCAGGGGGTGCTTAC)及正向側引物F (ATGGATCCTTTTGTGGTCCTTGTG)擴增含突變位點的DNA片段； 反應體系: 模板DNA 10ng 10 X擴增緩沖液1ul 20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物FM (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物R (30pmols)6.0ul Pfu DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反應條件: 94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個循環 94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ； 第二輪PCR反應，用突變引物FM(CYP2C19 *2-FM:ATTATTTCCCAGGAACCCATAAC ；CYP2C19 *3-FM: GCACCCCCTGMTCCAGATATG)與反向側弓丨物R( TCAGACAGGAATGAAGCACAGCTG)同樣以野生型質粒為模板擴增含突變位點及其下游的DNA片段， 反應體系: 模板DNA 10ng 10 X擴增緩沖液1ul 20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物RM (30pmols)6.0ul Pfu DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反應條件: 94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個循環 94 °C, Imin ； 72 °C, 1min ； 第三輪PCR反應，PCRl和PCR2產物經瓊脂糖凝膠電泳分離、試劑盒回收純化后等比例混合，取上述混合物為模板，用引物F和R擴增全長片段， 反應體系: PCRl擴增產物50ng PCR2擴增產物50ng 10 X擴增緩沖液1ul 20 mmol /I, 4種dNTP混合溶液1.0ul 5 umol/L 引物F (30pmols)6.0ul 5 umol/L 引物R(30pmols)6.0ul Taq DNA聚合酶I?2 U 加水至10ul 反應條件: 94 °C，Imin ；50°C, Imin; 72 °C，2min ；共20個循環 94 °C, Imin ； 72 °C, 1min 純化后的定點突變的目標片段被T4 DNA連接酶連接至PGEM ? T4-vector，同樣將產物轉化感受態大腸桿菌JM109，在37°C恒溫過夜培養后挑選單克隆，再搖菌15小時，提取質粒后測序，保存測序正確的突變型重組質粒。7.根據權利要求5所述的用于幽門螺旋桿菌個體化治療的人CYP2C19基因分型參比品，其特征在于:突變堿基和特定點位具體為CYP2C19*2的第5個外顯子第681位堿基G突變為A，CYP2C19*3的第4個外顯子第636位堿基G突變為A。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861684SQ201610295403
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月6日
【發明人】鐘婧, 黃惠蓮, 戴利成
【申請人】湖州市中心醫院