一種用于檢測cho細胞dna殘留的引物、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于檢測CHO細胞DNA殘留的引物對，采用GenBank登錄號為J00052.1的核苷酸序列設計，同時提供了根據該核苷酸序列涉及的Taqman探針，以及相應的檢測方法，所述方法為實時熒光定量PCR法，根據所獲得的標準曲線，計算得到待檢樣本中CHO細胞DNA的量。本發明的檢測方法可以用于檢測以CHO細胞作為基因工程表達細胞株的生物蛋白，例如抗體、治療性蛋白或疫苗等。本發明的實時熒光PCR檢測CHO細胞DNA的方法和依據所述方法制備的PCR試劑盒，實現了檢測CHO細胞DNA殘留的定量限低至0.1fg/μl，表明本方法具有非常好的靈敏度，且具有較高的特異性。
【專利說明】
-種用于檢測CHO細胞DNA殘留的引物、試劑盒及檢測方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種用于定量檢測CHO細胞煙iinese Hamster Ovary，中國倉鼠卵巢細胞）DNA含量的引物、試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 在現代，一大批生物蛋白如單抗類藥物、重組蛋白類藥物、疫苗等在臨床上得到了 廣泛應用，生產送些生物蛋白的宿主細胞主要是細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞。因而在經 過純化得到的最終蛋白產品中會殘留送些宿主細胞的DNA。DNA殘留量雖然很低，但是蛋白 產品中的殘留DNA會對人體存在潛在的危險性。一般認為宿主細胞DNA中可能包含了某些 未知的DNA片段，一些可能整合了病毒的DNA片段會使人體受到感染，還有一些帶有癌變基 因的DNA片段可能會誘發產生腫瘤。因此，讓蛋白產品中的DNA殘留量降至盡可能的低是 人們共識。
[0003] 目前Cffi)細胞是生物制藥中最廣泛使用的真核表達細胞系。外源基因轉染到CHO 細胞后，整合到染色體DNA上，能得到穩定持久的表達，C冊細胞適合在生物反應器中進行 大規模培養，高表達目標蛋白。并能進行復雜的蛋白翻譯后折疊和修飾，所表達的蛋白的糖 基化修飾與人類天然蛋白的糖基化修飾相似性高。因此，OlO細胞成為表達復雜生物大分 子蛋白的最理想的宿主細胞，已被廣泛用于重組蛋白藥物的表達生產。用Cffi)細胞生產的 各種生物蛋白藥物的給藥劑量不等，劑量相差可W達到幾十倍到上百倍。對于給藥劑量小 的生物蛋白，C冊細胞DNA殘留的要求相對較低；對于給藥劑量大，并且需要頻繁給藥的生 物蛋白藥物，CHO細胞DNA殘留量限制嚴格，越低越好。
[0004] 在很多生物制品質量標準中都對DNA殘留量的進行嚴格的限制。美國FDA(Food and Drug A血inistration)在1997年發布的指導原則中規定，最終產品中宿主細胞DNA 殘留量不得高于l(K)pg/dose ;曾經，對于非腸道給藥的最終產品中宿主細胞DNA殘留量， WHCKWorld化alth化ganization)公布的相關標準是不得高于10化g/dose,但1998年送 一標準修改為不高于lOng/dose ;EU巧uropean化ion) ,2001年公布的相關標準也是最終 產品中宿主細胞DNA殘留量不得高于lOng/dose ;《中國藥典》H部2010年版規定原核表達 的生物制品其DNA殘留量不高于lOng/dose，真核細胞表達的產品的DNA殘留量應不高于 lOOpg/dose。
[0005] 為了保證在各步純化工藝中DNA殘留的清除達到標準，需要靈敏度非常高的DNA 殘留檢測方法。目前2010年版《中國藥典》H部外源DNA殘留量檢測項目上收錄了 DNA雜 交法和英光染色法。DNA雜交法需要的條件相對簡單，但該方法存在時間長，操作繁瑣，穩定 性、敏感性、特異性較差等缺點。英光染色法是利用PicoGreen送種高靈敏度的雙鏈DNA英 光染料對DNA含量進行定量測定。該方法的檢驗靈敏度可達30化g 'mL 1，DNA含量在1. 25~ SOng ?血1范圍內線性良好巧0. 99)。該方法缺點為容易受到RNA、ssDNA、dsDNA的干 擾；對于大劑量的產品，比如單克隆抗體，靈敏度難W達到檢測需求。
[0006] 實時定量PCR是一種快速的高通量的檢測方法，它是基于PCR擴增時，在加入一對 引物的同時加入一個特異性的英光探針；產物的增加可W通過英光信號指示，通過實時監 控PCR體系中的英光信號的變化，對樣本中初始模板進行定量分析。該方法在特異性、靈敏 性、準確性方面具有其獨特的優勢；此外定量PCR不僅能對殘余DNA進行定量，還能對殘余 DNA進行特異性的擴增，對殘余DNA風險的評估更加客觀，因此定量PCR法是殘余DNA測定 未來的發展趨勢。
[0007] 申請號為CN20111006745. 4的中國專利申請公開了用實時英光PCR檢測CHO細胞 中DNA殘留的試劑盒，其中使用的是EvaGreen為英光染料，EvaGreen染料與雙鏈DNA結合 后可W檢測到強的英光信號；在雙鏈DNA最多時，英光信號最高，即出現吸收峰。EvaGreen 染料對于雙鏈DNA的結合并沒有特異性，不能夠識別出不同來源的DNA片段，雖然在假陽性 和抗干擾方面強于原先的SYBR Green英光染料，但是其特異性也無法與化qman探針技術 相媳美。
[0008] 申請號為 CN201110099204. 1、CN201210475980. 1 和 CN201210161343. 7 的中國 專利申請公開了利用化qman探針技術實時英光PCR檢測C冊細胞DNA殘留的方法，其中 CN201210475980. 1利用多重PCR技術來檢測，多重PCR技術操作困難繁瑣，成功率低，數據 處理復雜，受影響因素較多，應用不廣泛。CN201110099204. 1和CN201210161343. 7的C冊 細胞DNA殘留量的定量限分別為3fg/U 1和IOfg/U 1，2種方法分別使用不同的探針序列， 然后得出不同的檢測能力。送也說明選取的目的擴增片段、引物探針序列的設計對于PCR 檢測能力有著重要的影響。
【發明內容】
[0009] 因此，針對上述現有技術的不足，本發明的目的是提供一種簡單、廉價、準確率高、 定量限更低的實時英光PCR技術來定性與定量檢測CHO細胞DNA的方法和試劑盒。所述方 法可用于檢測W C冊細胞作為基因工程表達細胞株的蛋白產品中殘留DNA，從而對生物蛋 白生產進行質量監測。
[0010]
【申請人】發現，定量PCR法的檢測能力除了與英光技術息息相關外，還與所擴增的 目的片段的拷貝數多少相關，本申請根據高度保守的CHO細胞Alu短重復序列片段設計出 特異性的引物探針序列，Alu短重復序列在C冊細胞基因組DNA大量存在，拷貝數很多，能 明顯提高檢測的靈敏度，確保了本申請的方法擁有較低的定量限。
[0011] 定量限是某一分析方法的定量限度，即在合適的準確性和精密度下，能夠定量測 定樣品中被分析物的最低量。
[0012] 本發明采用GenBank登錄號為J00052. 1的核巧酸序列，設計特異引物和化qman 探針，W提取的CHO細胞基因組DNA為模板進行英光定量PCR方法。
[0013] 本發明是通過W下技術方案實現的：
[0014] 一方面，本發明提供了一種用于檢測CHO細胞DNA殘留的引物對，所述引物對為采 用GenBank登錄號為J00052. 1的核巧酸序列設計的特異性引物；
[001引所述用于檢測CHO細胞的DNA殘留的核巧酸引物對為：
[001 引 正向引物序列；5'-CTACCAGAGGTCCTGAGTTCAATT-3'（沈Q ID N0:1);
[0017] 反向引物序列；5'-GGGCACCAGGTCTCATAACG-3'（沈Q ID N0:2);
[0018] 本發明還提供了采用GenBank登錄號為J00052. 1的核巧酸序列設計的化qman探 針；
[0019] 所述的化qman探針核巧酸序列為：
[0020] 化9111311 探針；5'-CCAGCAACCACATGGTGGCTCAC-3'（SEQ ID N0:3)。
[0021] 優選地，所述化qman探針的5'端標記有英光報告基團，3'端標記有渾滅基團；優 選地，所述英光報告基團為FAM ;優選地，所述渾滅基團為TAMRA。
[0022] 另一方面，本發明提供了 一種用于檢測C冊細胞DNA殘留的反應體系，所述反應體 系的擴增反應液為2XQ-PCR反應預混液，內含Taq酶、dNTPs、Mg 2+及PCR緩沖液，均為常見 組分，其含量亦為常規。反應體系一般可設為30yl。所述DNA模板可W來自待測樣本，也 可W來自標準品或陽性內控品。
[0023] 再一方面，本發明提供了一種用于檢測C冊細胞DNA殘留的方法，所述方法為實 時英光定量PCR法，所述實時英光定量PCR的反應程序為；95°C預變性IOmin ;95°C 15s， 60°C Imin，40個循環；根據所獲得的標準曲線，計算得到待檢樣本中CHO細胞DNA的量。
[0024] 所述實時英光定量PCR中，每次檢測均設立標準品，陰性質控品和陽性內控品 (Internal化Sitive Control, IPC)。標準品為C冊細胞基因組DNA，其DNA濃度可為 10-5化g/y 1，如30ng/y 1。使用時，用DNA稀釋液稀釋成6個濃度梯度，分別為3(K)pg/y 1、 30pg/y 1、化g/y 1、0. ：3pg/y 1、0. 0：3pg/y 1、0. 00：3pg/y 1 的標準曲線梯度濃度。陰性對照 品為純水。其中IPC含IPC模板，IPC正向引物、IPC反向引物，MGB(Minor Groove Binder) 探針試劑，其中IPC模板是Progema的PGEM-T Easy Vector。
[0025] 所述IPC試劑中核巧酸引物序列為：
[0026] IPC 正向引物序列；5'-ACTTGGTCTGACAGTTACCAATG-3'（沈Q ID N0:4)
[0027] IPC 反向引物序列；5'-GGAGTCAGGCAACTATGGATG-3'（沈Q ID N0:5)
[002引所述IPC探針的核巧酸序列為：
[0029] IPC 探針；5'-TAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGA-3'（沈Q ID N0:6)
[0030] 所述IPC探針5'端的標記有英光報告基團，所述英光報告基團優選為VIC，也可W 是其他的英光報告基團；3'端標記有渾滅基團，所述渾滅基團優選為MGBNFQ，也可W是其 他的英光渾滅基團。
[0031] 所述DNA稀釋液可為常規。優選由邸TA、化OH和Tris-肥1溶液配制而成，其中 Tris-肥1濃度為5. 0-10.0 mmol/L，邸TA的濃度為0. 5-1. Ommol/L，用化OH溶液調節抑為 6. 0-8. 5。該DNA稀釋液能高效稀釋低濃度的DNA樣品，而且適合于PCR擴增。
[0032] 所有待檢樣品均需通過提取后溶解于DNA稀釋液或純水中。
[003引 實時英光定量？0?反應程序優選為；95^預變性10111111;95^153,60^1111血40個 循環。根據所獲得的標準曲線，計算得到待檢樣本中CHO細胞DNA的量。
[0034] 其中，所述方法的檢測樣本為W OlO細胞作為基因工程表達細胞株的生物蛋白， 優選地為抗體、治療性蛋白或疫苗。
[003引再另一方面，本發明提供了一種用于檢測C冊細胞DNA殘留的試劑盒，所述試劑盒 包括PCR擴增反應液、標準品、陰性質控品、IPC W及DNA稀釋液；
[0036] 其中，所述PCR擴增反應液包括Taq酶、dNTPs、Mg2\ PCR緩沖液、引物對W及 化qman探針；所述引物對為采用GenBank登錄號為J00052. 1的核巧酸序列設計的特異性 引物；優選地，所述引物對為SEQ ID NO: 1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引 物；
[0037] 優選地，所述化qman探針為采用GenBank登錄號為J00052. I的核巧酸序列設計 的化qman探針；優選地，所述化qman探針的序列SEQ ID NO:3所示；進一步優選地，所述 化qman探針的5'端標記有英光報告基團，3'端標記有渾滅基團；優選地，所述英光報告基 團為FAM ;優選地，所述渾滅基團為TAMRA ;
[0038] 優選地，所述標準品為C冊細胞基因組DNA ;更優選地，所述DNA濃度為10-5化g/ y 1，更優選地為30ng/ U 1 ;進一步優選地，在使用時，用DNA稀釋液稀釋成6個濃度梯度， 分別為 300pg/y l、30pg/y l、：3pg/y 1、0. ：3pg/y 1、0. 0：3pg/y 1、0. 00：3pg/y 1 的標準曲線 梯度濃度；
[0039] 優選地，所述陰性質控品為純水；
[0040] 優選地，所述IPC包括IPC模板、IPC正向引物、IPC反向引物、IPC探針試劑；優 選地，所述IPC模板為Progema的PGEM-T Easy Vector ;優選地，所述IPC正向引物的序列 如SEQ ID NO:4所示，所述IPC反向引物的序列如SEQ ID NO: 5所示；優選地，所述IPC探 針的序列如SEQ ID N0:6所示；更優選地，所述IPC探針5'端標記有英光報告基團，3'端 標記有渾滅基團；所述英光報告基團優選為VIC ;所述渾滅基團優選為MGBNFQ ;
[0041] 優選地，所述DNA稀釋液由邸TA、化OH和Tris-肥1溶液配制而成；更優選地，所述 Tris-HCl濃度為5. 0-10.0 mmol/l，所述邸TA的濃度為0. 5-1. Ommol/l，所述DNA稀釋液的 抑用化OH溶液調節為6. 0-8. 5。
[0042] 本發明的實時英光PCR技術來定性與定量檢測CHO細胞DNA的方法和依據所述方 法制備的PCR試劑盒，實現了檢測C冊細胞DNA殘留的定量限低至0. 5fg/ U 1，表明本方法 具有非常好的靈敏度，且具有較高的特異性。
[0043] 另外，本方法中所用的IPC試劑中包括IPC擴增的模板，引物和VIC-IPC探針，產 生的VIC英光信號與FAM英光信號區別開來，能對所有加入IPC試劑的Q-PCR反應管起質 控作用，可W評價實驗中所有PCR反應管是否成功的發生PCR反應，避免出現假陰性現象而 不能識別判定。因為各反應管的中所加的IPC模板量都是一樣的，可W通過統計各管的IPC 的Ct值，來監督樣品管中的擴增效率與標準曲線管中的擴增效率，各樣品管中IPC的Ct平 均值與標準曲線管的IPC的Ct平均值的比值介于90%~110%間時，表示實驗結果可信；否 貝IJ，樣品管中的擴增效率與標準曲線管中的擴增效率有差異，樣品管的擴增有可能受抑制， 擴增效率與標準曲線管不一致，實驗結果不可信，準確度無法保證。引入IPC試劑，可W有 效的排查檢測過程中出現的異常值，提高檢測系統的準確性。
[0044] 本發明提供的實時英光定量PCR方法可W檢測重組蛋白的中間過程樣品、半成 品、成品等樣品中的C冊細胞殘留DNA，同時還帶有IPC試劑作為PCR反應的內參。可W為 重組蛋白藥物的生產提供可靠的質量檢測數據，為重組蛋白藥物的研發和安全生產提供重 要支持。
【附圖說明】
[0045] W下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[004引圖1為本發明的C冊細胞DNA標準品擴增曲線圖，顯示擴增曲線有明顯的指數增 長期。
[0047] 圖2為本發明的C冊細胞DNA標準品標準曲線圖，由圖可知，所述曲線的線性方 程；Y = -3. 2581g狂)巧9. 501，R2= 0. 999,說明CHO細胞DNA標準品的在Ifg至3000pg之 間呈良好的線性關系，即CT值與DNA模板量的Ig值呈良好的線性關系，R 2均在0. 99 W上， 可W檢測出很低含量C冊細胞殘余DNA。
[004引圖3為本發明的C冊細胞專屬性試驗擴增曲線圖，從圖中可W得知，加入人的淋己 瘤細胞、酵母菌、大腸桿菌的基因組與未加其他種類的基因組的C冊細胞DNA的擴增曲線高 度重合，第1組擴增曲線為添加和未加其他種類的基因組的樣品中C冊細胞DNA的擴增曲 線圖（FAM信號）；第二組擴增曲線為添加和未加其他種類的基因組的樣品中IPC質粒的擴 增曲線圖（VIC信號）。
[0049] 圖4為加入人的淋己瘤細胞、酵母菌、大腸桿菌的基因組與未加其他種類的基因 組的C冊細胞DNA的標準曲線圖，各標準曲線完全一致，高度重合。
【具體實施方式】
[0050] 連施例1 :方法學確認
[0051] 1. 1材料和試劑；2XQ-PCR預混液為市售產品，ViiA 7英光定量PCR儀為Life Technologies產品，DNA稀釋液由本實驗室采用分子生物級試劑配制，基因組DNA提取試劑 盒為 Life Technologies產品；IPC試劑中 IPC模板為Promage 公司的PGEM-T Easy Vector 系列產品，實驗中涉及的引物和相應探針由Life Technologies公司合成。
[0052] 方法學確認所使用的引物序列和探針序列如下：
[0053] 正向引物序列；5'-CTACCAGAGGTCCTGAGTTCAATT-3'（沈Q ID N0:1)
[0054] 反向引物序列；5'-GGGCAC CAGGTCTCATAACG-3'（沈Q ID N0:2)
[00巧]所述的化qman探針核巧酸序列為：
[0056] 化9111311 探針；5'-CCAGCAACCA CATGGTGGCT CAC-3'（SEQ ID N0:3)
[0057] ^qman探針5'端的英光報告基團為FAM ;3'端的渾滅基團為TAMRA。
[005引所述IPC試劑中核巧酸引物序列為：
[0059] IPC 正向引物序列；5' -ACTTGGTCTGACAGTTACCAATG-3'（SEQ ID NO ;4)
[0060] IPC 反向引物序列；5' -GGAGTCAGGCAACTATGGATG-3'（SEQ ID NO ;5)
[0061] 所述IPC探針的核巧酸序列為：
[0062] IPC 探針；5'-TAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGA-3'（沈Q ID NO ;6)
[006引 IPC探針5'端的英光報告基團為VIC ;3'端的渾滅基團為MGBNFQ。
[0064] DNA的提取：按照基因組DNA提取試劑盒的說明書所示步驟提取C冊細胞DNA。
[0065] IPC試劑即內控對照，含IPC模板，IPC正向引物、IPC反向引物，IPC探針試劑，其 中含IPC模板是Progema的PGEM-T Easy Vecto;r(Cat#A 1360)，按下列方法配制IPC試劑： 每2.5111的1口(：試劑里含有川1的^邑/111的1口(：模板、0.51111〇111的1口(：正向引物、 0. 5 U 1 10 U M的IPC反向引物、0. 5 U 15 U M的IPC探針。將上述各試劑預先混合，進行PCR 加樣時，只需在每管中加入2. 5U 1即可。
[006引將PCR反應的試劑取出；分別是Q-PCR預混液（2 X )，正向引物，反向引物，化qman 探針，純水，IPC試劑。每個樣品和標準品做3個重復管，每管30 Ul的反應體系。根據樣 品的數量確定反應的管數，按下表表1準備PCR Mix。
[0067] 表1 ;PCR反應試劑加樣體積表
[0068]
[0069]
[0070] PCR反應體系配置完成后，在ViiA 7英光定量PCR儀上進行PCR擴增。PCR條件 為 95°C預變性 IOmin ;95°C 15s，60°C 60s，40 個循環；分析。
[0071] 1.2靈敏度實驗
[007引除DNA模板外，按照表2把混合好的PCR Mix,加入到八聯管中，每管20 U 1。
[0073] 由于本申請的方法是在CHO細胞基因組的Alu短重復序列上設計的引物，Alu序 列在基因組中具有大量的重復序列，所W能檢測很低濃度的C冊細胞基因組DNA。為此，為 了驗證本方法的靈敏度，將C冊細胞DNA標準品用DNA稀釋液燈ris-肥1 lOmmol/l，邸了八 Immol/L，抑為8.0)稀釋成一系列濃度梯度。取無 DNA殘留的1.5ml離必管，分別標記： SD1，SD2, SD3, SD4, SD5, SD6、SD7 和 SD8。取 30ng/ U 1 的 C冊細胞 DNA 標準品，用 DNA 稀 釋液（燈ris-肥 1 10mmol/L，EDTAlmmol/L，pH 為 8)稀釋成 300pg/y l、30pg/y l、：3pg/y 1、 0. ：3pg/y l、30fg/y l、3fg/y 1、0. 5fg/y 1、0.1 fg/y 1。
[0074] 如圖I的擴增曲線顯示：擴增曲線有明顯的指數增長期。如圖2的標準曲線；線性 方程；Y = -3. 25別g狂)巧9. 501，R2= 0. 999,可知，每個反應管中加入CHO細胞DNA標準品 的在Ifg至3000pg之間呈良好的線性關系，即CT值與DNA模板量的Ig值呈良好的線性關 系，R 2均在0. 99 W上，可W檢測出很低含量C冊細胞殘余DNA。
[00巧]表2是額外H次實驗結果的標準曲線，從表中可看出，H次實驗在30fg至3000pg 間的線性很好，R2均能達到0. 99 W上，具有良好的線性。
[0076] 定量限：由上述標準曲線方程可知，在DNA模板量0.1 fg/y 1至30化g/y 1間，具 有良好的線性，所W本方法對C冊細胞DNA的定量限LOQ可達0.1 fg/U 1。
[0077] 表2 C冊細胞DNA標準品擴增線性方程
[0078]
[0079] I. 3專屬性實驗
[0080] 由于本實驗是在C冊細胞基因組的Alu重復序列上設計的特異性引物，所W引物 和探針具有高度的特異性，為了驗證引物和探針的特異性，我們在加入Cffi)細胞基因組的 模板的同時，同時分別加入人的淋己瘤細胞、酵母菌、大腸桿菌的基因組，進行PCR擴增反 應。
[008。 如圖3所示，添加與未加其他種類的基因組DNA的擴增標準曲線差異較小，則說明 了引物和探針不會在其他物種的基因組DNA發生非特異性反應；各組中IPC模板擴增曲線 差異較小，說明實驗結果可靠。因此圖3說明本實驗所設計的引物不會擴增C冊細胞DNA W外其他DNA，本實驗所設計的引物和探針具有高度的特異性，專屬性較好。
[008引其中，圖3中第一組擴增曲線中的A組為化g/ U 1 CHO DNA的擴增曲線，和分別滲 入IOng/的人的淋己瘤細胞、酵母菌、大腸桿菌的基因組的擴增曲線；
[008引圖3中第一組擴增曲線中的B組為0.化g/ U 1 CHO DNA的擴增曲線，和分別滲入 Wng/U 1的人的淋己瘤細胞、酵母菌、大腸桿菌的基因組的擴增曲線；
[0084] 圖3中第一組擴增曲線中的C組為30fg/ ill C冊DNA的擴增曲線，和分別滲入 Wng/U 1的人的淋己瘤細胞、酵母菌、大腸桿菌的基因組的擴增曲線；
[00財圖3中第一組擴增曲線中的D組為3fg/ U 1 C冊DNA的擴增曲線，和分別滲入 Wng/U 1的人的淋己瘤細胞、酵母菌、大腸桿菌的基因組的擴增曲線；
[008引圖3中第一組擴增曲線中的E組為0. 3fg/ U 1 CHO DNA的擴增曲線，和分別滲入 Wng/U 1的人的淋己瘤細胞、酵母菌、大腸桿菌的基因組的擴增曲線；
[0087] 圖3中第二組擴增曲線為添加和未加其他種類的基因組的樣品中IPC質粒的擴增 曲線圖（VIC信號）。
[0088] 從圖中可W得知，添加與未加其他種類的基因組DNA的擴增標準曲線差異較小， 則說明了引物和探針不會在其他物種的基因組DNA發生非特異性反應；各組中IPC模板擴 增曲線差異較小，說明實驗結果可靠。
[0089] 圖4為根據圖3的擴增標準曲線繪制的圖，圖中為分別加入人的淋己瘤細胞、酵母 菌、大腸桿菌的基因組與未加其他種類的基因組DNA的PCR反應，不同C冊細胞DNA量的對 數值與Ct繪制的標準曲線。從圖4可W看到，加入人的淋己瘤細胞、酵母菌、大腸桿菌的基 因組與未加其他種類的基因組DNA的標準曲線高度重合，說明了引物和探針不會在其他物 種的基因組DNA發生非特異性反應，說明本實驗所設計的引物和探針具有高度的特異性， 專屬性較好。
[0090] 實施例1的結論；（1)本方法參照FDA和EM的要求，開發出了高靈敏度的Q-PCR 法測C冊細胞DNA殘留量試劑盒，每個Q-PCR反應管中都設置了內控試劑，保證所有的反應 管中的PCR擴增效率的一致性，提高結果的可信度。
[0091] 似每管中C冊細胞DNA標準品量在Ifg至3000pg之間（也就是DNA濃度在 0.1 fg/ U 1至30化g/ U 1)時，Ct值與DNA量的對數值呈良好的線性關系，線性方程；Y =-3. 25別g佩巧9. 501，R2= 0. 999。本方法的C冊細胞DNA的定量限可達到0.1 fg/y 1。 H次重復實驗中，Ct值與DNA量的對數值呈良好的線性關系，線性方程均比較接近，而且R 2 均局于0. 99。
[009引 （3)在專屬性實驗中，滲入人基因組DNA、酵母基因組DNA和大腸桿菌基因組DNA 均不會產生非特異性擴增，所W，本方法的專屬性很好，能特異性的檢測Cffi)細胞基因組 DNA。
[0093] 連施例2試劑念的制各
[0094] 制備包括W下組成成分的試劑盒：
[009引 DNA稀釋液巧血/管）1管、Q-PCR預混液（1. 5血/管）1管、IPC試劑（250 U 1/管）1 管、CHO細胞DNA標準品（40 U 1/管）1管、正向引物（IOOy 1/管）1管、反向引物（IOOy 1/ 管）1管、Taqman探針巧0 ill/管）1管、純水（1血/管）1管。
[0096] C冊細胞DNA標準品，濃度為3. 0 X l〇7fg/ U 1。
[0097] IPC 試劑：每 2. 5 U 1 的 IPC 試劑里含有 1 U 1 的 Ifg/ U 1 IPC 模板、0. 5 U 1 10 U M 的 IPC-F、0. 5 U 1 10 U M 的 IPC-R、0. 5 U 15 U M 的 IPC-Probe。
[009引正向引物、反向引物、Taqman探針都是IOy M。
[0099] DNA稀釋液；W去離子水為溶劑，Tris-肥1濃度為lOmM/L，邸TA的濃度為0. SmM/ L，用化OH溶液調節抑為8. 0。
[0100] 2 X Q-PCR 預混液；Q-PCR 預混液（2 X)。
【主權項】
1. 一種用于檢測CHO細胞DNA殘留的引物對，其特征在于，所述引物對為采用GenBank 登錄號為J00052. 1的核苷酸序列設計的特異性引物； 優選地，所述引物對為SEQ ID NO: 1所示的正向引物和SEQ ID NO: 2所示的反向引物。2. -種用于檢測CH0細胞DNA殘留的反應體系，其特征在于，所述反應體系為實時熒光 定量PCR反應體系，包含如權利要求1所述的引物對。3. 根據權利要求2所述的反應體系，其特征在于，所述體系還包括采用GenBank登錄號 為J00052. 1的核苷酸序列設計的Taqman探針； 優選地，所述Taqman探針的序列SEQ ID N0:3所示。4. 如權利要求2或3所述的反應體系，其特征在于，所述反應體系還包括Taq酶、 dNTPs、Mg2+、PCR緩沖液和DNA模板； 優選地，所述DNA模板為待測樣品、陰性質控品或IPC。5. -種用于檢測CH0細胞DNA殘留的方法，其特征在于，所述方法為實時熒光定量PCR 法，包括使用如權利要求1所述的引物對擴增序列的步驟； 優選地，所述實時熒光定量PCR法使用如權利要求2或3所述的反應體系進行反應。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的反應程序為： 95°C預變性lOmin ;95°C 15s，60°C lmin，40個循環；根據所獲得的標準曲線，計算得到待檢 樣本中CH0細胞DNA的量。7. 根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法的檢測樣本為以CH0細胞作 為基因工程表達細胞株的生物蛋白，優選地為抗體、治療性蛋白或疫苗。8. -種用于檢測CH0細胞DNA殘留的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括PCR擴增反 應液、標準品、陰性質控品、IPC以及DNA稀釋液； 其中，所述PCR擴增反應液包括Taq酶、dNTPs、Mg2+、PCR緩沖液、引物對以及Taqman探 針；所述引物對為采用GenBank登錄號為J00052. 1的核苷酸序列設計的特異性引物；所述 Taqman探針為采用GenBank登錄號為J00052. 1的核苷酸序列設計的Taqman探針。9. 根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述引物對為SEQ ID NO: 1所示的正向 引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。10. 根據權利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于，所述Taqman探針的序列如SEQ ID NO:3所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861641SQ201510035400
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月23日
【發明人】彭育才, 艾軍文, 朱保國
【申請人】珠海市麗珠單抗生物技術有限公司