稀土銩元素摻雜的藍色上轉化納米基因載體的制備方法及應用
【專利摘要】本發明涉及稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米基因載體的制備方法及應用。包括：1)稀土銩元素摻雜的藍色稀土上轉換納米顆粒的制備：藍色上轉換納米顆粒采用溶劑熱法制備，制得的直徑為20～50納米；2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒；3)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒表面連接分子量為600的聚醚酰亞胺。本發明實時跟蹤外源基因的稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體的基因納米載體的基因轉染效率為40～70％，細胞存活率為80％～95％。本載體還可以通過在980納米近紅外光的照射，檢測藍色上轉換的位置來實時跟蹤基因所到達的目的位置。
【專利說明】
稀土銩元素摻雜的藍色上轉化納米基因載體的制備方法及應用
技術領域
[0001]本發明涉及一種可實時跟蹤外源基因的稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米基因載體的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]基因轉染是一種非常常規的生物和醫藥技術，但是通常的基因轉染用的試劑是相對分子質量為25，000的聚醚酰亞胺(PEI)，雖然該PEI比相對分子質量為600的PEI的轉染效率高，但是其細胞毒性也比相對分子質量為600的PEI大得多，因此將相對分子質量為600的PEI連接至一納米微球上便可以成功制備出一種轉染效率高，細胞毒性低的新型基因轉染載體。
[0003]此外，用常規的基因轉染試劑進行轉染細胞時，很難方便的示蹤基因載體的具體位置，也就無法判定目標細胞是否有外源基因的的進入。稀土上轉換發光材料是一種在近紅外光激發下能發出可見光的新型發光材料，其中近紅外光只引起很小的光損傷并且在組織中有很高的光子滲透性。因此稀土上轉換納米發光材料在醫學和生物學中的應用相對于其他材料，具有極大的優越性。而氯化銩摻雜的上轉化納米材料，能夠在980納米近紅外光的照射下發射出藍紫光較強的。于是將銩元素摻雜藍色上轉換材料制作成為一種基因載體，就可以實現實時跟蹤外源基因以及靶細胞的功能。因此，研制出一種具有轉染效率高，細胞毒性小，并且可以實時跟蹤外源基因的納米載體等優勢的新型基因納米載體具有重大的意義，在生物技術和醫藥技術領域具有重要的科研和臨床應用前景。
【發明內容】
[0004]本發明涉及一種可實時跟蹤外源基因的稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體的制備方法及應用。
[0005]本發明的稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米基因載體的特征:其直徑為30?60納米，制備的基因納米載體的基因轉染效率為40?70%，細胞存活率為80%?95%。此外，本載體還可以通過在980納米近紅外光的照射，檢測藍色上轉換的位置來實時跟蹤基因所到達的目的位置。
[0006]本發明的技術方案包括:
[0007]I)稀土銩元素摻雜的藍色稀土上轉換納米顆粒的制備:藍色上轉換納米顆粒采用溶劑熱法制備，制得的直徑為20?50納米；
[0008]2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒；
[0009]3)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒表面連接分子量為600的聚醚酰亞胺。
[0010]所述的步驟I)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米載體顆粒的制備方法步驟如下:
[0011]I)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H2O，200毫克YbCl3.6H2O和I毫克?3毫克TmCl3.6出0溶解至I?2毫升去離子水中，于300?400轉/分鐘磁力攪拌條件下，加熱至100?120°C直至稀土鹽完全溶液變成白色固體；
[0012]2)待水份完全水蒸干后，關閉加熱并冷卻至50?60°C，加入4?6毫升油酸及8?12毫升十八烯，并升溫至120?140°C使鹽溶液完全溶解；
[0013]3)冷卻至50?60°C，加入溶有50?60毫克氫氧化鈉和100?150毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液;升溫至110?120°c，采用油栗抽真空30?40分鐘；
[0014]4)通入氬氣，升溫到310?320°C，在300?400轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應50?60分鐘；
[0015]5)待反應結束后加入丙酮離心純化，得到藍色上轉換納米顆粒。
[0016]所述的步驟2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒，具體步驟如下:
[0017]I)取藍色上轉換納米顆粒8?10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉移至玻璃瓶中，然后加入等體積的N，N-二甲基甲酰胺，以90?10W的功率超聲混勻；
[0018]2)稱取150?200毫克的無水檸檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯，以90?10W的功率超聲混勻；
[0019]3)將上述步驟2)中的溶液加入I)中，于300?400轉/分鐘，100?110°C磁力攪拌條件下反應5?6小時；
[0020]4)待反應結束后，以12，000?13，000轉/分鐘，離心8?10分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I?3遍，即制得水溶性的藍色上轉換納米顆粒；
[0021]所述的步驟3)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒表面連接分子量為600的聚醚酰亞胺方法如下:
[0022]I)將水溶性藍色上轉換納米顆粒溶解至2?3毫升的去離子水中并轉移至玻璃瓶中，然后加入75?100微升、相對分子質量為600的聚醚酰亞胺，并于15?20 °C加熱，300?400轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應10?12小時，然后以12,000?13，000轉/分鐘，離心8?10分鐘，得到表面吸附有聚醚酰亞胺的藍色上轉換納米顆粒；
[0023]2)將上述沉淀全部加入去離子水中，并按照質量份數比碳二亞胺:N-羥基琥珀酰亞胺=0.5:0.5?I，繼續攪拌3?4小時后離心純化，制得吸附DNA的藍色上轉換基因納米載體。
[0024]稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體應用轉染外源綠色熒光蛋白質粒DNA至He I a細胞。
[0025]具體應用方法是:
[0026]I)藍色上轉換基因納米載體吸附質粒DNA:將藍色上轉換基因納米載體溶解至100?150微升的無菌去離子水中；取一無菌的1.5毫升的離心管，加入80?100微升的OPT1-MEM無血清培養基和0.3?0.6微克的綠色熒光蛋白質粒DNA并充分混勻，再加入與質粒DNA的質量體積比為1:1?2的藍色上轉換基因納米載體，并混勻后靜止30?40分鐘；
[0027]2)將藍色上轉換基因納米載體轉染基因至動物細胞:將上述含有外源基因質粒DAN和藍色上轉換基因納米載體的復合物全部加入至一24孔板或48孔板的海拉細胞中，再于37°C，5%二氧化碳培養箱中培養3?4小時后吸取培養液，并加入200?300毫升的新鮮完全培養液;培養18?20小時后于熒光顯微鏡觀察并計算轉染效率。
[0028]實時跟蹤外源基因的稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體的基因納米載體的基因轉染效率為40?70%，細胞存活率為80%?95%。
[0029]本載體還可以通過在980納米近紅外光的照射，檢測藍色上轉換的位置來實時跟蹤基因所到達的目的位置。
[0030]本發明的優勢在于:I)制備的基因納米載體的基因轉染效率為40?70%，細胞存活率為80 %?95 %。2)可以通過在980納米近紅外光的照射，檢測藍色上轉換的位置來實時跟蹤基因所到達的目的位置。
【附圖說明】
[0031]圖1:用溶膠凝膠法制備的介孔稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米基因載體的透射電子顯微鏡照片(形貌分析)。
[0032]圖2:將稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體轉染綠色熒光蛋白(GFP)基因至人宮頸癌細胞(Hela細胞)后的轉染結果。
【具體實施方式】
[0033]下面的實施例中將對本發明作進一步的闡述，但本發明不限于此。
[0034]一種稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米基因載體的制備方法;其特征步驟如下:
[0035]I)藍色上轉換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H20，200毫克YbCb.6H2O和I毫克?3毫克TmCh.6H2O溶解至I?2毫升去離子水中，于300?400轉/分鐘磁力攪拌條件下，加熱至100?120°C直至稀土鹽完全溶液變成白色固體。
[0036]2)待水份完全水蒸干后，關閉加熱并冷卻至50?60°C以，用移液管加入4?6毫升油酸及8?12毫升十八烯，并升溫至120?140°C使鹽溶液完全溶解。
[0037]3)冷卻至50?60 °C以下，加入溶有50?60毫克氫氧化鈉、100?150毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液;調節溫度并升溫至110?120°c，采用油栗抽真空30?40分鐘。
[0038]4)通入氬氣，迅速升溫到310?320°C，維持在300?400轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應50?60分鐘。
[0039]5)待反應結束后加入丙酮離心純化，最終產物真空干燥處理，以備后用。
[0040]采用配體交換法制備水溶性羧基化藍色上轉換納米顆粒，具體步驟如下:
[0041]I)取權利要求1中制得的藍色上轉換納米顆粒8?10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉移至玻璃瓶中，然后加入等體積的N，N-二甲基甲酰胺，以90?100W的功率超聲混勻。
[0042]2)稱取150?200毫克的無水檸檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯，以90?10W的功率超聲混勻。
[0043]3)將上述步驟2)中的溶液加入I)中，于300?400轉/分鐘，100?110°C磁力攪拌條件下反應5?6小時。
[0044]4)待反應結束后，以12，000?13，000轉/分鐘，離心8?10分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I?3遍，即制得水溶性的藍色上轉換納米顆粒。
[0045]水溶性藍色上轉換納米顆粒表面連接聚醚酰亞胺:
[0046]I)將權利要求2中制得的水溶性藍色上轉換納米顆粒溶解至2?3毫升的去離子水中并轉移至玻璃瓶中，然后加入75?100微升，相對分子質量為600的聚醚酰亞胺，并于15?20°C加熱，300?400轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應10?12小時，然后以12,000?13，000轉/分鐘，離心8?10分鐘，得到表面吸附有聚醚酰亞胺的藍色上轉換納米顆粒。
[0047]2)將上述沉淀全部加入至加2?3毫升的去離子水中，并按照質量份數比碳二亞胺:N-羥基琥珀酰亞胺=0.5:0.5?I，繼續攪拌3?4小時后離心純化，即制得可以吸附DNA的藍色上轉換基因納米載體。
[0048]藍色上轉換基因納米載體轉染外源綠色熒光蛋白(GFP)質粒DNA至Hela細胞應用。
[0049]I)藍色上轉換基因納米載體吸附質粒DNA:將權利要求4所述中制得的藍色上轉換基因納米載體溶解至100?150微升的無菌去離子水中。取一無菌的1.5毫升的離心管，加入80?100微升的OPT1-MEM無血清培養基和0.3?0.6微克的綠色熒光蛋白(GFP)質粒DNA并充分混勻，再加入與質粒DNA的質量體積比為1:1?2的藍色上轉換基因納米載體，并混勻后靜止30?40分鐘。
[0050]2)將藍色上轉換基因納米載體轉染基因至動物細胞:將上述含有外源基因質粒DAN和藍色上轉換基因納米載體的復合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)細胞中，再于37°C，5%二氧化碳培養箱中培養3?4小時后吸取培養液，并加入200?300毫升的新鮮完全培養液。培養18?20小時后于熒光顯微鏡觀察并計算轉染效率。
[0051 ] 實施例1:
[0052]稀土銩元素摻雜的藍色稀土上轉換基因納米載體的制備方法，具體步驟如下:
[0053]I)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H20，200毫克YbCl3.6H20和I毫克TmCl3.6H20溶解至I毫升去離子水中，于300轉/分鐘磁力攪拌條件下，加熱至100°C直至稀土鹽完全溶液變成白色固體。待水份完全水蒸干后，關閉加熱并冷卻至80°C以下，用移液管加入2毫升油酸及5毫升十八烯，并升溫至150°C使鹽溶液完全溶解。冷卻至60°C以下，加入溶有50毫克氫氧化鈉、100毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液；調節溫度并升溫至120°C，采用油栗抽真空10分鐘。通入氬氣，迅速升溫到280°C，維持在100轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應0.5小時。待反應結束后加入丙酮離心純化，最終產物真空干燥處理，以備后用。
[0054]2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒:取上述步驟制得的藍色上轉換納米顆粒2毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入等體積的N，N-二甲基甲酰胺，以50W的功率超聲混勻。再稱取50毫克的無水檸檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯，以50W的功率超聲混勻。將上述兩種溶液混勻，于100轉/分鐘，100°C磁力攪拌條件下反應2小時。待反應結束后，以11，000轉/分鐘，離心20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I遍，即制得水溶性的藍色上轉換納米顆粒。
[0055]3)水溶性稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒表面連接聚醚酰亞胺(PEI):將上述步驟制得的水溶性藍色上轉換納米顆粒溶解至2毫升的去離子水中并轉移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入50微升，相對分子質量為600的聚醚酰亞胺(PEI)，并于20°C加熱，100轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應6小時。待反應結束后，以11，000轉/分鐘，離心20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I遍，即制得可以吸附DNA的藍色上轉換基因納米載體。
[0056]實施例2:
[0057]稀土銩元素摻雜的藍色稀土上轉換基因納米載體的制備方法，具體步驟如下:
[0058]I)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H20，200毫克YbCl3.6H20和2毫克TmCl3.6H20溶解至1.5毫升去離子水中，于350轉/分鐘磁力攪拌條件下，加熱至110Γ直至稀土鹽完全溶液變成白色固體。待水份完全水蒸干后，關閉加熱并冷卻至80°C以下，用移液管加入5毫升油酸及10毫升十八烯，并升溫至160°C使鹽溶液完全溶解。冷卻至60 °C以下，加入溶有75毫克氫氧化鈉、200毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液;調節溫度并升溫至120°C，采用油栗抽真空30分鐘。通入氬氣，迅速升溫到300°C，維持在300轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應0.75小時。待反應結束后加入丙酮離心純化，最終產物真空干燥處理，以備后用。
[0059]2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒:取上述步驟制得的藍色上轉換納米顆粒8毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入等體積的N，N-二甲基甲酰胺，以80W的功率超聲混勻。再稱取100毫克的無水檸檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯，以80W的功率超聲混勻。將上述兩種溶液混勻，于300轉/分鐘，120°C磁力攪拌條件下反應4小時。待反應結束后，以10，000轉/分鐘，離心10分鐘，并用去離子水洗滌沉淀2遍，即制得水溶性的藍色上轉換納米顆粒。
[0060]3)水溶性稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒表面連接聚醚酰亞胺(PEI):將上述步驟制得的水溶性藍色上轉換納米顆粒溶解至3毫升的去離子水中并轉移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入100微升，相對分子質量為600的聚醚酰亞胺(PEI)，并于30°C加熱，300轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應9小時。待反應結束后，以10，000轉/分鐘，離心10分鐘，并用去離子水洗滌沉淀2遍，即制得可以吸附DNA的藍色上轉換基因納米載體。
[0061 ] 實施例3:
[0062]稀土銩元素摻雜的藍色稀土上轉換基因納米載體的制備方法，具體步驟如下:
[0063]I)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H20，200毫克YbCl3.6H20和3毫克TmCl3.6H20溶解至I?2毫升去離子水中，于400轉/分鐘磁力攪拌條件下，加熱至120°C直至稀土鹽完全溶液變成白色固體。待水份完全水蒸干后，關閉加熱并冷卻至80°C以下，用移液管加入10毫升油酸及30毫升十八烯，并升溫至180°C使鹽溶液完全溶解。冷卻至60°C以下，加入溶有100毫克氫氧化鈉、300毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液;調節溫度并升溫至120°C，采用油栗抽真空40分鐘。通入氬氣，迅速升溫到320°C，維持在500轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應I小時。待反應結束后加入丙酮離心純化，最終產物真空干燥處理，以備后用。
[0064]2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒:取上述步驟制得的藍色上轉換納米顆粒10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入等體積的N，N-二甲基甲酰胺，以100W的功率超聲混勻。再稱取200毫克的無水檸檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯，以100W的功率超聲混勻。將上述兩種溶液混勻，于500轉/分鐘，150°C磁力攪拌條件下反應6小時。待反應結束后，以11，000轉/分鐘，離心20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀3遍，即制得水溶性的藍色上轉換納米顆粒。
[0065]3)水溶性稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒表面連接聚醚酰亞胺(PEI):將上述步驟制得的水溶性藍色上轉換納米顆粒溶解至5毫升的去離子水中并轉移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入200微升，相對分子質量為600的聚醚酰亞胺(PEI)，并于80°C加熱，500轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應12小時。待反應結束后，以9，000轉/分鐘，離心5分鐘，并用去離子水洗滌沉淀3遍，即制得可以吸附DNA的藍色上轉換基因納米載體。
[0066]實施例4:
[0067]稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體轉染外源綠色熒光蛋白(GFP)質粒DNA至He Ia細胞，具體步驟如下:
[0068]I)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體吸附質粒DNA:將權利要求3所述中制得的藍色上轉換基因納米載體溶解至100微升的無菌去離子水中。取一無菌的1.5毫升的離心管，加入50微升無血清培養基OPT1-MEM和0.3微克的綠色熒光蛋白(GFP)質粒DNA并充分混勻，再加入I微升裝藍色上轉換基因納米載體，并混勻后靜止10分鐘。
[0069]2)將稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體轉染基因至動物細胞:將上述含有外源基因質粒DAN和藍色上轉換基因納米載體的復合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(HeIa)細胞中，再于37°C，5%二氧化碳培養箱中培養4小時后吸取培養液，并加入200毫升的新鮮完全培養液。培養48小時后，用熒光顯微鏡觀察并計算基因表達效率，基因表達效率如圖2所示。
[0070]實施例5:
[0071]稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體轉染外源綠色熒光蛋白(GFP)質粒DNA至He Ia細胞，具體步驟如下:
[0072]I)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體吸附質粒DNA:將權利要求3所述中制得的藍色上轉換基因納米載體溶解至100?500微升的無菌去離子水中。取一無菌的1.5毫升的離心管，加入100微升無血清培養基OPT1-MEM和0.1微克的綠色熒光蛋白(GFP)質粒DNA并充分混勻，再加入I?5微升裝藍色上轉換基因納米載體，并混勻后靜止20分鐘。
[0073]2)將稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體轉染基因至動物細胞:將上述含有外源基因質粒DAN和藍色上轉換基因納米載體的復合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(HeIa)細胞中，再于37°C，5%二氧化碳培養箱中培養6小時后吸取培養液，并加入300毫升的新鮮完全培養液。培養48小時后，用熒光顯微鏡觀察并計算基因表達效率，基因表達效率如圖2所示。
[0074]實施例6:
[0075]稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體轉染外源綠色熒光蛋白(GFP)質粒DNA至He Ia細胞，具體步驟如下:
[0076]I)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體吸附質粒DNA:將權利要求3所述中制得的藍色上轉換基因納米載體溶解至500微升的無菌去離子水中。取一無菌的1.5毫升的離心管，加入200微升無血清培養基OPT1-MEM和3微克的綠色熒光蛋白(GFP)質粒DNA并充分混勻，再加入I?5微升裝藍色上轉換基因納米載體，并混勻后靜止30分鐘。
[0077]2)將稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體轉染基因至動物細胞:將上述含有外源基因質粒DAN和藍色上轉換基因納米載體的復合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(HeIa)細胞中，再于37°C，5%二氧化碳培養箱中培養8小時后吸取培養液，并加入500毫升的新鮮完全培養液。培養48小時后，用熒光顯微鏡觀察并計算基因表達效率，基因表達效率如圖2所示。
[0078]實施例7:
[0079]形態觀察、粒徑及其分布測定。取介孔藍色上轉換納米基因載體溶液經離心分離后，取出沉淀物，加蒸餾水少量使分散，滴于碳支持膜上制樣，在透射電鏡下觀察其形貌狀態并拍照。透射電鏡下觀察到介孔藍色上轉換納米基因載體呈均勻規則的球形粒子，其直徑在20?50nm范圍內可控。所制得的納米載體如圖1所示。
[0080]本發明公開和提出的稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米基因載體的制備方法及應用，本領域技術人員可通過借鑒本文內容，適當改變條件路線等環節實現，盡管本發明的方法和制備技術已通過較佳實施例子進行了描述，相關技術人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和技術路線進行改動或重新組合，來實現最終的制備技術。特別需要指出的是，所有相類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發明精神、范圍和內容中。
【主權項】
1.一種稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米基因載體的制備方法;其特征是步驟如下: 1)稀土銩元素摻雜的藍色稀土上轉換納米顆粒的制備:藍色上轉換納米顆粒采用溶劑熱法制備，制得的直徑為20?50納米； 2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒； 3)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒表面連接分子量為600的聚醚酰亞胺。2.如權利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟I)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米載體顆粒的制備方法步驟如下: 1)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H20,200毫克YbCl3.6H20和I毫克?3毫克TmCl3.6H20溶解至I?2毫升去離子水中，于300?400轉/分鐘磁力攪拌條件下，加熱至100?120°C直至稀土鹽完全溶液變成白色固體； 2)待水份完全水蒸干后，關閉加熱并冷卻至50?60°C，加入4?6毫升油酸及8?12毫升十八烯，并升溫至120?140°C使鹽溶液完全溶解； 3)冷卻至50?60°C，加入溶有50?60毫克氫氧化鈉和100?150毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液;升溫至110?120°C，采用油栗抽真空30?40分鐘； 4)通入氬氣，升溫到310?320°C，在300?400轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應50?60分鐘； 5)待反應結束后加入丙酮離心純化，得到藍色上轉換納米顆粒。3.如權利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒，具體步驟如下: 1)取藍色上轉換納米顆粒8?10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉移至玻璃瓶中，然后加入等體積的N，N-二甲基甲酰胺，以90?10W的功率超聲混勻； 2)稱取150?200毫克的無水檸檬酸溶解至1.25毫升的N，N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯，以90?100W的功率超聲混勻； 3)將上述步驟2)中的溶液加入I)中，于300?400轉/分鐘，100?110°C磁力攪拌條件下反應5?6小時； 4)待反應結束后，以12，000?13，000轉/分鐘，離心8?10分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I?3遍，即制得水溶性的藍色上轉換納米顆粒。4.如權利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟3)稀土銩元素摻雜的藍色上轉換納米顆粒表面連接分子量為600的聚醚酰亞胺方法如下: 1)將水溶性藍色上轉換納米顆粒溶解至2?3毫升的去離子水中并轉移至玻璃瓶中，然后加入75?100微升、相對分子質量為600的聚醚酰亞胺，并于15?20°C加熱，300?400轉/分鐘磁力條件下，攪拌反應10?12小時，然后以12，000?13，000轉/分鐘，離心8?10分鐘，得到表面吸附有聚醚酰亞胺的藍色上轉換納米顆粒； 2)將上述沉淀全部加入去離子水中，并按照質量份數比碳二亞胺:N-羥基琥珀酰亞胺= 0.5:0.5?I，繼續攪拌3?4小時后離心純化，制得吸附DNA的藍色上轉換基因納米載體。5.稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體應用轉染外源綠色熒光蛋白質粒DNA至Hela細胞。6.如權利要求5所述的應用，其特征是: I)藍色上轉換基因納米載體吸附質粒DNA:將藍色上轉換基因納米載體溶解至100?150微升的無菌去離子水中；取一無菌的1.5毫升的離心管，加入80?100微升的OPT1-MEM無血清培養基和0.3?0.6微克的綠色熒光蛋白質粒DNA并充分混勻，再加入與質粒DNA的質量體積比為1:1?2的藍色上轉換基因納米載體，并混勻后靜止30?40分鐘； 2)將藍色上轉換基因納米載體轉染基因至動物細胞:將上述含有外源基因質粒DAN和藍色上轉換基因納米載體的復合物全部加入至一24孔板或48孔板的海拉細胞中，再于37°C，5%二氧化碳培養箱中培養3?4小時后吸取培養液，并加入200?300毫升的新鮮完全培養液;培養18?20小時后于熒光顯微鏡觀察并計算轉染效率。7.稀土銩元素摻雜的藍色上轉換基因納米載體轉染外源綠色熒光蛋白質粒DNA至Hela細胞的轉染效率為:40?70 %。
【文檔編號】C12N15/85GK105861549SQ201610209491
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月5日
【發明人】常津, 鄭斌, 王漢杰, 諶紅彬, 潘慧卓
【申請人】天津大學