畢赤酵母重組子表達人源sod的研究的制作方法
【專利摘要】畢赤酵母重組子表達人源SOD的研究，通過培養條件的優化，在500ml的三角瓶、裝液量為20％、30℃、225rpm、Cu2+濃度為1％、甲醇濃度為1％，培養基24h時，重組畢赤酵母表達人源SOD的酶活力最高，可達到18.322U/ml。通過此發酵條件優化后，可以獲得分泌型的SOD發酵液，并且具有酶活性的SOD產品。
【專利說明】
畢赤酵母重組子表達人源SOD的研究
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物技術領域，具體涉及畢赤酵母重組子表達人源SOD的研究。
【背景技術】
[0002]作為真核細胞，巴斯德4fswh8p赤酵母具有許多的高等真核細胞特性表達系統的優點，如蛋白質加工，蛋白質折疊，翻譯后修飾，且像大腸桿菌或酵母釀酒酵母生物一樣容易操作。相比于桿狀病毒或哺乳動物組織培養，巴斯德畢赤酵母具有更快，更方便，較便宜，高水平表達等優點。作為酵母菌的一種，巴斯德畢赤酵母擁有和釀酒酵母分子和遺傳同樣的操作優勢，同時還具有10至100倍的異源蛋白質表達水平。這些特點使畢赤酵母作為蛋白表達系統成為可能。
[0003]巴斯德畢赤酵母能夠利用甲醇作為唯一的碳源。在甲醇代謝的第一步是氧化的甲基甲醇通過酶醇氧化酶作用產生甲醛，除了產生甲醛，還產生了過氧化氫。避免過氧化氫的毒性作用，甲醇代謝在一個特殊的細胞器，稱為過氧化物酶體，這個細胞器的作用可以螯合副產物將有毒成分帶走細胞外。由于醇氧化酶對于氧氣具有差的親和力，所以畢赤酵母通過產生大量的酶來補充醇氧化酶。醇氧化酶的大量產生是驅動異源蛋白質在畢赤酵母表達的一個因素。
[0004]但目前研究中畢赤酵母表達的培養條件，發酵過程結束后，存在著SOD表達含量低，細胞內表達，酶活力低等不利因素。
【發明內容】
[0005]針對現有技術存在的問題，本發明旨在提供一種通過改變條件來優化目的蛋白的表達量的方法。
[0006]本發明采用的技術方案是:畢赤酵母重組子表達人源SOD的研究中優化的培養條件包括:
[0007]I)培養基；
[0008]重組畢赤酵母在BMGY中培養進行誘導表達；
[0009]2)通氣；
[0010]將有重組畢赤酵母的BMGY至于底部或側壁有擋板的三角瓶中進行培養，三角瓶的容積尺寸為500ml，培養基的體積需小于或等于三角瓶體積的10%-30%，選用2-3層棉紗布或是寬松的瓶塞蓋在三角瓶上；
[0011]3)溫度和搖床震蕩速度；
[0012]將裝有培養基的三角瓶至于恒溫震蕩培養箱中培養，溫度設置為30°C;所述恒溫震蕩培養箱若采用落地式恒溫震蕩培養箱，那么設定震蕩轉速為225-250rpm;若采用臺面式恒溫振蕩培養箱，那么設定震蕩轉速為250-300rpm;
[0013]4)甲醇濃度；
[0014]在重組畢赤酵母分泌表達SOD過程中，在其培養液中添加甲醇至甲醇終濃度為1%；
[0015]5)銅離子濃度；
[0016]在重組畢赤酵母分泌表達SOD過程中，在其培養液中添加硫酸銅至銅離子終濃度為1% ;
[0017]所述BMGY的成分組成包括:酵母浸粉、蛋白胨、pH6.0磷酸鉀緩沖溶液、YNB、生物素、甲醇、水。
[0018]所述BMGY的各成分的含量為:每10ml培養基液中含有Ig酵母浸粉、2g蛋白胨、10mM pH6.0的磷酸鉀緩沖溶液、1.34gYNB(YNB培養基商品)、4 X 10—5g生物素、Ig甲醇，其余成分為水。
[0019]與現有技術相比，本發明具有的有益效果是:通過培養條件的優化，在500ml的三角瓶、裝液量為20%、30°(:、225印111、012+濃度為1%、甲醇濃度為1%，培養基2411時，重組畢赤酵母表達人源SOD的酶活力最高，可達到18.322U/ml。通過此發酵條件優化后，可以獲得分泌型的SOD發酵液，并且具有酶活性的SOD產品。
【附圖說明】
[0020]圖1為SOD標準品曲線圖；
[0021 ]圖2為不同濃度甲醇下各重組畢赤酵母表達SOD活力測定圖；
[0022]圖3為不同時間內各濃度銅離子處理重組畢赤酵母表達SOD活力測定圖；
[0023]圖4為重組畢赤酵母表達SOD的SDS-PAGE測定圖；
[0024]圖5為重組畢赤酵母表達SOD的Western測定圖。
【具體實施方式】
[0025]本發明采用的技術方案是:
[0026]一、畢赤酵母重組子表達人源SOD的研究中優化的培養條件包括:
[0027]I)培養基；
[0028]重組畢赤酵母在BMGY中培養進行誘導表達；
[0029]2)通氣；
[0030]將有重組畢赤酵母的BMGY至于底部或側壁有擋板的三角瓶中進行培養，三角瓶的容積尺寸在50-2000ml范圍內，培養基的體積需小于或等于三角瓶體積的10%-30%，選用2-3層棉紗布或是寬松的瓶塞蓋在三角瓶上；
[0031]3)溫度和搖床震蕩速度；
[0032]將裝有培養基的三角瓶至于恒溫震蕩培養箱中培養，溫度設置為30°C;所述恒溫震蕩培養箱若采用落地式恒溫震蕩培養箱，那么設定震蕩轉速為225-250rpm;若采用臺面式恒溫振蕩培養箱，那么設定震蕩轉速為250-300rpm;
[0033]4)甲醇濃度；
[0034]在重組畢赤酵母分泌表達SOD過程中，分別在其培養液中添加甲醇至甲醇終濃度分別為0.5%、1%、2%，于恒溫震蕩培養箱中于30°(:、225印111條件下培養4811，測定300酶活力，測定結果如圖2所示；
[0035]5)銅離子濃度；
[0036]在重組畢赤酵母分泌表達SOD過程中，分別在其培養液中添加硫酸銅至銅離子終濃度分別為0%、0.2%、0.5%、I %，在恒溫震蕩培養箱中于30°C、225rpm條件下培養培養至24、48h、72h，測定SOD酶活力，測定結果如圖3所示。
[0037]二、重組畢赤酵母表達SOD的SDS-PAGE測定:
[0038]I)樣品制備
[0039]將SOD蛋白質樣品與5X樣品緩沖液(20ul+5ul)在一個Eppendorf管中混合；放入100 0C水浴中加熱5 — I Omin，取上清點樣；
[0040]2)分離膠及濃縮膠的制備
[0041 ]I將玻璃板、樣品梳、Spacer用洗滌劑洗凈，用ddH20沖洗數次，再用乙醇擦拭，晾干；
[0042]2將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，按照B1-Rad Mini Π /ΙΠ說明書提示裝好玻璃板；
[0043]3按如下體積配制10%分離膠8.0ml，混勻；
[0044]ddH20 3.0ml
[0045]l.0mol/LTris-HCl ρΗ=8.8 2.1ml
[0046]30%Acr-Bis 2.8ml
[0047]10% SDS 80ul
[0048]10%AP 56ul
[0049]TEMED 6ul
[0050]4向玻璃板間灌制分離膠，立即覆一層重蒸水，大約20min后膠即可聚合；
[0051 ]5按如下體積配制6%濃縮膠3.0ml，混勻；
[0052]ddH20 2.0ml
[0053]1.0mol/LTris-HClpH=6.8 400ul
[0054]30%Acr-Bis 600ul
[0055]10% SDS 36ul
[0056]10%AP 24ul
[0057]TEMED 4ul
[0058]6將上層重蒸水傾去，濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳；
[0059]7裝好電泳系統，加入電極緩沖液，上樣20μ1;
[0060]8穩壓200V，溴酚藍剛跑出分離膠時，停止電泳，約需45min?Ih;
[0061]9卸下膠板，剝離膠放入染色液中，室溫染色I?2hr;加入脫色液，置于SOrpm脫色搖床上，每20min更換一次脫色液(1ml冰乙酸;45ml乙醇;45ml蒸饋水)至完全脫凈;測定結果如圖4所示。
[0062]三、重組畢赤酵母表達SOD的Western Blot測定:
[0063]I)此步驟同SDS-PAGE步驟；
[0064]2)轉膜:
[0065]ITr is/甘氨酸-SDS-PAGE結束后，取出凝膠，在Tr is/甘氨酸緩沖液中漂洗數秒；
[0066]2將PVDF膜和濾紙切出與凝膠一樣大小，置轉移緩沖液中濕潤5?1min;
[0067]3將凝膠推到一張玻璃板(或投影膠片)上，在凝膠上放3層濾紙，用玻璃棒在濾紙上稍用力滾動，以除去各層間可能夾帶的氣泡。再在濾紙上蓋一張投影膠片或玻璃板上，形成“玻璃板4凝膠4濾紙4玻璃板”裝置；用手捏住上下玻璃板，將整個裝置反轉后放在桌面上;小心移去上面的玻璃板，在凝膠上覆蓋PVDF膜，再在PVDF膜上覆蓋3層濾紙，形成“3層濾紙—凝膠—PVDF膜—3層濾紙”的裝置；用玻璃棒在濾紙上稍用力滾動，以除去各層間可能夾帶的氣泡;將上面的裝置夾在兩塊轉印海面墊間，再夾入電轉印夾。
[0068]4將電轉印夾插入轉印電極板間，方向為“負極—海面墊—3層濾紙—凝膠—PVDF膜—3層濾紙—海面墊—正極”；
[0069 ] 5將轉印電極板插入電泳槽，加滿電轉印液，插入電轉印夾，將電泳槽放入冰箱內(電轉印液之前要放入冰箱內預冷)，連接好電極，接通電流，轉印夾的NC膜應對電泳槽的正極，100V，Ih;
[0070] 3)膜的封閉:
[0071 ] I洗膜:室溫漂洗3次X 1min，以盡量洗去轉印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結合；
[0072]2封閉:取漂洗的轉印膜，放入5%No_fat milk的封閉液內，搖床震動，室溫封閉2h，也可在4°C過夜；
[0073]3漂洗:用 I X TBS-T，pH7.6洗液，室溫漂洗3 X 1min ；
[0074]4)抗體雜交:
[0075]I封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液(TBS-T)稀釋的Abl濃度為lyg/ml，封口，4°C孵育過夜或室溫(22?25°C)搖動孵育2h;
[0076]2 液洗膜 3 XlOmin;
[0077]3標記的六匕2(羊抗鼠-冊？)室溫111，洗膜3\101^11。
[0078]5)ECL發光顯色:
[0079]IECL顯色劑配制:按Iml H20加顯色劑A、B各I滴，混勻；
[0080]2在暗室將雜交后印跡膜放入顯色盒中，加上混合好的顯色液，約I?5min;
[0081]3用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的顯色液，將一透明的玻璃紙蓋住撫平，并確定干的表面與膠片接觸；
[0082]4將印跡膜在暗室中使膠片暴光I?5min，沖洗膠片以確定所測抗原的正確暴光時間，暴光時間可短至幾秒也可以長到數小時。測定結果如圖5所述。
[0083]四、SOD酶活力測定操作方法:
[0084]I)標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品ΙΟΟμΙ，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μ1，混勻;然后從第一孔、第二孔中各取ΙΟΟμΙ分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μ1，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μ1棄掉，再各取50μ1分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μ1分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μ1，混勻后從第七、第八孔中分別取50μ1加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μ1，混勻后從第九第十孔中各取50μ1棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μ1，濃度分別為72U/mL，48U/mL，24U/mL，12U/mL，6U/mL);
[0085]2)加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔;在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μ1，然后再加待測樣品ΙΟμΙ (樣品最終稀釋度為5倍)；加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
[0086]3)溫育:用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘；
[0087]4)配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用；
[0088]5)洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干；
[0089]6)加酶:每孔加入酶標試劑50μ1，空白孔除外；
[0090]7)溫育:操作同本過程的步驟3);
[0091 ] 8)洗滌:操作同本過程的步驟5);
[0092]9)顯色:每孔先加入顯色劑Α50μ1，再加入顯色劑Β50μ1，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘；
[0093]10)終止:每孔加終止液50μ1，終止反應(此時藍色立轉黃色)；
[0094]11)測定:以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(0D值)；測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
[0095]五、SOD酶活力測定計算方法:
[0096]以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，如圖1所示，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
[0097]從圖2、圖3、圖4以及圖5的測試結果能夠得到通過培養條件的優化，在500ml的三角瓶、裝液量為20%、30°(:、225印111、012+濃度為1%、甲醇濃度為1%，培養基2411時，重組畢赤酵母表達人源SOD的酶活力最高，可達到18.322U/ml。通過此發酵條件優化后，可以獲得分泌型的SOD發酵液，并且具有酶活性的SOD產品。
【主權項】
1.畢赤酵母重組子表達人源SOD的研究，其特征在于，通過改變條件來優化目的蛋白的表達量，所述優化的培養條件包括: 1)培養基； 重組畢赤酵母在BMGY中培養進行誘導表達； 2)通氣; 將有重組畢赤酵母的BMGY至于底部或側壁有擋板的三角瓶中進行培養，三角瓶的容積尺寸500ml，培養基的體積需小于或等于三角瓶體積的10%-30%，選用2-3層棉紗布或是寬松的瓶塞蓋在三角瓶上； 3)溫度和搖床震蕩速度； 將裝有培養基的三角瓶至于恒溫震蕩培養箱中培養，溫度設置為30°C; 4)甲醇濃度； 在重組畢赤酵母分泌表達SOD過程中，在其培養液中添加甲醇至甲醇終濃度為I % ; 5)銅離子濃度； 在重組畢赤酵母分泌表達SOD過程中，在其培養液中添加硫酸銅至銅離子終濃度為1%； 6)培養時間； 將裝有培養基的三角瓶置于恒溫震蕩培養箱中，在30 0C下培養24h。2.根據權利要求1所述的畢赤酵母重組子表達人源SOD的研究，其特征在于，所述恒溫震蕩培養箱若采用落地式恒溫震蕩培養箱，那么設定震蕩轉速為225-250rpm;若采用臺面式恒溫振蕩培養箱，那么設定震蕩轉速為250-300rpm。3.根據權利要求1所述的畢赤酵母重組子表達人源SOD的研究，其特征在于，所述BMGY的成分組成包括:酵母浸粉、蛋白胨、PH6.0磷酸鉀緩沖溶液、YNB、生物素、甲醇、水。4.根據權利要求1所述的畢赤酵母重組子表達人源SOD的研究，其特征在于，所述BMGY的各成分的含量為:每10ml培養基液中含有Ig酵母浸粉、2g蛋白胨、10mM pH6.0的磷酸鉀緩沖溶液、1.34gYNB、4 × 10—5g生物素、Ig甲醇。
【文檔編號】C12N15/81GK105861537SQ201610340907
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】肖純凌, 李新鳴, 畢延波, 張奕晶, 孫冶, 李舒音, 海曉歐
【申請人】沈陽醫學院