一種嵌合抗原受體t細胞及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種嵌合抗原受體T細胞及其制備方法，本發明的嵌合抗原受體T細胞具有特定的食管癌相關功能活性，對食管癌的治療具有重要的潛在和實際價值，為食管癌的治療提供一個新的技術方向。
【專利說明】
一種嵌合抗原受體T細胞及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種基因工程技術領域，尤其是一種食管癌相關的嵌合抗原受體T細 胞及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 癌癥一直是困擾人類的巨大難題。我國每年新發腫瘤病例約為312萬例，平均每天 8550人意味著每分鐘就有6人就診斷為惡性腫瘤，這些數據都表明，癌癥依然是威脅健康的 一大殺手。多年來，癌癥治療的方法主要是手術、化療和放療，對腫瘤患者的臨床治療有效 率仍舊很低，據統計，同一種抗腫瘤藥物的有效率僅為25%。針對同一種腫瘤，用同樣的藥、 標準劑量的治療方法，在不同病人身上所起的療效及毒副作用卻有很大的差異。造成這種 結果的主要原因在于，腫瘤是一種多病因、異質性的疾病。過去十年來，依賴于患者個體生 物標志物的腫瘤個性化治療正在逐漸取代依據傳統經驗的治療模式，并展現出優越的療效 和廣闊的前景，如伊馬替尼和曲妥珠單抗。
[0003] 免疫療法是繼手術、化療、放療和靶向療法后出現的一種新型療法，被稱為治療癌 癥的"第五大療法"。它是利用患者自身免疫系統的力量來抵抗癌癥;癌癥免疫療法主要包 括過繼性細胞治療、免疫調節劑、腫瘤疫苗以及免疫結合點阻斷治療等。雖然有關免疫治療 的研究早在30年前就已開展，最近兩年《細胞》、《科學》、《自然》等國際頂級期刊刊出多項該 領域的突破研究成果，制藥巨頭也不斷推出此類型的重鎊療法。2014年12月6號-9號在舊金 山舉行的美國血液學會年會(ASH)上，癌癥免疫療法可謂是賺足了眼球，CAR-T療法更是備 受關注。
[0004] CART的概念是以色列ZeligEshhar博士上世紀80年代提出的，1989首次開發出嵌 合抗原受體T細胞。CART療法即嵌合抗原受體T細胞療法，繞過了 PD療法啟動過繼免疫應答 這一難關，開創了跨越式發展的醫學史新篇章。CART針對那不怎么靠譜的過繼免疫，引入全 新的概念與方法，成功地誘導出抗癌的過繼免疫應答。首先CART解決了抗原的難題。既然在 自然的狀況下免疫系統找不到抗原，那就人為指定一種抗原。考察急性淋巴B細胞白血病的 CART療法。淋巴B細胞表面有一個分化抗原CD19,無論是正常B細胞還是癌變B細胞都有表 達。選CD19為靶抗原可以確保沒有漏網之魚。接下來，怎樣確保T細胞能找到CD19靶抗原?這 也是CART的核心技術。自然的T細胞肯定不會將⑶19當作靶抗原的。⑶19表達于正常B細胞， T細胞對CD19耐受。CART將一個抗原受體嵌合到T細胞表面。這抗原受體本質是一種抗體，對 CD19有很高的親和性。兩者碰到就會結合，不離不棄。于是，用抗體蛋白聯接定位，T細胞就 釘住了癌細胞。所以有一比喻，這抗原受體就像GPS，給T細胞導航，為找到目標提供了保證。 抗體又是怎樣插入進T細胞的?這是通過基因轉染技術實現的。這里轉染的并不是抗體本身 而是編碼抗體的基因，也就是說轉染的是DNA。轉染的DNA會編碼抗體然后表達于T細胞表 面。
[0005] 僅僅嵌合了抗體的T細胞療法是第一代CART，解決了靶抗原或第一信號的問題。但 是臨床效果差強人意，原因是第二信號即共刺激信號的缺失。沒有共刺激信號T細胞仍然沒 法激活，那樣就算釘住了癌細胞也沒有戰斗力。產生共刺激信號需要T細胞和抗原提呈細胞 之間的互動。可是抗原提呈細胞也需要第一信號。這樣勢必還要將同樣的抗體嵌合進抗原 提呈細胞如DC，過于復雜了。于是，針對共刺激信號又開發出第二代CART。第二代CART在靶 向⑶19的基礎上，加入了⑶28或⑶137, T細胞上的共刺激受體。T細胞的信號域包括:⑶3ζ(Τ 細胞抗原受體信號轉導的組成成分)--CD28,或CD3G-一CD137。免疫應答的貫序可表述 為:CD 19激活抗體，抗體激活CD28(CD 137)，CD28 (CD 137 )激活CD3G。可以說，第二代CART同時 解決了第一信號和第二信號，不再依賴不怎么靠譜的腫瘤相關抗原，不再依賴抗原提呈細 胞，也不必擔心MHC的低表達。第三代CART的特點是在⑶28之后又加入了共刺激分子蛋白 0X40或4-1ΒΒ(4-1ΒΒ就是⑶137)。這兩種共刺激分子蛋白可進一步活化T細胞，延長生存期。 三代CART技術的演化反映了共刺激分子的重要作用。
[0006] 急性淋巴B細胞白血病的CART療法獲得了驚人的90%-100%的響應率，長期有效，不 少病患完全緩解也就是臨床痊愈了。更何況，這些入組CART的病患都是化療失敗、骨髓移植 后復發等就快走投無路重病患。CART將會成為人類歷史上偉大里程碑:真正治愈癌癥的方 法。
[0007] 推廣CART療法的主要障礙來自脫靶效應。像CD19不是腫瘤的靶點，而是B細胞本身 的靶點。腫瘤細胞清除掉的同時B細胞也被清除掉了。這已不是殺敵一千，自傷八百。更不是 殺敵一千，自傷八十。而是寧可錯殺一千，絕不放過一個。好在患者沒有B細胞照樣可以生 存，只要定期輸入丙種免疫球蛋白即可。只要靶點不是百分百腫瘤特異性，就會有脫靶效 應，這是CART副作用的主要來源。據報道，一例以HER2為靶抗原針對結腸癌的第三代CART治 療，病人輸入CART十五分鐘后出現呼吸窘迫，五天后死亡。檢測到高水平的細胞因子并發現 CART細胞浸潤肺組織。一個解釋是靶抗原在正常肺組織中有表達。為了提高CART治療安全 性和有效性，一個保守的劑量遞增方法是在2天或以上分散T細胞輸入劑量，不斷監測毒性 跡象，阻止可能誘發大規模反應的進一步T細胞輸入。用單克隆抗體封閉靶抗原來緩解脫靶 反應也是必要時的一種選擇。最近還提出了引入自殺基因的方案，必要時立即啟動CART自 殺，目前在III期臨床試驗。CART療法另一副作用是細胞因子風暴。據報道早期CART治療時 60%的病患要住ICU。現在用劑量遞增方法可大大減少細胞因子風暴的產生。
[0008] 總之，嵌合抗原受體CAR能與革El抗原高親和性結合而不受中樞耐受的影響，這一特 性使得CAR的免疫治療能夠克服以往免疫治療的大部分缺陷。到目前為止大多數臨床CART 引人注目的結果都來自治療血液疾病，針對實體瘤的CART臨床也開始起步。CART療法的風 險在于抗原受體的非特異性造成的脫靶效應。
【發明內容】
[0009] 本發明要解決的技術問題是提供一種食管癌相關的嵌合抗原受體T細胞及其制備 方法，為食管癌的治療提供一個新的技術方向。
[0010] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案如下。
[0011] 一種嵌合抗原受體τ細胞，該嵌合抗原受體τ細胞以淋巴τ細胞為宿主，在淋巴τ細 胞的核基因組中通過核轉染整合有SEQ ID NO: 1所示的基因。
[0012] 上述嵌合抗原受體T細胞以淋巴T細胞為宿主，在淋巴T細胞的表面含有SEQ ID NO: 1所示基因表達的抗原受體。
[0013] 上述嵌合抗原受體T細胞的制備方法，首先將SEQ ID NO:1所示的基因轉入非病毒 載體，然后通過核轉染技術將上述基因整合到淋巴T細胞的核基因組中，使得上述基因在淋 巴T細胞表面表達，將非特異性的淋巴細胞定向改造為能夠識別并對腫瘤細胞進行靶向殺 傷的特異性嵌合抗原受體T細胞。
[0014] 上述嵌合抗原受體T細胞的制備步驟包括： AjBMC分離 A-1、將新鮮血液轉移到50 mL離心管中，用生理鹽水按照體積比1:1進行稀釋，上下吹 打3-5次混勻，將6 mL Ficoll溶液加入到15 mL離心管中，豎直放置到水平臺面上靜置備 用;將稀釋好的血液8 mL用移液管緩慢均勻加入上述含Ficoll溶液的離心管中； A-2、將加好血液與Ficoll溶液的離心管輕輕轉移至離心機中，在轉移離心管過程中要 減少晃動，保持離心管豎直，以避免打破液面分層，室溫400g離心30分鐘； A-3、離心結束后，輕輕轉移離心管至超凈臺中，用移液器吸取中間的白膜層即淋巴細 胞層，吸取操作中避免吸取到下層或上層的細胞，避免造成污染，然后轉移至新的50 mL離 心管中； A-4、加30 mL生理鹽水至上述轉移出來的淋巴細胞中，吹打混勻，60-100g室溫離心 10分鐘，重復洗滌淋巴細胞，去除上清，加入完全培養基重懸細胞； A-5、計數調整密度為5*105細胞/ml，預先處理過的12孔板中每孔加入1ml細胞;將培養 板放置于37°C、5% (體積比)CO2的培養箱培養48小時； B、 慢病毒感染 B-I、收集步驟A所得PBMC，室溫300g離心4min，調整密度為5*105細胞/ml，新的12孔板 中每孔加入1ml細胞，實驗組加入7.5ul EGFR二代CAR的慢病毒，病毒滴度為2*108/mL，M0I = 3;對照組加入7.5ul對照病毒，病毒滴度亦為2*108/mL，M0I=3，每孔加入TRANS B感染試劑； B-2、將細胞培養板置于37°C，5% (體積比)CO2培養箱培養； B-3、培養第三天每孔加入1ml新鮮的培養基，繼續培養；。
[0015] B-4、培養第七天計數計算擴增倍數； C、 表型和分型檢測 C-1、計數每個細胞取出1.0 xlO6個，lOOOrpm，離心3min，加入IOOul FACS buffer重 懸細胞，加入 15ul APC anti-human CD8、15ul PE anti-human CD4、15ul PerCY5.5 anti-human CD3; C_2、4°C避光孵育30min，1000rpm，離心3min，去掉上清加入FACS buffer再洗兩遍； C-3、加入150ul FACS buffer重懸細胞，FACS檢測熒光;確定所制備細胞GFP的表達，然 后利用BD Accure C6 software對數據進行處理分析，即可確定T細胞的感染率，完成嵌合 抗原受體T細胞的制備。
[0016] 采用上述技術方案所產生的有益效果在于:本發明的方法制備的嵌合抗原受體T 細胞具有特定的食管癌相關功能活性，對食管癌的治療具有重要的潛在和實際價值，為食 管癌的治療提供一個新的技術方向。
【附圖說明】
[0017] 圖1為二代和三代的CAR結構示意圖。
[0018] 圖2顯示CART細胞(即嵌合抗原受體T細胞)的制備流程。
[0019] 圖3顯示CART-EGFR及CART-對照組的GFP表達結果。
[0020] 圖4顯示CART-EGFR細胞分群。
[0021] 圖5顯示CART-對照組細胞分群。
[0022]圖6顯示流式細胞儀檢測細胞EGFR表達的結果。
[0023] 圖7顯示CART-EGFR及CART-對照組細胞分泌結果。
[0024] 圖8顯示CART-EGFR、CART-對照組對靶細胞及非靶細胞的殺傷作用。
[0025] 圖9顯示CART-EGFR、CART-對照組GFP細胞檢測結果。
【具體實施方式】
[0026]以下實施例詳細說明了本發明。本發明所使用的各種原料及各項設備均為常規市 售產品，均能夠通過市場購買直接獲得。
[0027] 實施例1、CAR-EGFR的設計與構建 1- 1、CAR的設計說明。經統計，目前臨床實驗中使用最多的CAR結構包括二代和三代CAR (參見附圖1)，在有關的臨床報道中，二代CAR報道較多，其中尤其以賓夕法尼亞大學主導的 CAR結構療效顯著(NCT01626495，NCT01029366)，因此我們采用了此二代CAR框結構。
[0028] 1-2、CAR的結構及構建。CAR-EGFR序列包括如下幾個部分：CD8-pre，EGFR- scFv， CD8鉸鏈+跨膜，4-lBB(CD137)，CD3G。其完整序列參見SEQ ID N0:1。
[0029] 1-3、CAR對照組的結構及構建。CAR-對照組序列結構包括:CD8-pre，EGFR- scFv， □)8-Δ〇)3ζ。其完整序列參見SEQ ID N0:2。
[0030] 實施例2、CAR-EGFR修飾的T細胞(CART-EGFR)的制備與表型驗證 2- 1、CART-EGFR及CART-對照組的制備。CART-EGFR及CART-對照組制備流程如附圖2所 示。具體包括如下內容： 2_1_1、實驗試劑和實驗儀器： 實驗試劑包括： FicolI-Paque PLUS(GE，cat#17-1440_02) 完全培養基TexMACS (Miltenyi Biotechnolog，cat#170-076-309)+IL-2 (Miltenyi Biotechnolog，cat#l30-097-748) PerCP5·5 anti-human CD3(BD，cat#552852) PE anti-human CD4(BD，cat#555347) APC anti-human CD8(BD，cat#555369) FACS buffer:PBS+2.5%FBS TRANS B〇
[0031] 實驗儀器包括： 離心機:湘儀L550 流式細胞儀:m) C6 C02培養箱:ESCO MC0-20AIC 細胞計數儀:Cellometer Auto 1000。
[0032] 2-1-2、PBMC分離：將新鮮血液轉移到50 mL離心管中。用生理鹽水按照1:1(體積 比）進行稀釋，輕輕上下吹打3-5次混勻。將6 mL Ficoll加入到15 mL離心管中，豎直放置 到水平臺面上靜置備用。將稀釋好的血液(總體積8 mL)用移液管緩慢均勻加入到豎直放置 在臺面的含Ficoll溶液的離心管中。將加好血液與Ficoll的離心管輕輕轉移至離心機中。 在轉移離心管過程盡量減少晃動，保持離心管豎直，以避免打破液面分層。室溫400g離心30 分鐘。離心結束后，輕輕轉移離心管至超凈臺中。用移液器吸取中間的白膜層（即淋巴細胞 層)轉移至新的50 mL離心管中。盡量避免吸取到下層或上層的細胞，避免造成污染。加入30 mL生理鹽水至上述轉移出來的淋巴細胞中，輕輕吹打混勻，60-100g室溫離心10分鐘。 重復洗滌淋巴細胞，去除上清，加入一定量的完全培養基重懸細胞。計數調整密度為5*10 5 細胞/ml，預先處理過的12孔板中每孔加入lml。將培養板放置于37° C，5%C02培養箱培養48 小時。
[0033] 2-1-3、慢病毒感染:收集上述PBMC，室溫300g離心4min，調整密度為5*105細胞/ ml，新的12孔板中每孔加入1ml細胞，實驗組加入7.5ul EGFR二代CAR的慢病毒(慢病毒的制 備是比較常規化的技術，可以自行制備或提供本發明的基因序列交由上海吉凱基因化學技 術有限公司制備）；病毒滴度為2*10 8/mL，M0I=3;對照組加入7.5ul對照病毒，病毒滴度為2* 108/mL，M0I=3,每孔加入一定的TRANS B感染試劑(TRANS B感染試劑購自上海吉凱基因化 學技術有限公司，其用量依據產品說明書確定）。將細胞培養板置于37° C，5%C02培養箱培 養。第三天每孔加入1ml新鮮的培養基，繼續培養。第七天計數計算擴增倍數。
[0034] 本次制備，初始PBMC細胞量均為1E+6，第七天時實驗組PBMC細胞量為2.50E+07，其 中97.9%為⑶3 +T細胞，見圖2，細胞擴增倍數約為25倍;對照組PBMC細胞量為1.77E+07，細 胞擴增倍數約為17倍，見表1。
[0035] 表1 CART-EGFR及CART-對照組細胞增殖
2-2、CART-EGFR表型檢測。實驗目的：確定CART-EGFR及CART-對照組的感染效率。實驗 設計:流式細胞儀檢測所制備細胞GFP的表達。計數每個細胞取出1.0 XlO6個，lOOOrpm，離 心3min，加入IOOul FACS buffer 重懸細胞，加入 15ul APC anti-human CD8、15ul PE anti-human CD4、15ul PerCY5.5 anti-human 003。4。〇避光孵育30min，1000rpm，離心 3min，去掉上清加入FACS buffer再洗兩遍。加入150ul FACS buffer重懸細胞，FACS檢測 焚光。用I3D Accure C6 software對數據進行處理分析。實驗結果及分析：CART-EGFR及 CART-對照組GFP表達結果如圖3。如圖3所示，CART-EGFR感染效率約為56.1%，CART-對照組 感染效率約為19.3%。
[0036] 2-3、CART的細胞分群檢測。實驗目的：確定CART-EGFR的細胞中T細胞的亞群分布 特征。實驗設計:流式細胞儀檢測所制備細胞表面標志物，檢測標的及意義如下表2所示。 [0037] 表2 T細胞亞群分布
實驗結果及分析:CART-EGFR及CART-對照組細胞分群檢測結果如圖4、5。由上述結果可 知，所制備的CART-EGFR細胞分群如表3;所制備的CART-對照組細胞分群如表4。
[0038] 表3 CART-EGFR細胞亞群分布比例
實施例3、CART-EGFR的功能驗證--靶細胞的驗證 實驗目的:檢測靶細胞和非靶細胞上EGFR的表達。實驗設計:使用EGFR的流式抗體對靶 細胞(Ecal09)及對照細胞(MCF7)進行檢測。實驗結果與分析：流式細胞儀檢測Ecal09及 MCF7 EGFR表達結果如圖6，結果顯示陰性對照MCF7中EGFR表達較低，但靶細胞Eca 109中 EGFR高表達。
[0039 ] 實施例4、CART-EGFR的體外功能驗證--細胞因子分泌實驗。
[0040] 實驗目的:通過檢測CART-EGFR細胞與靶細胞共同孵育后，細胞因子分泌是否有上 升判斷CART是否有功能。實驗設計:分別對比CART-EGFR、CART-對照組與靶細胞和非靶細胞 共同孵育后，培養基上清中細胞因子的分泌情況。試劑包括:Human TH1/TH2 cytokine CBA 1^七（80，〇3邙550749)。細胞（〇61111116)包括：]\?^7(]\^(1111111:01^]\1+10°/^85)$〇厶109 (Medium:DMEM+10%FBS)。儀器包括:離心機:湘儀L550;流式細胞儀:BD C6。實驗方法包括： 4-1、細胞因子分泌:收集靶細胞，用稀釋緩沖液將細胞洗滌一次，1000 rpm 3min離心， 棄上清，以含2% FBS的1640重懸細胞，計數，最終將細胞稀釋到1*106個/ml濃度;收集CART 細胞(效應細胞），用稀釋緩沖液將細胞洗滌一次，1000 rpm 3min離心，棄上清，2% FBS的 1640重懸細胞，計數，最終將細胞稀釋到1*106個/ml濃度;將IOOul靶細胞和IOOul CART細 胞1:1混合加入96孔板中，37°C、5%C〇2共同培養20-24小時；1000 rpm 5min離心，收集上清檢 測細胞因子。
[0041] 4-2、細胞因子檢測:準備15ml離心管，在瓶蓋上標注1，將標準品轉移至EP管內，并 向其中加入標準品稀釋液2ml，輕柔顛倒混勻，室溫防止15min-20min平衡。取9支1.5ml EP 管，并向每管中加入300ul標準品稀釋液，瓶蓋上標注編號2-9,在1管中取300ul至2管內混 勻；在2管內取出300ul至3管內，依次類推進行2倍梯度稀釋，另取一支1.5ml EP管，加入 300ul標準品稀釋液作為陰性對照。確定好需要檢測的細胞因子及樣品個數。取出待檢測的 細胞因子捕獲珠子瓶，用力混勻。每種珠子取出（待檢測樣品數+標準品數+陰性對照數)* IOul的捕獲珠子量。并將每種珠子進行渦輪震蕩混勻。用標準品稀釋液對樣品進行稀釋(稀 釋倍數可自行決定，如1:10、1:100等)取N個1.5ml EP管(N=樣品數+標準品數+對照數）向 每管(標準品、樣品、陰性對照）中加入50ul混合珠子;并向各管中加入相應待測試劑(標準 品、樣品、對照）50ul以及PE Detection Reagent 50ul，充分混合后，避光室溫孵育3小時。 向每管中加入1ml wash buffer，輕柔吹勾后200g離心5分鐘。小心吸去上清，并向每管中加 入300ul wash buffer，并重懸沉淀。將樣品進行流式細胞儀檢測。用BD的FCAP Array v3軟 件對數據進行處理分析。
[0042] 4-3、實驗結果與分析:本次實驗分別檢測了 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-γ的分泌，其中IL-4和TNF-a分泌水平較低，變化不明顯，結果如圖7所示，CART-EGFR在存在 靶細胞時，細胞因子的分泌高于CART-對照組，結果顯示CART-EGFR具有一定的功能活性。 [0043]實施例5、CART-EGFR的體外功能驗證--細胞殺傷能力檢測。
[0044] 實驗目的：檢測CART-EGFR及CART-對照組的殺傷能力。實驗設計:通過LDH釋放實 驗，判斷CART細胞對靶細胞的特異殺傷。實驗結果與分析:CART-EGFR和CART-對照組對靶細 胞及非靶細胞的裂解效應如圖8。與CART-對照組相比，CART-EGFR對靶細胞具有一定殺傷活 性，在CART-EGFR:靶細胞比例為20:1共培養4hr后，靶細胞裂解率為40.42%。
[0045] 實施例6、存在靶細胞時CART-EGFR的增殖實驗 實驗目的：檢測CART-EGFR及CART-對照組在靶細胞存在時的增殖作用。實驗設計： CART-EGFR及CART-對照組與靶細胞比例為2:1，共同培養48小時，流式細胞儀檢測帶有GFP 細胞的增殖。實驗結果與分析:CART-EGFR和CART-對照組細胞增殖結果如圖9,在靶細胞存 在條件下，CART-EGFR及CART-對照組增殖不明顯。
[0046] 由上述試驗例可知，利用本發明的抗原受體基因制備的嵌合抗原受體T細胞CART-EGFR相比CART-對照組展現出了一定的功能活性，本發明的基因針對食管癌的治療具有重 要的潛在和實際價值。
[0047] 上述描述僅作為本發明可實施的技術方案提出，不作為對其技術方案本身的單一 限制條件。
【主權項】
1. 一種嵌合抗原受體T細胞，其特征在于:該嵌合抗原受體T細胞以淋巴T細胞為宿主， 在淋巴Τ細胞的核基因組中通過核轉染整合有SEQ ID NO: 1所示的基因。2. 根據權利要求所述的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于:所述嵌合抗原受體T細胞以 淋巴T細胞為宿主，在淋巴T細胞的表面含有SEQ ID NO: 1所示基因表達的抗原受體。3. 權利要求1所述嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于:首先將SEQ ID NO: 1所 示的基因轉入非病毒載體，然后通過核轉染技術將上述基因整合到淋巴T細胞的核基因組 中，使得上述基因在淋巴T細胞表面表達，將非特異性的淋巴細胞定向改造為能夠識別并對 腫瘤細胞進行靶向殺傷的特異性嵌合抗原受體T細胞。4. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于:其制備步驟包括： A、 PBMC分離 A-1、將新鮮血液轉移到50 mL離心管中，用生理鹽水按照體積比1:1進行稀釋，上下吹 打3-5次混勻，將6 mL Ficoll溶液加入到15 mL離心管中，豎直放置到水平臺面上靜置備 用;將稀釋好的血液8 mL用移液管緩慢均勻加入上述含Ficoll溶液的離心管中； A-2、將加好血液與Fico 11溶液的離心管輕輕轉移至離心機中，在轉移離心管過程中要 減少晃動，保持離心管豎直，以避免打破液面分層，室溫400g離心30分鐘； A-3、離心結束后，輕輕轉移離心管至超凈臺中，用移液器吸取中間的白膜層即淋巴細 胞層，吸取操作中避免吸取到下層或上層的細胞，避免造成污染，然后轉移至新的50 mL離 心管中； A-4、加30 mL生理鹽水至上述轉移出來的淋巴細胞中，吹打混勻，60-100g室溫離心 10分鐘，重復洗滌淋巴細胞，去除上清，加入完全培養基重懸細胞； A-5、計數調整密度為5*105細胞/ml，12孔板中每孔加入lml細胞;將培養板放置于37 °C、 5%體積比的CO2的培養箱培養48小時； B、 慢病毒感染 B-1、收集步驟A所得PBMC，室溫300g離心4min，調整密度為5* 105細胞/ml，新的12孔板 中每孔加入lml細胞，實驗組加入7.5ul EGFR二代CAR的慢病毒，病毒滴度為2*108/mL，M0I = 3;對照組加入7.5ul對照病毒，病毒滴度亦為2*108/mL，M0I=3，每孔加入TRANS B感染試劑； B-2、將細胞培養板置于37°C，5%體積比的C02培養箱培養； B-3、培養第三天每孔加入lml新鮮的培養基，繼續培養； B-4、培養第七天計數計算擴增倍數； C、 表型和分型檢測 C-1、計數每個細胞取出1.0 xlO6個，lOOOrpm，離心3min，加入100ul FACS buffer重懸 細胞，加入 15ul APC anti-human CD8、15ul PE anti-human CD4、15ul PerCY5.5 anti-human CD3； C_2、4°C避光孵育30min，1000rpm，離心3min，去掉上清加入FACS buffer再洗兩遍； C-3、加入150ul FACS buffer重懸細胞，FACS檢測熒光;確定所制備細胞GFP的表達，然 后利用BD Accure C6 software對數據進行處理分析，即可確定T細胞的感染率，完成嵌合 抗原受體T細胞的制備。
【文檔編號】C12N15/62GK105861531SQ201610251247
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月21日
【發明人】汪治宇
【申請人】汪治宇