一種胞內高溫木聚糖酶基因及其蛋白表達與應用
【專利摘要】本發明屬于生物工程及工業酶制劑領域，涉及一種胞內高溫木聚糖酶基因xyn10B及其蛋白Xyn10B的表達與應用。高溫木聚糖酶基因xyn10B來源于熱解纖維素果汁桿菌(Caldicellulosiruptor kronotskyensis)。Xyn10B具有反應溫度高、熱穩定性好等優點，其最適反應溫度與pH分別為70℃和6.0。在65℃熱處理6h后仍能維持100％的酶活力。Xyn10B能直接作用于天然底物，與商業纖維素酶協同作用能明顯提高天然木質纖維素生物質的降解率。Xyn10B作為新型酶制劑可廣泛應用于飼料、食品和能源等領域，具有潛在的工業應用價值。
【專利說明】
一種胞內高溫木聚糖酶基因及其蛋白表達與應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物工程及生物質利用領域，具體地，本發明涉及了一種胞內高溫木 聚糖酶基因及其蛋白的表達及應用。
【背景技術】：
[0002] 木質纖維素是地球上最豐富的生物質，由于其成本低廉被認為是生物燃料生產的 一項重要資源。木質纖維原料主要由木質素、纖維素和半纖維素組成。其中，半纖維素的完 全降解需要多種半纖維素水解酶的參與而共同完成。木聚糖酶作為主要的半纖維素酶，能 夠隨機水解半纖維素主要組分一一木聚糖主鏈上的β-1，4-糖苷鍵產生木糖和寡聚糖。嗜 熱木聚糖酶與其它嗜中溫酶相比，在生物質的降解上具有更明顯的優勢：高溫酶可以儲存 在室溫下且不會失活；被微生物污染的風險顯著降低；減少運輸成本，減少在冷卻過程中 產物的流失；增加生物質煉制的靈活性。目前，商業應用的木聚糖酶需具有高的比活力、高 耐熱性、寬范圍的pH值適應性和廣泛的底物特異性。因此找到一個在極端的工業環境下可 以水解生物質的高穩定性和高酶活的木聚糖酶具有十分重要的意義。
[0003] 研究表明耐熱性的木聚糖酶多來自高溫厭氧細菌。已發現的厭氧型熱解纖維 素桿菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis能夠在45-82°C的環境下生長，其生長 最適溫度為70°C，并且能分解和利用纖維素、果膠、淀粉和木聚糖等（Margarita L et al.，2008)。C. kronotskyensis分泌的高溫木聚糖酶具有相當可觀的工業應用前景。然 而，該菌產生的木聚糖降解酶系組分復雜，分離純化困難，加之其生長條件苛刻，生長密 度低，不適合工業化大規模生產。因此采用基因工程技術將此類嗜熱微生物的重要糖苷 水解酶基因進行異源高效表達一直是研究的熱點。目前該菌株的測序工作已經完成，通 過基因功能預測發現其基因組中存在多種潛在的木聚糖酶基因，我們從中選擇了來源于 GHlO家族的木聚糖內切酶基因，以Escherichia coli BL21(DE3)為優選宿主菌構建了 C. kronotskyensis木聚糖酶基因 xynlOB重組工程菌，成功實現了木聚糖酶XynlOB的高效 異源表達。該木聚糖酶具有良好的熱穩定性，并且在高溫下擁有高效的酶活，可應用于工業 化生產。
【發明內容】
[0004] 發明目的：
[0005] 本發明的目的是提供一種高溫木聚糖酶基因 xynlOB及其重組載體和重組工程 菌，以及該種酶的表達方法和應用。其發明目的包括：
[0006] 1.提供一種能夠應用于工業的來源于熱解纖維素菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis的高溫木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0007] 2.提供上述高溫木聚糖酶的編碼基因，其基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008] 3.提供包含上述高溫木聚糖酶基因的重組載體，包括大腸桿菌表達載體、乳酸菌 表達載體、枯草桿菌表達載體、酵母菌表達載體、絲狀真菌表達載體等。將本發明的高溫木 聚糖酶基因與線性質粒片段連接獲得重組表達載體。重組表達質粒pET-28b-xynlOB作為 本發明的一個最優選的實施方案。
[0009] 4.提供包含上述高溫木聚糖酶基因的重組工程菌株，所述菌株為大腸桿菌（如 Escherichia coli BL 21 (DE3)、E.coli ToplO、E.coli Rosetta(DE3)等）、乳酸菌（如 Lactococcus Iactis 等）、酉孝母菌（如 Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae 等）、枯草桿菌（如 Bacillus subtilis BSl68 等）和絲狀真菌（如 Trichoderma reesei、 Aspergillus niger 等），優選為大腸桿菌 Ε· coli BL 21 (DE3)。
[0010] 5.提供一種制備上述高溫木聚糖酶的方法及其在酶解天然木聚糖和木質纖維素 原料上的應用。
[0011] 本發明的技術方案：
[0012] 為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案：
[0013] (1)上述高溫木聚糖酶基因 xynlOB工程菌的構建
[0014] ①提取熱解纖維素菌C. kronotskyensis的基因組，設計引物進行PCR擴增，得到 的木聚糖酶基因片段和載體用XhoI和NdeI進行雙酶切，連接轉化到宿主細胞中，篩選陽性 克隆測序，獲得重組表達載體。所述表達載體，是指大腸桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、枯 草桿菌表達載體、酵母菌表達載體、絲狀真菌表達載體等，優選為將本發明提供的木聚糖酶 基因 xynlOB與線性質粒pET_28b相連接，得到重組表達質粒pET-28b_xynlOB。
[0015] ②提取重組質粒，轉化宿主細胞，獲得含有木聚糖酶基因 xynlOB重組菌。所述菌 株為大腸桿菌（如 E.coli BL 21(DE3)、E.coli ToplO、E.coli Rosetta(DE3)等）、乳酸菌 (如 L. Iactis 等）、酵母菌（如 P. pastoris、S. cerevisiae 等）、枯草桿菌（如 B. subtilis BS168等）和絲狀真菌（如T. reesei、A. niger等），優選為大腸桿菌E. coli BL 21 (DE3)。
[0016] (2)上述高溫木聚糖酶XynlOB的制備
[0017] ①將含有上述木聚糖酶基因 xynlOB的重組菌進行放大培養，并誘導表達。
[0018] ②收集菌體，通過超聲破碎、Ni-NAT親和層析以及凝膠分離層析對重組蛋白進行 分離純化。
[0019] ③利用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達和純化情況，并測定純化蛋白的濃度。
[0020] (3)上述高溫木聚糖酶XynlOB酶學性質測定
[0021] ①對木聚糖酶XynlOB進行最適pH、最適溫度及熱穩定性測定。
[0022] ②對木聚糖酶XynlOB進行特異性酶活測定。
[0023] (4)上述高溫木聚糖內切酶XynlOB在酶解天然木聚糖和木質纖維素原料上的應 用
[0024] 稱取一定量預處理天然木聚糖和木質纖維素原料，加入一定量的重組木聚糖酶 XynlOB酶液，于65°C、pH 6. 0條件下80rpm振蕩水解，每隔一段時間取樣，離心取上清液用 對羥基苯甲酸酰肼（p-hydroxybenzoic acid hydrazide，PHBAH)法測定還原糖含量，用薄 層層析法定性分析天然木聚糖和木質纖維素原料水解液的成分。
[0025] (5)上述高溫木聚糖內切酶XynlOB與纖維素酶在協同水解天然木聚糖和木質纖 維素原料上的應用。
[0026] 按以下實驗分組分別加入一定量的酶液至混有預處理的天然木聚糖和木質纖維 素原料的緩沖液中，對照組加入等量的緩沖液。將反應液混勻后于50°C、pH 5. 5條件下 SOrpm振蕩水解，每隔一段時間取樣，離心取上清液用高效液相色譜法定量分析所有實驗組 天然木聚糖和木質纖維素原料水解液的成分。
[0027] 表1實驗分組
【附圖說明】
[0029] 圖1 :Α·高溫木聚糖內切酶XynlOB凝膠層析圖譜；B. Superdex 200凝膠層析純化 后 XynlOB 的 SDS-PAGE 分析。
[0030] 圖2 :Α.不同pH對XynlOB活性的影響；Β.不同溫度對XynlOB活性的影響。
[0031] 圖3 :XynlOB的熱穩定性。
[0032] 圖4 :XynlOB與纖維素酶協同水解玉米芯產物分析。
[0033] 具體的實施方式
[0034] 實施例1 :高溫木聚糖酶XynlOB重組表達載體pET-28b-xynlOB及重組工程菌的 構建
[0035] 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取C. kronotskyensis細菌基因組，得到基因組 DNA，-20°C凍存備用。根據預測的木聚糖內切酶基因 xynlOB核苷酸序列，設計如下引物：
[0036] xynlOB-F:5'-GGAATTCCATATGAGCGAAGATTATTATG-3'
[0037] xynlOB-R:5'-CCGCTCGAGTAAAAAGTCAATTATTCTAAAAAATG-3'
[0038] 以基因組DNA為模板進行基因 PCR擴增，反應結束后將PCR產物進行瓊脂糖凝膠 電泳，目的條帶用DNA膠回收試劑盒回收。回收后的目的基因與質粒pET-28b用內切酶XhoI 和NdeI進行37°C雙酶切過夜處理。酶切產物用PCR產物回收試劑盒進行純化，酶切后的 xynlOB和pET-28b用T4 DNA Ligase 4°C連接處理12小時。取連接產物5μ1加入到冰浴 的100 μ I ToplO感受態細胞中，冰浴30min。然后42°C熱激60s，冰浴2min。加入200 μ 1 LB液體培養基，于37°C下200rpm培養1小時。將菌液全部涂布于含有50 μ g/ml卡那霉素 的LB平板上，于37°C培養12-16小時。挑選單菌落于450 μ 1含有50 μ g/ml卡那霉素的 LB液體培養基中，37°C培養4-6小時。進行菌液PCR，反應結束后取5 μ 1反應產物進行瓊 脂糖凝膠電泳檢測，確定陽性克隆。測序正確后用質粒小提試劑盒提取質粒，獲得重組表達 質粒 pET-28b_xynlOB。
[0039] 將重組表達質粒pET-28b-xynlOB轉化到大腸桿菌coli BL21 (DE3)感受態細 胞中，于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上37°C培養12-16h獲得單菌落。挑取5個單 菌落于5ml含有50 μ g/ml卡那霉素 LB液體培養基中培養過夜，用甘油保存菌種，獲得以 pET-28b為載體，以E. coli BL21 (DE3)為宿主菌構建的高溫木聚糖酶XynlOB工程菌。
[0040] 實施例2 :高溫木聚糖酶XynlOB在大腸桿菌中的表達
[0041 ] 重組菌株按照I %的接種量轉接到100mL含50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養基， 37°C 200rpm振蕩培養至0D600達到0. 6左右時，加入IPTG至終濃度0.1 mM，繼續振蕩培 養4-6小時。培養結束后4000rpm 15min離心收集菌體，加入3ml Binding Buffer (50mM Tris-HCl pH7.5,300mM NaCl)重懸菌體。用超聲破碎儀超聲破碎后，4°C 1000 Og離心30min 所得上清即為粗酶液。
[0042] 實施例3 :重組高溫木聚糖酶在畢赤酵母中的表達
[0043] 以C. kronotskyensis基因組為模板，設計引物擴增得到高溫木聚糖酶基因 xynlOB，連入載體pPIC9。連接產物轉化至大腸桿菌ToplO感受態細胞，涂板于含氨芐的低 鹽LB固體培養基上37°C過夜培養。確定陽性克隆，測序正確后提取質粒，獲得重組表達質 粒pPIC9-xynlOB。線性化的質粒載體電轉化進入畢赤酵母GSl 15感受態，在MD培養基平板 上30°C培養2-3d篩選陽性轉化子。提取陽性轉化子基因，進行PCR驗證，進一步確定陽性 轉換子。挑取單克隆接種至含100ml YH)的搖瓶中。在搖床中30°C，220rpm培養至0D600 =5。室溫下3000g離心5min收集細胞，用BMMY誘導培養基重懸細胞，放入搖床繼續培養。 每隔24h加入甲醇至終濃度為0.5%以繼續誘導，連續培養72h后測定誘導發酵液上清中木 聚糖酶活性。
[0044] 實施例4 :重組高溫木聚糖酶XynlOB的純化
[0045] 利用重組酶含有組氨酸標簽，用Ni-NAT親和層析對重組蛋白進行純化。用含有 500mM咪唑的Elution Buffer(50mM Tris-HCl pH 7. 5,300mM NaCl)洗脫與Ni-NAT結合的 重組蛋白并收集洗脫液。收集到的洗脫液加入處理過的透析袋，在檸檬酸緩沖液（PH6.0) 中透析24h去除咪唑和換緩沖液。將去除咪唑后的酶液進行葡聚糖凝膠層析，出現波峰時 收集蛋白，凝膠層析圖譜如圖IA所示。將分離得到的樣品放入透析袋，用聚乙二醇濃縮樣 品，用Bradford法在OD 595下測定蛋白濃度為0. 645mg/ml。取純化后的樣品5 μ 1加入20 μ 1 5Χ蛋白電泳上樣緩沖液，充分混勾后煮沸10min，13000rpm離心10min，取8 μ 1上清進行 SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達和純化情況。結果如圖IB所示，可看到單一的電泳帶， 蛋白分子量為39KDa。
[0046] 實施例5 :重組高溫木聚糖酶XynlOB酶學性質測定
[0047] 5. 1最適反應pH和最適反應溫度
[0048] 純化的重組高溫木聚糖酶XynlOB在不同pH下測定重組高溫木聚糖酶的活力，測 得最適pH為6. 0,且在5. 5-8. 0的反應條件下，其活力仍能達到最高酶活的60 %以上，如圖 2A所示。
[0049] 純化的重組木聚糖酶在不同溫度（40_100°C )下測定其水解木聚糖活力，測得最 適反應溫度為70°C，且在60-80°C的反應條件下，仍能達到最高酶活的85%以上，如圖2B所 不。
[0050] 5. 2熱穩定性
[0051] 重組酶XynlOB在65、70、75°C下，處理0、0· 5、1、2、3、4和6小時，然后在其最適反 應條件下用PHBAH法測定其剩余酶活。重組酶在65°C下孵育6小時能維持穩定，在70°C時 其半衰期為2h，在75°C時其半衰期為5min，結果如圖3所示。
[0052] 5. 3特異性酶活測定
[0053] 木聚糖酶活力單位定義：在特定條件下（最適反應溫度和pH)，每分鐘產生1 μ mol 木糖所需要的酶量為一個酶活力單位（U)。
[0054] 重組酶XynlOB在70°C、pH 6. 0的條件下，加入到70°C預熱5min的櫸木木聚糖或 燕麥木聚糖溶液中反應2min。用PHBAH法測定還原糖含量，計算XynlOB對不同底物的比活 力（表2)。 「00551 棄2 _異柿_法
L0057」 買施例6 :里組高溫木聚糖_ XynlOB ^^觶樺木木聚糖和低聚木糖
[0058] 取重組粗酶液，分別加入到50 μ 1含有1 %櫸木聚糖或2%低聚木糖的底物溶液 中，在65°C，pH 6.0條件下水解4h，水解產物進行薄層層析檢測。櫸木木聚糖水解產物主 要為木二糖、木四糖和少量的木糖。低聚木糖的最終水解產物主要為木二糖及少量的木糖。 [0059] 實施例7 :利用重組木聚糖酶XynlOB降解甘蔗渣木聚糖
[0060] 用堿抽提法從甘蔗渣中提取木聚糖，用pH 6. 0檸檬酸緩沖液配制甘蔗渣木聚糖 懸濁液，13000rpm離心10min，離心上清即為可溶性甘蔗渣木聚糖。加入一定量的重組高 溫木聚糖酶XynlOB，在pH 6.0、65°C條件下600rpm振蕩水解12h。反應結束后將樣品煮沸 IOmin滅活，水解樣品13000rpm離心20min，上清液用PHBAH法測定還原糖含量，用薄層層 析法分析甘蔗渣木聚糖水解液中產物的成分。結果顯示，酶解12h后，酶解液主要成分為木 糖和木二糖。酶解產物木寡糖含量為87. 5 %，木二糖含量超過60 %，木糖含量為2. 1 %，木 聚糖降解率達到80. 0%。
[0061] 實施例8 :利用重組木聚糖酶XynlOB與商業纖維素酶協同水解玉米芯
[0062] 用粉碎機將玉米芯粉碎，玉米芯渣用自來水反復沖洗直至浸出液體變為無色。然 后用蒸餾水沖洗3次，放入干燥箱烘干。實驗組1加入2 μ g重組木聚糖酶粗酶液；實驗組2 加入終濃度150 μ g/ml的商業纖維素酶Cellic CTec2 (諾維信）；實驗組3加入2 μ g重組 木聚糖酶和終濃度150 μ g/ml的Cellic CTec2 ;實驗組4加入終濃度150 μ g/ml的商業纖 維素酶（蘇柯漢）；實驗組5加入2 μ g重組木聚糖酶和終濃度150 μ g/ml的纖維素酶（蘇 柯漢）。將所有樣品置于80°C下振蕩酶解48h后分別抽取反應液，離心取上清液用PHBAH 法測定還原糖含量，用高效液相色譜法分析玉米芯水解液中單糖的成分。結果顯示，重組木 聚糖酶XynlOB與Cellic CTec2協同水解玉米芯效果最好。如圖4所示，酶解48h后，實驗 組3水解液中葡萄糖產量增加32. 8% ;葡萄糖產量增加58. 0%。
【主權項】
1. 一種高溫木聚糖酶基因 xynlOB，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；來 源于熱解纖維素果汁桿菌（Caldicellulosiruptor kronotskyensis)。2. 權利要求1所述的高溫木聚糖酶基因表達的高溫木聚糖酶XynlOB，其特征在于：其 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. 權利要求2所述的高溫木聚糖酶XynlOB，其氨基酸序列SEQ ID NO: 2中的氨基酸經 過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質。4. 一種用于擴增如權利要求1所述的高溫木聚糖酶基因 xynlOB的方法，其特征在于： 所使用引物對為： xynlOB-F:5'-GGAATTCCATATGAGCGAAGATTATTATG-3' xynlOB-R:5' ~CCGCTCGAGTAAAAAGTCAATTATTCTAAAAAATG~3, 〇5. -種高溫木聚糖酶重組載體和重組工程菌，其特征在于含有權利要求1所述的 木聚糖酶基因 xynlOB ;所述高溫木聚糖內切酶基因的重組表達載體，是指大腸桿菌表達 載體、乳酸菌表達載體、枯草桿菌表達載體、酵母菌表達載體、絲狀真菌表達載體等；所述 重組工程菌株為大腸桿菌（如 Escherichia coli BL 21 (DE3)、E.coli ToplO、E.coli Rosetta(DE3)等）、乳酸菌（如 Lactococcus lactis 等）、酵母菌（如 Pichia pastoris、 Saccharomyces cerevisiae 等）、枯草桿菌（如 Bacillus subtilis BS168 等）和絲狀真 菌（如 Trichoderma reesei、Aspergillus niger 等）。6. -種制備高溫木聚糖酶的方法，其特征在于： 1) 用權利要求5所述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株； 2) 培養權利要求5所述的重組工程菌，誘導高溫木聚糖酶表達； 3) 回收和純化所表達的高溫木聚糖酶XynlOB。7. 權利要求2所述的高溫木聚糖酶在酶解天然木聚糖和木質纖維素原料上的應用，其 酶解的最佳溫度和pH分別為70°C和6. 0,并且能在65°C孵育6小時內維持穩定。8. 權利要求2所述的高溫木聚糖酶與其他半纖維素酶或纖維素酶在天然木聚糖和木 質纖維素原料上的協同應用，天然木聚糖和木質纖維素原料酶解效果提高10-60%。
【文檔編號】C12N15/56GK105861527SQ201510035909
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月23日
【發明人】韓業君, 喬瑋博, 賈曉靜
【申請人】中國科學院過程工程研究所