一種水稻胚乳不表達啟動子safes2及其分離方法與應用
【專利摘要】本發明提供了一種水稻胚乳不表達啟動子SAFES2及其分離方法與應用。本發明的發明人發現、提取并鑒定了日本晴水稻中一段具有轉錄調控活性的DNA序列，命名為啟動子SAFES2或SAFES2。該啟動子的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.1中所示序列或為該序列的同源衍生物。本發明利用作物雙元表達載體pCAMBIA1391，將啟動子SAFES2構建于GUS報告基因上游，構建重組表達載體，通過農桿菌介導轉化水稻愈傷組織再生水稻植株，GUS染色實驗證實該啟動子是胚乳不表達啟動子。采用本發明的啟動子與具有提高植株生長特性的基因配合使用，可以在提高植株根、莖、葉等軀干部位性狀的同時，避免對植株胚乳部分帶來任何不良影響，具有顯著的應用價值和遠期前景。
【專利說明】
一種水稻胚乳不表達啟動子SAFES2及其分離方法與應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術和作物基因工程技術領域。具體而言，本發明涉及一種水稻 胚乳不表達啟動子SAFES2及其應用。
【背景技術】
[0002] 在植物轉基因系統中，被導入的外源基因需要借助植物細胞的轉錄翻譯和修飾體 系，產生有活性的目標蛋白，使目的基因發揮作用，實現作物的遺傳改良。精確控制目的基 因產物生成的時間、位置或數量，對提高目標基因表達的針對性和時效性非常重要，也是提 高轉基因植物風險防控能力的重要方面。在植物基因工程中，通過啟動子直接控制目標基 因的轉錄，是調控目的基因表達最為經濟有效的手段，也是控制表達風險的可行路徑。因 此，充分了解不同類型植物啟動子的功能和特點，對構建合適的轉基因表達系統是非常重 要的。
[0003]組織特異型啟動子又稱為器官特異型啟動子，僅在特定的組織器官或細胞類型中 具有驅動能力。在基因工程中限定了目的基因的作用范圍，避免了組成型啟動子在非必要 組織中泛式表達造成的物質能量浪費，特別適于有組織針對性的遺傳改良和生物反應器的 應用。已發現的組織特異型啟動子主要包括:種子特異型啟動子、果實特異型啟動子、葉肉 細胞特異型啟動子、根特異型啟動子。已經應用于水稻分子育種的一些組織特異型啟動子 包括:花藥特異啟動子BnBp 10 (Cheng等，1998 )，花藥特異型啟動子Po I (Peng等，2010 )，綠色 組織特異啟動子0srbcS(Ye等，2009)，葉片特異啟動子ZmPepc(Datta等，1998)，胚乳特異啟 動子Gtl(Beyer等，2002)，GluB4(He等，2011 )，根特異啟動子OsAntl(Shrawat等，2008)， OsRCcs (Jeong 等，2010)等等。
[0004] 但是，胚乳不表達啟動子的發明還鮮有報道。水稻的胚乳即可食用的精米部位，胚 乳不表達啟動子使外源基因只在非食用部分表達，保證食用部分不含有外源基因表達的產 物，降低其對人類健康帶來的潛在風險，是促進轉基因水稻的商業化進程的一條有效途徑。 目前需要大力開展功能基因組的研究，大量挖掘和分離具有實用價值的胚乳不表達啟動 子，消除公眾對轉基因水稻的偏見和顧慮，并利用胚乳不表達啟動子的特性，充分發揮轉基 因育種的優勢，培育出更多更好的新品種。
【發明內容】
[0005] 本發明的第一個目的是分離克隆一種水稻胚乳不表達啟動子SAFES2,利用該啟動 子一方面驅動目標基因在水稻植株中表達，改善其生產性能；另一方面在胚乳中不表達目 標基因，以此降低轉基因稻米的食用安全風險。
[0006] 本發明的第二個目的是提供啟動子SAFES2在培育轉基因作物中的應用。所涉及的 "作物"是指禾谷類作物，例如水稻、小麥、高粱、大麥、燕麥、黑麥等，優選為水稻。
[0007] 為了實現上述目的，一方面，本申請的發明人從日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分離克隆得到一段具有轉錄調控活性的DNA序列，命名為SAFES2或啟動 子SAFES2。啟動子SAFES2包含下述序列之一或者下述序列的互補序列之一：
[0008] (a)序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；
[0009] (b)在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中添加一個或多個核苷酸后所獲 得的核苷酸序列；
[0010] (c)與序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序 列；
[0011] (d)在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中取代一個或多個核苷酸后所獲 得的核苷酸序列；
[0012] (e)序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列缺失一個或多個核苷酸后所獲得的 核苷酸序列。
[0013] 優選地，所述水稻胚乳不表達啟動子SAFES2由序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序 列構成。
[0014] 需要說明的是：序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列，序列5'端的22bp，BP "gcggtaatag aaatgtggag gg"其為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列；序列3' 端的22bp，即"cactttaaac acataattaa cc"，其為獲得啟動子過程中使用的反向引物的留 存序列（該留存序列與反向引物的相應序列互補）。需要強調的是，本文中所提到的啟動子 既可以指上述整個DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。即便本領域技 術人員在本發明的基礎上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發明的保護范圍之 內。
[0015] 另一方面，本發明還提供一種包含上述水稻胚乳不表達啟動子SAFES2的表達盒。
[0016] 又一方面，本發明還提供一種重組表達載體，所述重組表達載體包含上述的水稻 胚乳不表達啟動子SAFES2。在所述重組表達載體中，所述水稻胚乳不表達啟動子SAFES2連 接于待表達的基因序列的上游，待表達基因可以為任何對水稻的生長特性具有改善能力的 基因，通過本發明的啟動子驅動該基因在胚乳以外的組織特異性地集中表達，從而實現改 善水稻生長性能而不影響胚乳生長性能的功能;優選地，所述待表達的基因為Gus基因。
[0017] 另一方面，本發明還提供一種利用所述的水稻胚乳不表達啟動子SAFES2獲得相應 宿主菌的方法，所述方法包括將所述的水稻胚乳不表達啟動子SAFES2、所述的表達盒或者 所述的重組表達載體，利用凍融法轉入根癌農桿菌。
[0018] 另一方面，本發明提供一種利用所述的水稻胚乳不表達啟動子SAFES2獲得相應轉 化子的方法，所述方法包括將上面所獲得的宿主菌通過農桿菌介導方法對目標細胞、愈傷 組織或植株進行轉化，獲得相應轉化子。其中，所述轉化子優選為轉基因細胞系、愈傷組織 或植株。
[0019] 再一方面，本發明提供上述水稻胚乳不表達啟動子SAFES2在培育轉基因作物中的 應用。所述應用包括：
[0020] A)、將所述的水稻胚乳不表達啟動子SAFES2連接于目的基因的上游；
[0021 ] B)、將含有所述水稻胚乳不表達啟動子SAFES2與目的基因的重組表達載體轉入到 根癌農桿菌中；
[0022] C)、利用轉入了所述重組表達載體的根癌農桿菌對目標植物愈傷組織進行農桿菌 轉化；
[0023] D)、利用轉化后的愈傷組織培育相應植株，在所述植株中，所述的水稻胚乳不表達 啟動子SAFES2能夠驅動目的基因表達，而在胚乳中不驅動目的基因表達。
[0024]此外，本發明提供一種所述水稻胚乳不表達啟動子SAFES2的分離方法，其特征在 于，所述方法包括：
[0025] 步驟(1)、根據所述水稻胚乳不表達啟動子SAFES2的序列設計擴增引物；
[0026] 步驟(2)、以水稻品種日本晴的DNA為模板，利用所述引物通過PCR擴增程序擴增所 述水稻胚乳不表達啟動子SAFES2;
[0027]步驟(3)、回收PCR擴增的目的片段，并將其連接到PGEM-T-Easy載體上；
[0028]步驟(4)、利用連接產物按照熱激法轉化大腸桿菌XL-Blue感受態細胞；
[0029]步驟(5)、對轉化產物進行PCR篩選，獲得陽性克隆，挑取單克隆搖菌液提質粒，用 相應限制性內切酶進行雙酶切驗證；
[0030]步驟(6)、將經過鑒定的陽性克隆進行測序，獲取測序正確的核苷酸序列，作為目 標序列。
[0031]綜上所述，本發明的發明人發現、提取并鑒定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)中一段具有轉錄調控活性的DNA序列，并將其命名為SAFES2(序列表中的 SEQ ID N〇:l)。具體而言，發明人發現該序列具有驅動基因在水稻植株中表達而不在胚乳 中表達的能力，提取出該序列并對上述能力進行了鑒定。發明人將該序列經酶切后連接到 作物雙元表達載體PCAMBIA1391上，獲得相應的重組質粒（即重組表達載體），利用該重組質 粒轉化根癌農桿菌菌株EHA105,然后用農桿菌介導的方法進行水稻的轉化，得到轉基因水 稻植株。對獲得的轉基因水稻進行組織化學檢測發現，GUS基因在根、莖、葉、葉鞘、胚及種皮 中具有較強活性，但在胚乳細胞中不表達。從而證明該序列具有驅動基因特異的在水稻植 株中表達而不在胚乳表達的活性。
[0032]技術效果
[0033]本發明所述的啟動子SAFES2可與作物雙元表達載體連接，用于取代組成型啟動 子。并且，該啟動子可以與所需的目標基因連接，構建重組表達載體，經轉化后，可在水稻植 株中表達而不在胚乳表達，即改善了水稻的生產性能，也保證了稻米的食用安全性，具有重 要的理論及實際意義。
【附圖說明】
[0034]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0035] 圖1為將SAFES2啟動子構建于pCAMBIA1391載體質粒中的示意圖，其中圖1中A為 PCAMBIA1391示意圖，B為pCAMBIA1391-SAFES2示意圖，其中示出了利用SAFES2啟動子驅動 位于其下游的⑶S基因表達；
[0036] 圖2為對本發明的啟動子進行酶切驗證的結果示意圖。
[0037] 圖3為根(a)、莖(b)、葉鞘(c)、葉(d)、種子(e)中⑶S染色結果。藍色為⑶S組織化學 染色，代表組織中有⑶S表達。標尺=2.5_
【具體實施方式】
[0038] 以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅 用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。
[0039] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的生 化試劑，載體耗材等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
[0040] 實施例1分離克隆啟動子SAFES2 [0041]步驟1、引物的設計
[0042] 根據NCBI中提供的水稻品種日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因組 序列，依據水稻SAFES2基因的序列設計擴增引物，并根據選用的載體及靶標基因的特點，設 計引物的酶切位點。
[0043] 本實施例中以水稻雙元表達載體pCAMBIA1391 (圖1中A部分，來自于CAMBIA，公開 使用載體，安徽省農業科學院農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心水稻組保存） 為例，靶標基因為Gus基因，具體設計的引物為:正向引物(SEQ ID No: 2)5 '端帶HindIII，酶 切位點(AAGCTT)，反向引物（SEQ ID No : 3)5 '端帶EcoRI，酶切位點（GAATTC)，引物序列如 下：
[0044] 正向引物:AAGCTTGCGGTAATAGAAATGTGGAGGG HindIII
[0045] 反向引物：GAATTCGGTTAATTATGTGITTAAAGTG EcoRI
[0046] 由深圳華大基因公司合成。
[0047]步驟2、啟動子SAFES2的分離克隆
[0048]以水稻品種日本晴DNA為模板，利用正向引物、反向引物擴增啟動子SAFES2,按常 規PCR體系，采用如下擴增程序：
[0049] 95 °C 預變性 5min; 95 °C 變性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 2min30s，35 個循環；最后 72°C 延伸 lOmin。
[0050] 回收PCR擴增的目的片段，將其連接到PGEM-T-Easy載體(購自Promega公司，按載 體說明書中的比例混合)上，按照熱激法轉化大腸桿菌XL-Blue感受態細胞后，經菌落PCR篩 選獲得陽性克隆，挑取單克隆搖菌液提質粒，用HindIII和EcoRI進行雙酶切驗證，目的片段 長度2018bp，如圖2所示。將經過鑒定的陽性克隆送交Invitrogen公司測序。驗證正確的克 隆即為所要獲得的啟動子SAFES2,其核酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0051 ]實施例2啟動子SAFES2的功能驗證及應用 [0052] 1.遺傳轉化載體的構建和農桿菌的轉化
[0053] 所用載體為作物雙元表達載體pCAMBIA1391，用HindIII和EcoRI進行雙酶切，回收 線性化處理的PCAMBIA1391。同時用HindIII和EcoRI對克隆得到的啟動子SAFES2進行酶切， 回收目的片段。將上述的PCAMBIA1391片段和SAFES2片段用T4DNA連接酶(購于TaKaRa公司） 進行連接，得到啟動子SAFES2與Gus基因融合的重組表達載體pCAMBIA1391-SAFES2(圖1B)， 利用凍融法將重組表達載體轉入根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽 省農業科學院農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心水稻組保存）。
[0054] 2啟動子SAFES2的功能驗證及應用
[0055]步驟1:農桿菌介導的水稻遺傳轉化
[0056] 成熟水稻種子去掉穎殼后，用70%酒精浸泡種子lmin，倒掉酒精。用含有I-Tween 20的50%次氯酸鈉(原液有效氯濃度大于4% )溶液浸泡種子40min(150r/min)。倒掉次氯酸 鈉，無菌水洗5遍至溶液澄清，無次氯酸鈉味道。無菌水浸泡種子過夜。用解剖刀沿種子的糊 粉層將胚剝下，將胚接種于愈傷誘導培養基上。30°C下暗培養11天后將愈傷與胚乳及胚芽 分離，將去芽的狀態良好、分裂旺盛的初級愈傷組織進行預培養3~5天后用于農桿菌轉化。 [0057]采用上述"作物表達載體的構建和農桿菌的轉化"過程中轉入了重組表達載體的 根癌農桿菌進行農桿菌介導的遺傳轉化，該遺傳轉化、轉化子篩選及轉基因植株再生等參 照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.) [J].Plant Cell Report，2012.D0I 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。獲得轉 基因再生植株。
[0058] 步驟2、⑶S組織化學染色
[0059] 參照 Jefferson(Jefferson RA 等人.GUS fusion:0-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.,1987,6: 3901-3907)等提出的方法，將從上面獲得的轉基因再生植株中分離的需要染色的組織浸入 染色液中，37°C保溫箱中放置24-36小時，加入無水乙醇浸泡直至完全脫色，在顯微鏡下拍 照記錄。結果見圖3(需要說明的是，鑒于專利文本中不接受彩色圖片，因此，本申請的發明 人將彩色的圖3修改為灰度圖像，但是，即便這樣，基于圖3中的顏色深淺度，也可以清晰地 分辨出各部位是否發生染色），圖中示出了根(a)、莖(b)、葉鞘(c)、葉(d)、種子(e)中GUS染 色結果，藍色為GUS組織化學染色，代表組織中有GUS表達。染色結果表明SAFES2啟動子在 根、莖、葉、葉鞘、胚及種皮中具有較強活性，能夠引導Gus基因表達，但在胚乳細胞中不表 達。
[0060] 因此，基于該染色結果可以明確判斷，本發明的胚乳不表達啟動子在胚乳中不表 達，而在胚乳之外的其他主要組織中表達。
[0061] 為了驗證實驗的可重復性，本發明進行了三次重復實驗，實驗結果均與上面實施 例類似，這里不再累述。
[0062] 雖然本發明以水稻為例進行描述，但是
【申請人】認為，本發明所獲得啟動子的應用 場景不限于水稻，本發明啟動子可以用于各種禾本科作物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高 梁或燕麥，優選為水稻。
[0063] 以上對本發明【具體實施方式】的描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本 發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求的范 圍。
【主權項】
1. 一種水稻胚乳不表達啟動子SAFES2,其特征在于，所述水稻胚乳不表達啟動子 SAFES2包含下述序列之一或者下述序列的互補序列之一： (a) 序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； (b) 在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中添加一個或多個核苷酸后所獲得的 核苷酸序列； (c) 在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中取代一個或多個核苷酸后所獲得的 核苷酸序列； (d) 序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列缺失一個或多個核苷酸后所獲得的核苷 酸序列； (e) 與序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列。2. 根據權利要求1所述的水稻胚乳不表達啟動子SAFES2，其特征在于，所述水稻胚乳不 表達啟動子SAFES2在胚乳部位不表達，在其他部位均有表達。3. -種表達盒，其特征在于，所述表達盒包含權利要求1所述的水稻胚乳不表達啟動子 SAFES2〇4. 一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含權利要求1所述的水稻胚乳 不表達啟動子或權利要求3所述表達盒;在所述重組表達載體中，所述水稻胚乳不表達啟動 子SAFES2連接于載體中待表達的基因序列的上游。5. 根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體為 PCAMBIA1391-SAFES2,其中pCAMBIA1391為作物雙元表達載體;所述待表達的基因為Gus基 因，或者所述待表達的基因是具有改善胚乳以外組織性狀功能的基因。6. -種利用權利要求1中所述的水稻胚乳不表達啟動子SAFES2獲得相應宿主菌的方 法，其特征在于，所述方法包括將權利要求1中所述的水稻胚乳不表達啟動子SAFES2、權利 要求3所述的表達盒或者權利要求4或5所述的重組表達載體，利用凍融法轉入根癌農桿菌。7. -種利用權利要求1中所述的水稻胚乳不表達啟動子SAFES2獲得相應轉化子的方 法，其特征在于，所述方法包括利用權利要求6所獲得的宿主菌通過農桿菌介導方法對目標 細胞、愈傷組織或植株進行轉化，獲得相應轉化子。8. -種根據權利要求1所述的水稻胚乳不表達啟動子SAFES2在培育轉基因作物中的應 用，其特征在于，所述應用包括:將權利要求1所述的水稻胚乳不表達啟動子SAFES2連接于 載體中待表達的基因序列上游，從而構建重組表達載體;將所述重組表達載體轉化到作物 細胞、組織或器官中進行培育，進而獲得相應轉基因植株，優選地，所述待表達的基因為改 良作物生長特性的結構基因、調芐基因或者結構基因的反義基因。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述應用用于改良作物生長特性，所述作 物為禾谷類作物:水稻、小麥、高粱、大麥、燕麥、黑麥等。10. -種權利要求1中所述的水稻胚乳不表達啟動子SAFES2的分離方法，其特征在于， 所述方法包括： 步驟(1 )、根據所述水稻胚乳不表達啟動子SAFES2的序列設計擴增引物； 步驟(2)、以水稻品種日本晴的DNA為模板，利用所述引物通過PCR擴增程序擴增所述水 稻胚乳不表達啟動子SAFES2; 步驟(3)、回收PCR擴增的目的片段，并將其連接到PGEM-T-Easy載體上； 步驟(4)、利用連接產物按照熱激法轉化大腸桿菌XL-Blue感受態細胞； 步驟(5)、對轉化產物進行PCR篩選，獲得陽性克隆，挑取單克隆搖菌液提質粒，用相應 限制性內切酶進行雙酶切驗證； 步驟(6)、將經過鑒定的陽性克隆進行測序，獲取測序正確的核苷酸序列，作為目標序 列。
【文檔編號】A01H5/00GK105861506SQ201610389751
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月31日
【發明人】李 浩, 楊劍波, 李莉, 魏鵬程, 李娟 , 楊亞春, 秦瑞英, 許蓉芳
【申請人】安徽省農業科學院水稻研究所