一套用于轉基因作物檢測的多核苷酸、方法和試劑盒的制作方法

一套用于轉基因作物檢測的多核苷酸、方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于轉基因作物檢測的多核苷酸、方法和試劑盒。具體地本發明中公開了可用作轉基因作物實時熒光PCR檢測標準分子的多核苷酸構建物pLW10及其配套引物探針的序列。本發明的質粒標準分子解決了轉基因作物實時熒光PCR檢測中標準物質缺乏的難題，保證轉基因作物實時熒光PCR方法檢測結果的可比性，為轉基因作物實時熒光PCR方法檢測提供了可靠質量控制方法。
【專利說明】
一套用于轉基因作物檢測的多核苷酸、方法和試劑盒
技術領域
[0001] 本發明涉及一套生物工程技術領域的質粒分子，具體涉及一套用于轉基因作物檢 測的多核苷酸、方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 轉基因技術將基因在不同物種之間轉移，改造生物的遺傳物質，使其在性狀、營養 品質、消費品質等方面向人類所需要的目標轉變，滿足人類的各種需求，例如提高產量、表 達特殊營養成分甚至獲得抗除草劑抗病毒或抗蟲害的能力。但是隨著轉基因作物在全世界 范圍內的廣泛種植，其食用安全和環境安全問題也引起了廣大消費者和各國政府及相關機 構人員的重視。轉基因產品標識已成為各國轉基因產品監管的重要部分。已有歐盟、日本、 韓國、澳大利亞、新西蘭等多個國家和地區出臺了對轉基因生物產品實施強制性標簽的制 度，規定了食品中轉基因成分含量的最低標識限量。我國2002年于1月5日頒布了《農業轉基 因生物標識管理辦法》，該管理辦法明確規定對轉基因生物的標識管理就是為了規范農業 轉基因生物的銷售行為，引導農業轉基因生物的生產和消費，保護消費者的知情權。因此， 針對不斷商品化的轉基因產品建立相應的定量檢測方法，對檢測過程進行嚴格的計量學考 察，提高轉基因檢測的量值溯源水平，建立完整的轉基因檢測量值溯源規范，保證轉基因檢 測結果的可靠、可比和通用性。
[0003] 轉基因檢測方法常通過檢測核酸來實現，其中實時熒光定量PCR是核酸檢測的主 要方法。實時熒光定量PCR作為一種相對定量方法，需要有準確量值的陽性標準物質制作標 準曲線，根據標準曲線給被測物賦值。陽性標準物質的量值準確可靠對定量工作有重要意 義，此外在以定性為目的的PCR檢測過程中，也需要用陽性標準物質進行方法質量控制和結 果確認。因此，研制轉基因質粒DNA標準物質，有助于轉基因產品檢測檢驗能力提升。
[0004] 目前，轉基因生物檢測的標準物質尤其是質粒DNA標準物質還很缺乏。現在國內的 轉基因作物標準物質種類少，而且傳統轉基因基體標準物質采用質量百分比量值作為關鍵 量值，基因組大小差異、DNA提取效率差異對熒光定量PCR檢測的拷貝數含量結果都有影響， 往往不確定度較大。例如玉米種子，胚是二倍體，而胚乳是三倍體。同樣是玉米，其不同品種 的基因組大小差異很大，單倍體基因組大小在2.45pg(2364Mb)到3.35pg(3233Mb)之間，因 此很難通過質量準確計算其拷貝數。而質粒DNA標準物質可以通過人工構建，使轉基因序列 和內標基因的拷貝數比例為1:1，計算簡單，增強了量值過程中的可溯源性和量值的可靠 性。質粒分子可以通過微生物進行大量培養，DNA易于擴增，所以可提供無限穩定量的標準 物質，并且純度較高;且操作容易，穩定性高。此外，對于加工食品和飼料中同時含有多個組 分，如玉米、大豆、馬鈴薯等組分或一個組分有多個不同品系的轉基因產品的檢測，檢測工 作就十分繁復。對這種多組分、多品系的轉基因產品檢測，使用單一的轉基因標準物質不僅 用量大，而且配制方法復雜，工作量大，還很容易出現漏檢的情況。研制包含多個通用轉基 因靶標的轉基因檢測通用質粒DNA標準分子才能滿足轉基因檢測實驗室對樣品中的多組 分、多品系轉基因成分的定量檢測需求。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一套適用于轉基因作物檢測的質粒標準分子及其應用。
[0006] 本發明的第一方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
[0007] 花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子基因序列、NOS終止子基因序列、新霉素磷酸轉移 酶基因 NPT Π 基因序列、和玄參花葉病毒FMV 35S啟動子基因序列。
[0008] 在另一優選例中，所述分離的多核苷酸還包括植物內標準基因18s rRNA編碼序 列。
[0009] 在另一優選例中，所述花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子基因序列如SEQ ID NO. 1所 不。
[0010] 在另一優選例中，所述NOS終止子基因序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011] 在另一優選例中，所述新霉素磷酸轉移酶基因 ΝΡΤΠ 基因序列如SEQ ID NO. 3所 不。
[0012] 在另一優選例中，所述玄參花葉病毒FMV 35S啟動子基因序列如SEQ ID NO.4所 不。
[0013] 在另一優選例中，所述植物內標準基因18s rRNA編碼序列如SEQ ID NO.5所示。
[0014]本發明的第二方面，提供了一種分離的DNA構建物，所述DNA構建物中包含本發明 第一方面所述的多核苷酸，以及任選的標簽序列、酶切序列、和/或載體序列。
[0015] 在另一優選例中，所述DNA構建物為線性DNA構建物或環狀DNA構建物。
[0016]在另一優選例中，所述DNA構建物為質粒。
[0017]在另一優選例中，所述的質粒或表達載體作為轉基因作物檢測的標準分子(質粒 標準分子）。
[0018]在另一優選例中，所述質粒或表達載體的骨架質粒選自下組：pcDNA3. 1( + )， pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK和pGEMo
[0019] 在另一優選例中，所述分離的DNA構建物如SEQ ID NO.6所示。
[0020] 本發明的第三方面，提供了一套試劑盒，所述試劑盒中包括本發明第一方面所述 的多核苷酸或者本發明第二方面所述的DNA構建物。
[0021] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括第一引物對，所述第一引物對特異性擴增 所述花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子基因序列。
[0022] 在另一優選例中，所述第一引物對序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
[0023]在另一優選例中，所述試劑盒中還包括第二引物對，所述第二引物對特異性擴增 所述NOS終止子基因序列。
[0024] 在另一優選例中，所述第二引物對序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO. 10所示。
[0025]在另一優選例中，所述試劑盒中還包括第三引物對，所述第三引物對特異性擴增 所述新霉素磷酸轉移酶基因 NPT Π 基因序列。
[0026] 在另一優選例中，所述第三引物對序列如SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12所示。
[0027]在另一優選例中，所述試劑盒中還包括第四引物對，所述第四引物對特異性擴增 所述玄參花葉病毒FMV 35S啟動子基因序列。
[0028] 在另一優選例中，所述第四引物對序列如SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14所示。
[0029] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括第五引物對，所述第五引物對特異性擴增 所述植物內標準基因18s rRNA編碼序列。
[0030] 在另一優選例中，所述第五引物對序列如SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示。
[0031] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的一個或多個探針序列：
[0032] 第一探針序列，所述第一探針序列如SEQ ID NO.: 17所示；
[0033] 第二探針序列，所述第二探針序列如SEQ ID NO.: 18所示；
[0034] 第三探針序列，所述第二探針序列如SEQ ID NO.: 19所示；
[0035] 第四探針序列，所述第四探針序列如SEQ ID NO. :20所示；
[0036] 第五探針序列，所述第五探針序列如SEQ ID NO.: 21所示。
[0037]本發明的第四方面，提供了如本發明第一方面所述的多核苷酸、本發明第二方面 所述的DNA構建物、或本發明第三方面所述的試劑盒的用途，其特征在于，用于轉基因植物 的檢測。
[0038]在另一優選例中，所述檢測為熒光定量PCR檢測。
[0039] 本發明的第五方面，提供了一種轉基因作物實時熒光定量PCR檢測方法，所采用的 標準物質是如本發明第一方面所述的多核苷酸或本發明第二方面所述的DNA構建物。
[0040] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0041 ] 圖1是18s rRNA擴增的標準曲線。
[0042] 圖2是CaMV35S基因擴增的標準曲線。
[0043]圖3是NOS基因擴增的標準曲線。
[0044] 圖4是NPTII基因擴增的標準曲線。
[0045] 圖5是FMV基因擴增的標準曲線。
[0046]圖6本發明質粒分子的結構不意圖。
【具體實施方式】
[0047] 本發明人通過廣泛而深入的研究，獲得一段能夠用于轉基因作物實時熒光PCR檢 測的多核苷酸序列以及與之相配合的引物對，實驗結果表明，采用合適的骨架質粒將所述 多核苷酸序列制備為標準質粒分子，并配合本發明的引物對進行實時熒光PCR檢測，具有極 佳的特異性和靈敏度，并且穩定性良好。
[0048] 本發明所要解決的技術問題是為了克服現有的轉基因作物實時熒光PCR檢測方法 中缺乏陽性標準品和陽性標準品配置的問題，提供了一套適用于轉基因作物實時熒光PCR 檢測的質粒標準分子以及該質粒標準分子的構建方法、定量方法和應用。
[0049]實時熒光PCR檢測轉基因作物的原理
[0050]采用實時熒光PCR技術可特異性擴增轉基因作物的外源基因序列，設計針對外源 基因的引物和兩端標記熒光的探針，擴增測試樣品DNA。實時熒光PCR可以通過檢測熒光信 號的增加來實時監測PCR產物。與此同時，用相同的引物、探針和條件擴增已知濃度的陽性 標準物質(或陽性標準分子）^CR方法中，陽性標準物質(或陽性標準分子)可以作為陽性對 照;實時熒光PCR中，陽性標準物質（或陽性標準分子)可以構建穩定的標準曲線，根據標準 曲線可分別計算出樣品中對應基因的絕對含量(拷貝數或濃度）。
[0051 ] 標準物質
[0052]標準物質是具有一套或多種足夠均勻和量值確定了的特性值，用以校準設備，評 價測量方法或給材料賦值的材料或物質。
[0053] 質粒標準分子
[0054]本發明中涉及檢測轉基因作物中外源基因的特異性序列并在此基礎上設計了一 種質粒標準分子，優選地為質粒pLWl 0。
[0055]在本發明的一個優選地實施方式中，所述質粒標準分至包含：
[0056] 花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子基因序列、NOS終止子基因序列、新霉素磷酸轉移 酶基因 NPT Π 基因序列、和玄參花葉病毒FMV 35S啟動子基因序列。
[0057]在另一個優選地實施方式中，所述分離的多核苷酸還包括植物內標準基因18s rRNA編碼序列。
[0058]在另一個優選地實施方式中，所述花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子基因序列如SEQ ID NO. 1所示： tggaaaa.gga aggtggGtGC tacaaatgce atcattgcga taaaggaaag gceatGgttg 6? aagatgcctc tg.GGg：a:G'agt ggteccaa.ag atggaGGGCG aGGca :cgagg ageategtgg 1,20 P η aaaaag.aag.a GgttcGaacc acgtcttcaa agc.a-ag.t-gga t.t.g.a-tgtgat. 'atGtcea.c.tg 1^X3 LUUOVJ acgta-aggg.a tgacg-Gacaa tc.cGacta.te ettcgca-aga cGGttcctGt. atataaggaa 2：40 gttcatttGa tttggagagg acaegctga 269 (,SE'O 'ID· MO·.：!,) ·.
[0060] 在另一個優選地實施方式中，所述NOS終止子基因序列如SEQ ID NO.2所示： gat.cgttC'sa .a,c；a.tt.tg'g.c.a a.t；aa'agtt,tc ttaagcitt^a atGCtgt.tgG cggtGttgcg 6.0: atgattatGa tataat.tt.c.t gttgaattac gttaageatg' ta.ataat.taa Catgtaatgo 12? 「 ? stgaG.gt.tst ttatgagatg g:g.ttttta-tg atta^-ag't.c：c .cgcaa.tta.t.'a ：cattta'a-ta.c： 1.80 LUU0I」 gegatag.aaa .a..c'a,aaa；tat.'a 守cgcgG'aa.ac ta^gataaat. :ta.t.cg：G'g.egG ggtg.tca-tct .24 0 atgttaetag· a-tcgat. 2:56 (S.E.Q ID. N0.-2：) 〇
[0062] 在另一個優選地實施方式中，所述新霉素磷酸轉移酶基因 ΝΡΤΠ 基因序列如SEQ ID NO .3所示： atggatggtg aaga.tgttca agctggatcg tttcgcatga .ttgaacaaga tgg：a.ttgca.c β：0' gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 12:Q atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 18Q gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 24Q tgg.Gtggcca cgacgggogt tccttgcgcH gctgtgctog acgttgtcac: tgaagcggga ,3 :0·0 agggactggo tgctat.tggg cga.agtg.G：c:g gggcaggatc tcctgtcatc: tcaccttgct .36Q ?cc.tcecaaga aa.gtatc,eat GatggGtcat qca..atccggc. ggctg.catae gcttgatcca 4.2Q
[0063] gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 48Q gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 5'4Q gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgactcat &0Q ggcgatgcct gc.ttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 6.6.Q tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1·20. gc.tgaagage ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 78..Q cc.cgattcge agcgeategc cttctatcgc c.ttc.ttgaeg agttcttctg a B31 (SEQ ID NO.3) I
[0064] 在另一個優選地實施方式中，所述玄參花葉病毒FMV 35S啟動子基因序列如SEQ ID NO .4所示： atLtagcagc attccagak t gggLtcaatc aacaaggLac gagccatatc act ttattca 60· aattggtatc gcGaaaacca agaa.ggaact cGcatcctca a a g-q: tt t g ta ：agg aag.a a 11 12.0
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[0066] fetcGtc.tagt acaagtgggg aacaaaataa Ggtggaaaag· ag.ctgtcetg aca:gcc.e.a.c.t .480 caG.taatgcg tat.gacgaa.c g.cagtgaega ccac.aaaa.ga at't 523： t:SE:Q:- 工D:艇 4) 〇
[0067] 在另一個優選地實施方式中，所述植物內標準基因18s rRNA編碼序列如SEQ ID NO. 5所示： I CGAi\CTGTGi\ AACTGCGMT GGCTCATTAA ATCAGTTATA GTTTGTTTGA 51 TGGTATCTAC TACTCGGATA ACCGTAGTAA TTCTAGAGCT AATACGTGCA 101 ACAAACCCCG ACTTCTGGAA GGGATGCATT TATTAGATAA AAGGT〇AA〇A 151 CAGGCTCTGC 〇TGTTG〇TTT GATGATTCAT GATAACTCGT CGGATCGCAC 201 GGCCTTTGTG CCGGCGACGC ATCATTCAAA TTTCTGCCCT AT〇AA〇TTTC L0068」 251 GATGGTAGGA TAGTGGCCTA CCATGGTGGT GACGGGTGAC GGAGAATTAG 301 GGTTCGATTC CGGAGAGGGA GCCTGAGAAA CGGCTACCAC ATCCAAGGAA 351 GGCAGCAGGC GCGCAAATTA CCCAATCCTG ACACGGGGAG GTAGTGACAA 401 TAAATAACAA TACCGGGCTC ATTGAGTCTG GTAATTGGAA TGAGTACAAT 45"! 'Ci/ffiATCCCT 'TAACG^. CS:EQ ID MO.. 5)
[0069] 在另一個優選地實施方式中，所述質粒標準分子的序列如SEQ ID NO.6所示： gae.ggatcgg gagatct.cce g.at.c：ecetat ggtgoactct .cagtaeaatc tgetct.gat.g 6?· ?ccgcat.agtt aagccagtat ctgetcectg cttgt.gtgtt ggaggt.cget. gagtagtge.g 120 cgagcaaaat ttaa.gctaca acaaggcaag gctfcga-ccga caattgcatg .aagaatctgc 180 11agggttag gcg11ttgeg ctg.ct.tcgcg atgta:cgg.gc csgatatacg cgttga.catt 2 40 gattattgac tagttattaa tagt-aatcaa tta-cg.gggtc aLtagttcat .agcccatata .3:0Q t gga-g 11 ccg eg t.t a c a t a a cttacggtaa atggc.ccgcc tggctgaecg cccaac.gac.c 360 c c eg c c .c a 11 ga eg t c a a t a atgacgta：tg ttccca ：ta.gt aacgecaata gggactttc.c 420 a：ttgs：cgtca atgggtggag tatttac.ggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 4.80 a't c a'ta t gc c aag ta eg c ec ec t a t tgacg t c a atgacgg taaatggecG gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 60Q tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 6·β0. actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 7.2Q aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 7.8Q gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 84Q ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 9OQ gtttaaactt aagcttatgg atggtgaaga tgttcaagct ggatcgtttc gcatgattga 9·β0. acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga IQ20 ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg 1(380 gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga 1140 ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt I2QO tgtcactgaa gcaggaagag actggctgct attgggcgaa gtgccggagc aggatctcct 1260
[0070] gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct -13-20 gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg 1380 agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca 1440 ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga 150:0 tct-cgt-cgtg ac.tgat-gg：cg atgcGtgct.t geegaatate： atggt-ggaaa. atggocgctt, 156:0 ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt 1620 ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct 168·0 11acggtatc. .gc.cgc.tGccg attcgcagcg catcgccttc： tatc.gGc.ttc ttgac^agtt, 1.7 4:0 ?ctt-ctgaatt tageagcatt CGagattggg ttcaatcaac： Saggtacgag- Gcata.t-ca.ct, 1.8 00 ttattcaaat tggtatcgcc aaaaccaaga aggaactccc atcctcaaag gtttgtaagg 1.860 aagaattctc agtccaaage ctcaacaagg tcagggtaca gagtctccaa accattagcc 1920 aaa.a.gGt:a.Ga ggagatcaat: gaag：aat：Gtt caatcaaagt. aaactactgt 'fGGagcacat 1980 goatcatggt Gagtaagttt cagaaaaaga catccacGga agaettaa-ag ttagtgggca 2040 t c 11 t：.g a a ag. t a a t c 11 g. t g a-aca'tcgagG ag-Gt：.ggettg tgggg'3.ccag acaaaaaagg 2100 a a t gg t g cag. aa 11 gt ta gg cgcacGtacG aaaag,G.a.tct. ttgcctttat tgcaaaagat 2160 a a a g ca gat t g c t g t a g t a g a-agt:ggggaa oaaaa taacg tggaa-aag'ag Gtgt'GG'tgaG· 2220 agcccactca ctaatgcgta tgacgaacgc agtgacgacc acaaaagaat Lttccctcta 2280 tataagaagg catttcattc ccatttgaag gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 2340 catcatizgGg. ata.aaggaa.a ggc.catcgtt gaagatigcct. ctgccga.cag tg.gtG.GG.aaa 2400 gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 2460 aagcaagtgg attgatgLga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat 252 0 ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga 2580 gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaag.a.ttga atGctgttgc Ggg-tG.tt：gcg 2640 atgattatGa- tataatttct gt-t.gaattac g.ttaagcatg- taataattaa :cat.gtaa七gc 27〇C1 atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac .2760 gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggLgtcatct 2820 atgttactag atcgataagc ttggtaccga gctcggatcc actagtccag tgtggtggaa 2880 ttctgcagat atccagcaca gtggcggccg Gtcgagtcta gagggGccgt ttaaacccgo 2340 cgactg L'^gu LLcUag LLgc udgcGtiLuLg LlgLI Lgcce. cLcccccg Ly 3-0Q.O ccttCGtfcga GCGtggaagg t gee ac t.c c：e a e t gt c c 111 cot a a t a a ：aa tgaggaaatt 30 60 gcatcgeatt gtctgagtag gtgtcattct .attctggggg gtggggtggg gcaggaGagG 312：Q aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 318:0: tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtstc cccacgcgcc ctgtagcggc 3240 goattaagGg Gggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgc.ts.cact. tgccagcgcc 3300 ctagcgcceg et.cet.ttcgc tttctt.ccct tcctt-t.ctcg Geacgttcgc cggcttt.cGC 33 60 ?ogt-caa-gctc- taaat.cgggg gCtcCcttta gggttc.cgat t.tagtgcttt. acggcacc.tc 342Q .gaccccaaaa aacttgatta g.ggtga.tggt tcacgtagtg gg：ecatcgec etgatagacg 3480 gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gt匕ccaaact 3540 ggaacaacac tcaacectat etcg.gtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt 3:60.0 t cggcc t a t.t g.g t ta aaa a： a tgag.ctgatt ta:acaaaa.at. tta.acgcg.aa ttaatt.ccgt 3.66(3 ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 3720 ?aaageatgea tctcaattag tcagcaacca ggtgtg-gaaa gtG.cecag.gc tccecagcag 37 80·· gcagaagtat gcaaagcatg eatetcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc· 3840 r.gr.r.r.a.tvr.ar. gr.r.nr.'tn'a^.t r.ngr.nr*ag.t.t r.r.gr.anat:nagr;r；r;r.'a：t. ggntgant.aa 3'^00 ttatqcaqag gccgaggccg G.Gtctgcctc tgagctattc. Gagaagtagt. 396.0. g.a.gg.agg.c.tt. tt.ttg：gag：gc. etaggctttt gcaaaaagct. c-CGgggc.gs.a. ctgtgaaaet 402.0· gegaat-gget. cattaaatca gttatagttt gtt.tga.tggt. atetactact. cggataac<sg. 4080 tagtaattct ：agagctaata cgtg.ca'acaa accccgactt ctggaaggga. +tgeatttatt 4140 -agstaaaa-gg· tca-acac-agg ctctgccfgt tgctttgatg attcatgata act：cgtcgga 4-20.0. tcgcacg-g-c-c tttgtgccgg Gg-acgcat'ca tt.csaatttc tgccctatca actttcgatg 4260 ?gtaggatagt g.gccta：cc：a.t g.gtg.gtgacg ggtgacggag aattagggtt ：cgattccgga 432.0 gaggga.gcct gagaaacggc taccacatcc aaggaaggca g-caggcg-cgc aaatraccca 4380 .atcctg-acac ggg.gagg.tag tgacaataaa taacaatacc gggc.tcat.tg .agtctggtaa 444.0. ttggaatgag tacaatctaa atcccttaac gacccgggag cttgtatatc cattttcgga 4500 tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt ogca'tga'ttg aacaaga-tg.g :st-tgc-ac.gca 45 60 ggt'tGtc：Ggrg： gc：gg11gg.gt ggag.agg:cta t.tcggcto：tg a.ctgggcaca 'G,cagacQ.Qtc 4-62? ：gge-1~.ga 1~.f:tg t gac：gr.c：gt gtt.er.ggctg te-sgftgasgg ggftgcr.cggf. tnttttt gtc.· 4680 aagaccg.acc tg：tccggtgc cdt:gaa;tg.aa ctg.cagq-ac.g a.ggcagcgeci gGtatcgtgg 47 4:0.
[0071] etggGGacga. Gggg-cgttGe ttgegeaget gtgctcgacg ttgtcaGtga. agcgggaagg 48〇0 gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct 4860 gccgagaaag- tatccatcat ggetgat-gea at-gc-ggc-ggc tg-eataeget tgatcegget .4.92..0 acctgcccaIv t.egacca：cca agcgaaacat cgcatcg.agc gagca-cgtac tcg.gatggaa 4980 g-ccg.gt.Gttg tcgavtcagg.a tgat.c.tggac ga.aga.gc.atc ag.gggG.tcgc： g'cca:gccga.a 5040 ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc 51Q0 gatgcctgcL tgccgaaLat catggtggaa aatggccgct Lttctggatt catcgactgt 516.0 ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt Lggctacccg tgatattgct 5220 gaagag：ct：tg： gegge.gaa.tg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat GgecgetGec 528：0 g：a,ttege：age- geateggett etategeett cttgacgag.t tc.ttctgag-c g.gga.ctctgg 534.0 .g.gttcg'aaa:t. .ga\?!cg.a.G-ca.a g.Gga-Ggc-c:ca acctgceate acga^att-tc· -g-attccaccg -54 00 ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc 5460 tccagcgcgci gciatctcatg ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt 5520 a.uaa.ug.g.uta caaataaagc aa.ta.gcatca ca.aatttca-c aaataaag.ca t.ttt.ttteac 55.80 tgcatt.etag： ttgtggtttg tceaaactea tcaatgtate tt.ateatgtc tgt；a.ta：Gcgt 564 0. cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 5700 atccgctcac aat tccacac a a c a t a c gag c c g-ga a gc a t a a a g t g t a a a g cc t ggg g tg 5:7 60 cetaatg^agt gagetaactc acatfeaattg egttgcgetc actgcGG.gGt. ttccagtcgg 5:820 gaaacctgtc c]tgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 5-88 0 gtattgggcg ctcttccgct: tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc -5.94Q ggcg.ag.Gggt atcag.cfc.ca.c teasaggegg taataegg-tt a.tccaGa.gaa t.ca'gggga.ta. 6Q0.0 scgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt saasaggccg 6C6.0. cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 6120 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa ·618.〇 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgccttLc .6240 tcGcttoggg' aagcgtggcg ctttcteata gctcacgc-tg t :aggtat:c：tG agttcggtgt .6300· aggtcgttc.g ctccaagetg g.g.GtgtgtgG acgaa-Gecce cgttcagccc gaccgctgcg 6:3 6.0 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 6420 cagcsgccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 6480 Ug a ag tgg tg. g：c c t a a eta c gg^ta^acta gaagaacagt atttggtatG. tgegGtGtgG 6540 tgaagccagt taccttegga aaaag.a.gttg gtagctattg atccggc.a.aa G:aa.a.c:cac:cg 66?0 ： ctggtagcg.g 1111111g11 tgcaagc+.a+gc agattaegeg cagaaaaaaa -ggatctcaag +66 6.0 aagatecttt. gatGtttt.ct acggggtctg acg.ctcagtg gaacgs-saac; tcacgttaag 672.0 ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 67 80 gaagtLttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 6840 taatcagtga ggcacc-tatc tcagcgatct gtctattteg ttcatGcata gttgcctgao 690?. tccGcgtcgt gtagataact aegatacggg. agggG.t.tacc: a.tG.tgg-ccc.c agtg.ctgcaa. 69 6.0 tgataccgcg agacccacgc tcaccggc tc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 7020 gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 7080 gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 714.0 Ltgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 7200 cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 7·2β :〇· tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 7320 cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 7380 Paa70I agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 744:0 LUU/Z」 cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 750:0' aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 75β :〇· aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 7:620 gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 7680 gastactcat aotcttoctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtGtca 7740 tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacst 7·8 0? ttc.Gocgaaa agtgccacct gacgtc- 7826 (SE〇· XD Ν0·.;6.) ·α
[0073] 在本發明的一個優選地實施方式中，本發明還提供了特異性擴增所述花椰菜花葉 病毒CaMV35S啟動子基因序列的引物對：
[0074] 正向引物:GGCTCCTACAAATGCCATCATT(SEQIDN0·7) ;和
[0075] 反向引物:GGCAGAGGCATCTTCAACGA(SEQ ID N0.8)。
[0076] 在本發明的一個優選地實施方式中，本發明還提供了特異性擴增所述NOS終止子 基因序列的引物對：
[0077] 正向引物:GATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAA(SEQIDN0·9) ;和
[0078] 反向引物：TTATCCTAGTTTGCGCGCTATATTT(SEQ ID N0.10)。
[0079] 在本發明的一個優選地實施方式中，本發明還提供了特異性擴增所述新霉素磷酸 轉移酶基因 NPT Π 基因序列：
[0080] 正向引物：TGCCGAATATCATGGTGGAA(SEQIDN0·11) ;和 [0081 ]反向引物：CGGCCACAGTCGATGAATC(SEQ ID N0.12)。
[0082] 在本發明的一個優選地實施方式中，本發明還提供了特異性擴增所述玄參花葉病 毒FMV 35S啟動子基因序列：
[0083] 正向引物：TCGAGCAGCTGGCTTGTG(SEQIDN0·13) ;和
[0084] 反向引物：CGCCTAACAATTCTGCACCAT(SEQ ID N0.14)。
[0085] 在本發明的一個優選地實施方式中，本發明還提供了特異性擴增所述植物內標準 基因18s rRNA編碼序列：
[0086] 正向引物：TGACGGAGAATTAGGGTTCGA(SEQIDN0·15) ;和
[0087] 反向引物：GGATGTGGTAGCCGTTTCTCA(SEQ ID N0.16)。
[0088] 在本發明的一個優選地實施方式中，本發明還提供了如下的探針序列：
[0089] 第一探針序列，特異性針對花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子基因序列：
[0090] CGATAAAGGAAAGGCC(SEQ ID NO.:17)；
[0091 ] 第二探針序列，特異性針對所述NOS終止子基因序列：
[0092] ACGCGATAGAAAAC(SEQ ID NO.:18)；
[0093] 第三探針序列，特異性針對所述新霉素磷酸轉移酶基因 ΝΡΤΠ 基因序列：
[0094] TGGCCGCTTTTCT(SEQ ID NO.:19)；
[0095] 第四探針序列，特異性針對所述玄參花葉病毒FMV 35S啟動子基因序列：
[0096] ACCAGACAAAAAAG(SEQ ID NO.:20)；
[0097] 第五探針序列，特異性針對所述植物內標準基因18s rRNA編碼序列：
[0098] TCCGGAGAGGGAGC(SEQ ID NO.:21)。
[0099] 本研究中設計的引物探針和模板分子的配套性好，相比SNT 1204-2003《植物及其 加工產品中轉基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法》中的引物探針對，PCR擴增效率可提高 10%-20%，從而引起檢測靈敏度的顯著提高，檢測限提高了5~10倍。如：采用本發明中 CaMV35S基因的引物探針可使CaMV35S基因的拷貝數含量檢測限提高了 10倍，提高至 13copies/yL〇
[0100] 本研究克服現有的轉基因作物核酸定量PCR檢測中陽性標準品缺乏和陽性標準品 配制的難題，提供一種轉基因作物通用的的質粒標準分子，可用于轉基因作物中轉基因成 分的定性及定量檢測。
[0101] 在本發明的一個具體的實施方式中，本發明提供了一種轉基因作物檢測通用質粒 分子，包含四個轉基因通用元件：花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子（269bp)、N0S終止子 (256bp)、新霉素磷酸轉移酶基因 NPTII(831bp)、玄參花葉病毒FMV 35S啟動子(523bp);以 及在真核生物植物中高度保守的內標準基因18s rRNA。
[0102] 在優選地實施方式中，在所述質粒分子中各轉基因通用元件和內標準基因的拷貝 數比例為1:1。
[0103] 本發明的質粒DNA分子中包含四個轉基因通用元件:花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動 子(269bp)、N0S終止子（256bp)、新霉素磷酸轉移酶基因 ΝΡΤΠ (831bp)、玄參花葉病毒FMV 35S啟動子(523bp)，涵蓋大部分現有轉基因作物的插入元件序列，因此可用于大部分轉基 因產品的定性檢測。選取的插入元件序列涵蓋現有轉基因檢測PCR方法的目標基因序列，因 此該陽性標準分子可與轉基因檢測實驗室中的已有引物探針或轉基因檢測試劑盒配套使 用，普適性廣。
[0104] 在質粒分子中轉基因插入元件和內標準基因的拷貝數比例固定為1:1，即按照GB 19495.5-2004《轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法》中轉基因成分含量計算方法，質粒 分子中的轉基因含量為100%，方便實際應用中轉基因含量百分比的計算。
[0105]表1質粒DNA標準分子的外源序列信息
[0107] 試劑盒
[0108] 本發明提供了一種檢測轉基因作物的試劑盒，所述試劑盒中包括：
[0109] 上述質粒標準分子。
[0110] 本發明提供的試劑盒中包含了特異性擴增該質粒標準分子中各轉基因通用元件 的引物對，能夠方便的進行PCR檢測，而且特異性強，靈敏度高，線性良好。
[0111] 本發明的主要優點在于：
[0112] (1)包含本發明多核苷酸序列的質粒標準分子具有均勻性強，穩定性高的優點，同 時本發明解決了轉基因作物檢測中標準物質缺乏的難題，保證轉基因作物檢測結果的可比 性，為轉基因作物PCR檢測提供質量控制；
[0113] (2)使用本發明的質粒標準分子配合本發明的引物對制備的產品，用于實時熒光 PCR檢測轉基因作物時，特異性強，靈敏度高，線性良好。
[0114] (3)本發明提供的試劑盒中包含了檢測轉基因作物的質粒標準分子(pLWIO質粒標 準分子），該質粒的轉基因含量為1〇〇%，采用拷貝數相比的計算方式，用此質粒做陽性標準 品，轉基因含量計算方便。質粒標準分子選取的四種插入元件序列涵蓋現有轉基因檢測PCR 方法的目標基因序列，可與轉基因檢測實驗室中的已有引物探針或轉基因檢測試劑盒配套 使用，普適性廣。
[0115] (4)本發明提供的探針和模板分子的配套性好，檢測靈敏度較高。
[0116] 下面結合具體實施例，進一步陳述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明詳細條件的實驗方法，通常按照常規條 件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。本發明實施例中所用的生物材料和試劑，如無特別說明，均可從市售渠道 獲得。
[0117] 實施例1質粒標準分子的構建
[0118] 根據本發明的轉基因作物通用質粒DNA標準物質的構建流程：
[0119] a.利用數據庫（比如Genbank、上海市轉基因生物安全性檢測評估共享服務平臺 http ://www. shgmo.org/welcome.htm)進行生物信息學分析，選取涵蓋現有轉基因元件檢 測方法的插入元件基因保守序列片段:花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子(269bp)、N0S終止子 (256bp)、新霉素磷酸轉移酶基因 NPT Π (831bp)、玄參花葉病毒FMV 35S啟動子(523bp)。
[0120] b.將處理后的序列按一定順序單拷貝連接起來，本實施例中連接順序為花椰菜花 葉病毒CaMV35S啟動子（269bp) - NOS終止子（256bp)-新霉素磷酸轉移酶基因 ΝΡΤΠ (831bp) -玄參花葉病毒FMV 35S啟動子(523bp)，人工合成序列(寶生物工程(大連)有限公 司），并將所得的全長基因克隆至質粒載體pcDNA3.1( + )(購自英濰捷基（上海）貿易有限公 司），構建獲得包含目的基因序列的質粒PLW09。
[0121 ] c.在genbank中搜索真核生物內標準基因18s rRNA編碼序列。
[0122] d.利用軟件Primer 5.0設計引物用于擴增真核生物植物內標準基因18s rRNA。各 引物的兩端加上分子克隆所需的酶切位點及保護堿基。具體的引物序列見表21CR反應體 系見表3，PCR反應步驟見表4。
[0123] 表2構建質粒DNA標準分子的PCR引物序列
[0130] e.將擴增片段通過分子克隆手段將PCR擴增序列插入到質粒載體pLW09中，得到既 包含轉基因通用元件序列，又包含植物內標準基因序列的質粒DNA標準分子pLWIO,轉基因 通用元件序列與植物內標準基因序列的拷貝數比例為1:1。
[0131] 具體基因序列的克隆步驟:分別用限制性內切酶Sam I消化擴增得到真核生物18s rRNA擴增片段與質粒pLW09，回收酶切后的PCR擴增序列及線性質粒pLW09，T4連接酶進行連 接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a，得到質粒標準物質pLWIO。
[0132] 表5酶切反應體系

[0137] 實施例2轉基因作物通用檢測質粒標準分子的應用
[0138] 本實施例提供了一種所述的轉基因作物通用檢測質粒標準分子、配套引物對和探 針在轉基因熒光PCR檢測法中的應用辦法，包括以下步驟：
[0139] 選用市場接受度較高的方法SNT 1204-2003《植物及其加工產品中轉基因成分實 時熒光PCR定性檢驗方法》（中國出入境檢驗檢疫行業標準）中的引物探針和PCR反應體系和 反應時間溫度程序作為轉基因檢測的標準方法，用實時熒光定量PCR法同時擴增外源轉基 因元件CaMV35S、FMV35S、NOS、NPTII和內源植物內標準基因擴增得到的Ct值相比。可在質粒 DNA分子的具體濃度未知的情況下，將質粒DNA分子梯度稀釋(至少5個濃度梯度），分別擴增 質粒DNA分子中的插入元件基因和內標準基因，制作標準曲線，橫坐標為核酸拷貝數含量梯 度稀釋濃度，縱坐標為熒光PCR中的Ct值。同時擴增待檢測轉基因樣品中的插入元件基因和 內標準基因，得出兩者的濃度含量(或稀釋梯度），轉基因樣品中插入元件基因和內標準基 因的含量比值即為轉基因含量的百分比。
[0140] 具體步驟如下：
[0141 ] a.梯度稀釋質粒DNA標準分子，濃度從IO6CopiesA1L~IOt3CopiesA 1L;
[0142] b.采用SNT 1204-2003《植物及其加工產品中轉基因成分實時熒光PCR定性檢驗方 法》中的實時熒光PCR反應程序，以梯度稀釋的質粒DNA標準物質為模板進行實時熒光PCR擴 增。每個反應重復三次，根據不同濃度模板擴增的Ct值與濃度之間的關系，建立標準曲線。
[0143] c.以各質粒DNA標準物質為模板建立的實時熒光PCR標準曲線見圖1~5:
[0144] 以各質粒DNA標準物質建立的標準曲線中相關系數均達到0.99，線性良好，3個平 行反應間和3次不同重復實驗間獲得的Ct值標準偏差基本都小于0.2,定量PCR反應的重復 性和重演性好，表明質粒DNA標準分子適合應用于實時熒光PCR檢測，可作為實時熒光PCR擴 增目前轉基因作物檢測常用的靶基因序列的陽性標準分子。
[0145] 討論：
[0146] 本發明的質粒標準分子中包含了四種轉基因通用元件，具有較廣的覆蓋度。由于 質粒載體的容量有限，需要對轉基因通用元件的長度進行選擇，而且還需要避免PCR過程中 不同轉基因通用元件間可能存在的干擾。通過大量實驗驗證，本發明最終選用的各個具體 的轉基因通用元件長度合理，互不干擾，能夠通過質粒進行大量擴增，制備簡單，而且在PCR 檢測中具有良好的重復性和重演性，對引物的適用性好。由于本發明的標準分子包含多個 轉基因通用元件，對于加工食品和飼料中同時含有多個組分或多個不同品系的轉基因產品 的檢測，可以僅需配制一次梯度稀釋的標準溶液就能檢測其轉基因含量，極大地降低了檢 測過程中的工作量。對于轉基因產品的定性檢測，只要產品中檢測出本質粒分子中插入元 件的1種，即可認為是轉基因產品，因此本發明的質粒分子適用范圍很廣。本發明的質粒分 子中各轉基因插入檢測元件和植物內標準基因的比例是1:1，這和國家標準中轉基因含量 采用拷貝數百分比的形式一樣，相較于普通的植物種子粉末標準物質采用質量比的方式， 用本發明中質粒標準分子做陽性標準品無需單位轉換，計算簡單。
[0147]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含： 花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子基因序列、NOS終止子基因序列、新霉素磷酸轉移酶基 因 ΝΡΤΠ 基因序列、和玄參花葉病毒FMV 35S啟動子基因序列;優選地，所述分離的多核苷酸 還包括植物內標準基因18s rRNA編碼序列。2. 如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子基 因序列如SEQ ID N0.1所示；和/或 所述NOS終止子基因序列如SEQ ID勵.2所示;和/或 所述新霉素磷酸轉移酶基因 ΝΡΤΠ 基因序列如SEQ ID NO.3所示;和/或 所述玄參花葉病毒FMV 35S啟動子基因序列如SEQ ID勵.4所示;和/或 所述植物內標準基因18s rRNA編碼序列如SEQ ID NO.5所示。3. -種分離的DNA構建物，其特征在于，所述DNA構建物中包含權利要求1所述的多核苷 酸，以及任選的標簽序列、酶切序列、和/或載體序列;優選地，所述DNA構建物為線性DNA構 建物或環狀DNA構建物。4. 如權利要求3所述的DNA構建物，其特征在于，所述質粒或表達載體的骨架質粒選自 下組：pcDNA3·l( + )，pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。5. 如權利要求3所述的DNA構建物，其特征在于，所述分離的DNA構建物具有SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列。6. -種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括權利要求1所述的多核苷酸或者權利要 求2所述的DNA構建物。7. 如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括第一引物對，所述第 一引物對特異性擴增所述花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子基因序列;和/或 所述試劑盒中還包括第二引物對，所述第二引物對特異性擴增所述N0S終止子基因序 列；和/或 所述試劑盒中還包括第三引物對，所述第三引物對特異性擴增所述新霉素磷酸轉移酶 基因 ΝΡΤΠ 基因序列；和/或 所述試劑盒中還包括第四引物對，所述第四引物對特異性擴增所述玄參花葉病毒FMV 35S啟動子基因序列；和/或 所述試劑盒中還包括第五引物對，所述第五引物對特異性擴增所述植物內標準基因 18s rRNA編碼序列。8. 如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括選自下組的一個或多 個探針序列： 第一探針序列，所述第一探針序列如SEQ ID NO. :17所示； 第二探針序列，所述第二探針序列如SEQ ID NO. :18所示； 第三探針序列，所述第二探針序列如SEQ ID NO. :19所示； 第四探針序列，所述第四探針序列如SEQ ID NO. :20所示； 第五探針序列，所述第五探針序列如SEQ ID NO. :21所示。9. 如權利要求1所述的多核苷酸、權利要求2所述的DNA構建物、或權利要求3所述的試 劑盒的用途，其特征在于，用于轉基因植物的檢測。10. 如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述檢測為熒光定量PCR檢測。
【文檔編號】C12N15/63GK105861500SQ201610455186
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】梁文, 劉剛, 許麗, 李妍, 聞艷麗, 李蘭英, 任淑貞
【申請人】上海市計量測試技術研究院