一種細胞凋亡高質量小片段dna的快速提取及評價方法
【專利摘要】本發明公開了一種細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法，包括用凋亡誘導物A進行凋亡誘導，進行驗證細胞凋亡；凋亡誘導物A誘導大量細胞凋亡后進行等分；一份離心后收集細胞沉淀加細胞裂解液，充分裂解細胞，測定樣品蛋白的濃度；經過100μg/ml蛋白酶K處理2小時，鹽濃度為200mM，在鎖相膠對水相和有機相隔離下，吸取鎖相膠上方的水相，乙醇沉淀凋亡小片段凋亡DNA；相同體積TE溶解沉淀，根據蛋白的濃度標準化小片段DNA在TE溶解后上樣體積從而確定上樣的量，電泳后，根據凋亡小片段亮弱確定細胞凋亡的多少。本發明操作方便，有利于保護操作人員，小片段DNA提取條帶亮、質量高，評價凋亡效果容易判斷。
【專利說明】
一種細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法
技術領域
[0001]本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法。
【背景技術】
[0002]細胞凋亡又稱之為細胞程序性死亡，是細胞自動發生的死亡過程，主要為應對細胞所遭受的一系列刺激或接受細胞信號轉導而發生一種適應性反應。細胞凋亡是由基因控制的自主有序的死亡，與壞死不同，它是一個主動過程(Mukhopadhyay S; 2014)。根據不同的細胞凋亡過程，細胞凋亡檢測當前主要有幾種方法，如細胞調亡形態學檢測、磷脂酰絲氨酸外翻檢測、DNA片段化檢測、TUNEL法、Caspase-3活性檢測、細胞流式檢測Gl期細胞等方法。凋亡細胞形態學檢測。根據在細胞凋亡過程中，細胞形態發生改變進行檢測的方法。目前主要通過光學顯微鏡、電子顯微鏡及流式細胞儀下的細胞形態結構的觀察進行檢測，目前是鑒定細胞凋亡比較簡單常用的方法。
[0003]細胞發生凋亡后，細胞染色質濃縮，靠近核膜核邊有皺縮現象、核膜有破裂、染色質斷裂同時產生凋亡小體等經典的細胞形態變化。這些形態的變化，既可以在光鏡下能被觀察到，同時也可以被特定的燃料染色。總之，通過細胞形態的觀察，方法簡單易行，但主觀性較大，判斷標準不易掌握，同時難以定量。
[0004]磷脂酰絲氨酸外翻檢測。目前通常認為細胞膜的形態和性質改變是細胞凋亡發生的早期事件。細胞膜上的對稱性改變引起的磷脂酰絲氨酸(PS)暴露于細胞膜外所致，Annexin V是一種磷脂結合蛋白，對PS具有較高的親和性，可作為探針探測細胞膜表面PS的位置，同時高敏感，高特異。同時Annexin V還可以特異結合標記的異硫酸熒光素(FITC)，從而可檢測凋亡細胞。這種檢測方式要求在熒光顯微鏡下進行觀測，凋亡的細胞會在激發光的作用下，發出綠色熒光。而未凋亡的細胞由于細胞膜形態和性質未發生改變而不發綠色熒光。這種檢測方法省時，可靠，但需要用到熒光顯微鏡，并且熒光也易淬滅。
[0005]DNA小片段檢測。細胞凋亡時，由于內源性核酸內切酶被激活，遺傳物質DNA被切成規則的約180 — 200bp整數倍的寡核苷酸片段，提取細胞的DNA，然后進行電泳即可觀察到凋亡細胞呈現規則的DNA ladder，而未凋亡的細胞則沒有。這種方法，用DNA凝膠電泳即可進行檢測，簡單方便。但這種方法當前存在小片段DNA提取困難或提取效果差的問題。
[0006]基于細胞流式的凋亡細胞檢測方法。細胞流式分析法可對單個細胞或生物微粒進行快速定量分析和分選，是定量檢測細胞凋亡的重要方法之一。細胞凋亡所發生的形態和性質的改變是細胞流式進行凋亡檢測的基礎，比如細胞DNA發生斷裂，細胞周期發生阻滯、細胞膜和核膜皺縮等。這些形態的改變介于正常細胞和壞死細胞之間，通過染色技術，細胞流式儀可以解決如檢測細胞凋亡時由于小片段DNA的流失，使凋亡細胞的DNA含量低于正常細胞，從而導致DNA染色能力的下降;細胞流式中，常用碘化丙啶(Propidium 1dide，PI)作為染料。PI嵌入雙鏈DNA后被激發釋放紅色熒光，被細胞流式儀采集信號；凋亡細胞由于DNA，含量降低，PI信號會減弱，從而測定凋亡。但PI不能通過活細胞膜，但能穿過凋亡細胞的細胞膜，因此細胞流式檢測時需固定細胞和處理細胞。細胞流式可用于凋亡細胞的檢測，但細胞流式方法檢測細胞凋亡，因存在碘化丙啶是強致癌劑，比較危險，細胞流式儀比較昂貴等缺點。
[0007]在研究凋亡細胞的過程中發現，利用顯微鏡的觀測可以初步判斷細胞的凋亡，但具有主觀性，標準不易掌握；磷脂酰絲氨酸外翻檢測細胞凋亡雖然易于觀測但需要配置熒光顯微鏡，熒光還易淬滅，還可能存在假陽性及難于凋亡細胞的定量;細胞流式的方法雖然對定量比較準確，但需要用到碘化丙啶PI這種染料，同時對操作者有毒害并且需要細胞流式儀，對設備要求高，操作復雜，耗時較長。傳統總DNA提取的方法過程比較復雜，檢測凋亡小片段DNA比較困難或能提取微弱小片段DNA。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于提供一種細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法，旨在解決現有顯微鏡判斷凋亡細胞方法存在具有主觀性，標準不易掌握;Annexin V染色熒光顯微鏡觀察存在假陽性及難于凋亡細胞的定量;PI染色細胞流式方法對操作者有毒害，對設備要求高，操作復雜，耗時較長;總DNA的提取方法過程比較復雜，凋亡小片段DNA難于提取或提取效果不佳的問題。
[0009]本發明是這樣實現的:首先是凋亡誘導物A進行細胞凋亡誘導，確保細胞發生凋亡。其次收獲所有細胞后，進行等分;一份離心后收集細胞沉淀加細胞裂解液，充分裂解細胞，測定樣品蛋白濃度，根據等量總蛋白中內參基因的表達一致性作為參考來標準化等分后的另一份經提取后小片段DNA的上樣體積;一份經過lOOyg/ml蛋白酶K處理2小時，鹽濃度調整為200mM，在鎖相膠對水相和有機相隔離下，吸取鎖相膠上方的水相，乙醇沉淀凋亡小片段凋亡DNA;相同體積TE溶解沉淀，根據蛋白的濃度標準化小片段DNA在TE溶解后上樣體積從而確定上樣的量，瓊脂糖凝膠電泳，根據凋亡小片段DNA條帶的亮弱確定細胞凋亡的多少。
[0010]進一步，所述細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法以下步驟:
[0011 ]步驟一，癌癥細胞的培養及凋亡細胞的誘導，人結腸癌細胞株HCTl 16進行凋亡細胞的誘導，從而提取細胞小片段凋亡DNA，在Mycoy’5A培養基加10%FBS的培養基中，4mlMycoy ’ 5A培養基在6cm培養皿中，37 °C，5 %的⑶2細胞培養箱中，以1:6的比例進行傳代培養;在細胞傳代后24小時，在不同的時間點依次在培養基中的添加250μΜ凋亡誘導物A進行凋亡誘導，每次加藥間隔12小時；
[0012]步驟二，凋亡細胞的顯微鏡光鏡觀察和鑒定，在光鏡下進行觀察和確定，細胞在藥物A的處理下，逐漸變圓，細胞核皺縮，并逐漸脫離貼壁的狀態，漂浮于培養基中，初步判斷細胞發生凋亡；
[0013]步驟三，凋亡細胞的形態學分子鑒定，進行了分子Annexin V染色鑒定，根據公司說明書進行了Annexin V-FITC結合實驗，等量的細胞被培養在6孔板中，貼壁24小時后開始用500μΜ的凋亡誘導物A對細胞進行處理，24小時后，移除培養基，用2ml PBS洗兩次，然后加入I XAnnexin V的結合緩沖液，然后用I XAnnexin V的結合緩沖液以1:10稀釋Annexin V-FITC染色液，室溫染色15min。染色后，細胞用結合緩沖液洗滌I次，再加入結合緩沖液在熒光顯微鏡下觀察拍照，顯示綠色熒光的細胞即為凋亡細胞，進一步從分子水平判斷細胞凋亡發生；
[0014]步驟四，凋亡細胞的PI染色，細胞流式的驗證，為了比較DNA小片段測定凋亡的效果，用細胞流式的方法進行定量驗證比較，35mm培養皿接種5 %的細胞密度，補充培養基到2ml，24小時后，加入凋亡誘導藥物A，濃度為250μΜ，誘導O小時、12小時、24小時和36小時；吸取培養基于15ml離心管中，加入lml PBS于35mm培養皿洗滌I次，洗滌液也轉移到離心管中；加入500μ1胰酶于培養皿中，用移液器小心吹打，至單個細胞，加入0.5mlMycoy ’ 5A培養基，終止反應;轉移35mm培養皿所有細胞于15ml離心管中。1500rpm，4 °C離心1min，去上清；加Alml PBS洗滌細胞沉淀I次;后加入200μ1 PBS重懸細胞;將在振蕩器上，逐滴加入-80°C預冷的甲醇5ml，邊震蕩邊滴加甲醇，-20 0C固定過夜。3000rpm離心5min ；移去全部甲醇，加ImlPBS重懸，加入20mg/ml RNAase至工作濃度為20yg/ml，37 °C溫育30min; 2yg/ml PI染色1min，錫箔紙避光；用I3BS或合適的緩沖液洗滌細胞兩次;重懸細胞于500ylPBS，細胞流式檢測凋亡細胞。細胞流式采用Cytek Flow Cytometry，每次最少20000個細胞被檢測，分析Sub-Gl期的細胞數量，此期的細胞數量為被認為是凋亡細胞，通過細胞流式結果判斷細胞凋亡的比例，從而進行定量；
[0015]步驟五，基因組總DNA提取方法檢測總DNA及凋亡小片段DNA，改進后的操作如下:HCTl 16細胞放入Mycoy ’ 5A培養基2ml在35mm的培養皿中進行培養，加入濃度為250mM/ml誘導試劑A 2μ1，使培養基中的凋亡誘導試劑A工作濃度為250μΜ/πι1;處理48小時，處理后收集細胞
[0016]步驟六，細胞小片段DNA提取改進后的步驟如下:接種等量細胞的35mm培養皿或6孔板，凋亡試劑A誘導后，收集細胞，將HCT116細胞放入培養基中進行培養24小時后，加入250mM誘導試劑A使細胞的工作液為250μΜ，處理48小時，將培養基全部吸取到15ml離心管中，立即添加500μ1預冷的I3BS溶液，用細胞刮痧將細胞刮掉，移液器轉移到15ml離心管中；再次用500μ1預冷的PBS溶液沖洗35mm培養皿，再次轉移培養皿中的PBS到15ml離心管1500rpm，4°C離心1min;丟掉上清，用4°C預冷的500μ1 PBS溫柔吹打重懸細胞。
[0017]進一步，所述步驟五具體步驟如下:
[0018]第一步、貼壁細胞加胰酶500μ1消化2min，加培養基lml，轉移細胞于15ml離心管，1500印111，4<€離心5111；[11離心收集，去上清；
[0019]第二步、細胞重懸于冰冷的500μ1 PBS，轉移細胞于1.5ml離心管；1500rpm，4°C離心5min收集;再加入冰冷的500μ1 PBS，溫柔重懸細胞，1500rpm，4°C離心5min ；
[0020]第三步、加入500μ1提取緩沖液，1mmoI/L Tris-HCl，0.lmol/LEDTA，0.5%SDS;重懸細胞，溫柔混勻。
[0021 ] 第四步、并加RNA酶20yg/ml，以便去除RNA;加入蛋白酶K，終濃度達到100yg/ml，混勻，55 °C水浴3h，使與組蛋白結合的小片段DNA更多釋放；
[0022]第五步、將管內溶液轉移到1.5ml鎖相膠離心管；
[0023]第六步、加入等體積的酚氯仿異戊醇，體積比為25:24:1,上下顛倒混勻但勿震蕩；12000g離心1min，吸取上層水相于新的1.5ml鎖相膠離心管，再加入等體積的氯仿，異戊醇混合物抽提一次，1200(^離心101^11收集水相；
[0024]第七步、轉移上層水相于一干凈離心管中；加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉pH5.2與2倍體積-20 0C預冷無水乙醇，-20 0C 30min；
[0025]第八步、12000g/min，室溫離心5min.棄上清，洗滌沉淀兩次，每次用75%乙醇lml，
空氣干燥，至無乙醇味道；
[0026]第九步，將DNA溶于等體積的TE中，實驗中用的30μ1，測定DNA的濃度，上一定量的DNA電泳檢測。
[0027]進一步，所述步驟六具體步驟如下:
[0028]離心12000g lmin，進一步去除細胞核殘渣；
[0029]轉移上清到相鎖膠離心管中，加等體積的氯仿異戊醇，體積比25: 24:1，用手用力上下顛倒混勻，勿震蕩；
[0030]離心12000g5min，鎖相膠將形成一個間隔在水相和有機相之間；仍有少量的鎖相膠在管底，則可重復離心一次；
[0031 ]仔細地吸取鎖相膠上層的水相到另一干凈的鎖相膠離心管中；
[0032]加入等體積的氯仿異戊醇，體積比為24:1，上下顛倒混勻；12000g離心lOmin，吸取上層水相于新的離心管；
[0033]加2.5倍體積的無水乙醇于水相中，顛倒混勻，室溫沉淀3 O m i η，12 O O O g，離心1min;
[0034]洗滌沉淀兩次，每次用75%乙醇lml，空氣干燥，直至無乙醇味道；
[0035]重懸沉淀在同體積30μ1的TE ρΗ8.0中。
[0036]進一步，所述步驟六之后根據測得的蛋白濃度，取等量的蛋白如40yg，計算小片段DNA的體積，根據體積加入一定量的水至等體積;再加入6 X loading染料，與7部分所得的小片段DNA同時準備DNA電泳;制備1.0 %瓊脂糖凝膠，稱取0.3g瓊脂糖，量取30ml TAE溶液，煮沸，待溫度約50°C，加0.5μ1 gold view染料，將膠溶液到于制膠板中，待凝固；凝固后，取出放入電泳槽中，加新鮮電泳液，40mM Tris-Cl pH8.0，20mM acetic acid,and ImM EDTA，電泳電壓約120v，將7部分和改進后所得小片段DNA同時進行電泳20min，在B1Doc-1T圖像采集系統下成像，分析結果。
[0037]本發明的另一目的在于提供一種細胞凋亡的檢測方法，包含所述的細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法。
[0038]本發明的另一目的在于提供一種檢測基因對凋亡藥物的誘導反應方法，包含所述的細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法。
[0039]本發明提供的方法:1、提高了小片段DNA的提取質量(如圖6，泳道4)。通過添加高濃度的蛋白酶K(100yg/ml)和應用相鎖膠使提取出的小片段的DNA條帶更清晰明亮，圖6中泳道4比其它泳道的條帶都清楚和明亮，證明小片段DNA的提取質量高。2、使操作更加方便，節省了提取的時間。常規基因組DNA提取在吸取上清的時候很難把握，而加入了鎖相膠后，吸取上清非常方便。如果與細胞流式的方法比較則更方便，細胞流式需要進行乙醇固定過夜，非常麻煩且花費的時間長。小片段DNA提取過程包括電泳時間大約5小時，方便且時間短；3、接觸有毒有害的步驟少，有利于保護操作人員。僅在抽提去除蛋白時用到了酚氯仿，還被鎖相膠的封在了膠下面，其余步驟均為無毒無害的步驟。4、成本低，檢測不需特殊設備，有利于推廣應用。熒光顯微鏡方法觀察凋亡，需要高成本的熒光顯微鏡，還不準確;細胞流式方法會用到昂貴的細胞流式儀。根據改進后的結果比較，本發明具有方便、節約時間、有利于保護操作人員、不需特殊檢測設備、小片段DNA提取質量高、評價凋亡效果容易判斷等特點。
【附圖說明】
[0040]圖1是本發明實施例提供的細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法流程圖。
[0041]圖2是本發明實施例提供的HCT116細胞，未加入誘導凋亡試劑A，作為對照細胞示意圖。
[0042]圖3是本發明實施例提供的HCT116細胞，加入凋亡誘導物誘導A濃度為250μΜ，處理24小時示意圖。
[0043]圖4是本發明實施例提供的用AnnexinV染色經過細胞凋亡誘導物Α，濃度500μΜ處理24小時示意圖；
[0044]上排左為光鏡下對照，上排右為光鏡下凋亡誘導物A，濃度500μΜ處理24小時。下排左為焚光顯微鏡下Annexin V染色對照；下排右為焚光顯微鏡下，凋亡誘導物Α，濃度500μΜ處理24小時Annexin V染色結果。
[0045]圖5是本發明實施例提供的用HCT116細胞，用凋亡誘導物Α，濃度為250μΜ，處理0、12、24、48小時，細胞流式的結果示意圖；
[0046]從圖可知細胞凋亡從0.57增加到了 16.97%，證明凋亡誘導試劑A能顯著誘導細胞凋亡。
[0047]圖6是本發明實施例提供的用凋亡誘導物Α，濃度為250μΜ，不處理和處理48小時，提取總DNA不意圖；
[0048]圖中:I為凋亡誘導試劑A處理48小時，常規基因組總DNA的提取;2為未應用鎖相膠提取效果；3為未用凋亡誘導試劑處理48小時的對照;4為lOOyg/ml蛋白酶K，應用鎖相膠提取效果。
[0049]圖7是本發明實施例提供的凋亡小片段DNA的提取及檢測示意圖；
[0050]圖中:I為未用凋亡藥物A處理的小片段基因組提取;2為處理48小時后，未應用100yg/ml蛋白酶K和鎖相膠的提取效果;3為應用了 100yg/ml蛋白酶K和鎖相膠的提取效果。[0051 ]圖8是本發明實施例提供的HCT116細胞，用凋亡誘導物A，濃度為250μΜ，處理時間為O小時、24小時、36小時和48小時，提取小片段DNA應用了蛋白酶K處理3小時和鎖相膠的凋亡檢測結果示意圖。
【具體實施方式】
[0052]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0053]下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。
[0054]如圖1所示，本發明實施例的細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法包括以下步驟:
[0055]SlOl:癌癥細胞的培養及凋亡細胞的誘導，人結腸癌細胞株HCTl 16進行凋亡細胞的誘導，從而提取細胞小片段凋亡DNA，在Mycoy’5A培養基加10%?83的培養基中，41111Mycoy ’ 5A培養基在6cm培養皿中，37 °C，5 %的⑶2細胞培養箱中，以1:6的比例進行傳代培養;在細胞傳代后24小時，在不同的時間點依次在培養基中的添加250μΜ凋亡誘導物A進行凋亡誘導，每次加藥間隔12小時；
[0056]S102:凋亡細胞的顯微鏡光鏡觀察和鑒定，在光鏡下進行觀察和確定，細胞在藥物A的處理下，逐漸變圓，細胞核皺縮，并逐漸脫離貼壁的狀態，漂浮于培養基中，初步判斷細胞發生凋亡；
[0057]S103:凋亡細胞的形態學分子鑒定，進行了分子Annexin V染色鑒定，進一步從分子水平判斷細胞凋亡發生；
[0058]S104:凋亡細胞的PI染色，細胞流式的驗證，為了比較DNA小片段測定凋亡的效果，用細胞流式的方法進行定量驗證比較，通過細胞流式結果判斷細胞凋亡的比例，從而進行定量；
[0059]S105:基因組總DNA提取方法檢測總DNA及凋亡小片段DNA，改進后的操作如下:HCTl 16細胞放入Mycoy ’ 5Α培養基2ml在35mm的培養皿中進行培養，加入濃度為250mM/ml誘導試劑A 2μ1，使培養基中的凋亡誘導試劑A工作濃度為250μΜ/πι1;處理48小時，處理后收集細胞；
[0060]S106:接種等量細胞的35mm培養皿或6孔板，凋亡試劑A誘導后，收集細胞，將HCTl 16細胞放入培養基中進行培養24小時后，加入250mM誘導試劑A使細胞的工作液為250μΜ，處理48小時，將培養基全部吸取到15ml離心管中，立即添加500μ1預冷的PBS溶液，用細胞刮痧將細胞刮掉，移液器轉移到15ml離心管中；再次用500μ1預冷的PBS溶液沖洗35mm培養皿，再次轉移培養皿中的PBS到15ml離心管1500rpm，4°C離心1min;丟掉上清，用4°C預冷的500μ1 PBS溫柔吹打重懸細胞。
[0061 ] S107:吸取到冰上預冷的干凈1.5ml離心管中。再次離心去掉細胞中殘余的培養基，收集細胞完成;將收集的細胞加入預冷的300μ1 PBS，Iml移液槍溫柔重懸分成兩等份，一份離心后去上清，添加細胞裂解液50μ1提取蛋白，并測定濃度；一份離心后添加150μ1卩83，使其總體積30(^1，重懸后加蛋白酶1(，使蛋白酶1(的終濃度為10(^8/1111，加入0.5%Triton，逐滴添加5M NaCl于溶液中，使終濃度為200mM NaCl，55°C溫育2小時，離心12000g，1min，轉移上清于干凈的1.5ml離心管中。
[0062]下面結合具體實施例對本發明的應用原理作進一步的描述。
[0063]I癌癥細胞的培養及凋亡細胞的誘導。
[0064]以人結腸癌細胞株HCT116為例，進行凋亡細胞的誘導，從而提取細胞小片段凋亡DNA。在Mycoy’5A培養基(購自HyClone公司)加10%?83(購自618(:0)的培養基中，41111Mycoy，5A培養基在6cm培養皿中，37 °C，5 %的⑶2細胞培養箱中，以1:6的比例進行傳代培養。在細胞傳代后24小時，在不同的時間點依次在培養基中的添加250μΜ凋亡誘導物A進行凋亡誘導，每次加藥間隔12小時(最早加藥點處理36h)，以便測試誘導物A的凋亡誘導效果和保證大規模的細胞凋亡。
[0065]2凋亡細胞的顯微鏡光鏡觀察和鑒定。
[0066]為了確定細胞是否發生了凋亡，在光鏡下進行觀察和確定(如圖2，圖3)，細胞在藥物A的處理下，逐漸變圓，細胞核皺縮，并逐漸脫離貼壁的狀態，漂浮于培養基中；這些光鏡下的觀察完全符合凋亡細胞的典型特征，初步判斷細胞發生凋亡。
[0067]3凋亡細胞的形態學分子鑒定。
[0068]為了確定藥物A誘導的細胞凋亡形態特征是否正在導致了細胞凋亡，進行分子Annexin V染色鑒定。根據公司說明書進行了Annexin V-FITC結合實驗。等量的細胞被培養在6孔板中，貼壁24小時后開始用500μΜ的凋亡誘導物A對細胞進行處理，24小時后，移除培養基，用2ml PBS洗兩次，然后加入I XAnnexin V的結合緩沖液，然后用I XAnnexin V的結合緩沖液以1:10稀釋Annexin V-FITC染色液，室溫染色15min。染色后，細胞用結合緩沖液洗滌I次，再加入結合緩沖液在熒光顯微鏡下觀察拍照。顯示綠色熒光的細胞即為凋亡細胞(如圖4)，進一步從分子水平判斷細胞凋亡發生。
[0069]4凋亡細胞的PI染色，細胞流式的驗證。
[0070]為了比較DNA小片段測定凋亡的效果，用細胞流式的方法進行定量驗證比較。35mm培養皿接種大約5%的細胞密度，補充培養基到2ml，24小時后，加入凋亡誘導藥物A，濃度為250μΜ，誘導O小時、12小時、24小時和36小時。吸取培養基于15ml離心管中，加入lml PBS于35mm培養皿洗滌I次，洗滌液也轉移到離心管中；加入500μ1胰酶于培養皿中，用移液器小心吹打，至單個細胞，加入0.5mlMycoy，5A培養基，終止反應。轉移35mm培養皿所有細胞于15ml離心管中。1500rpm，4°C離心lOmin，去上清；加入lml PBS洗滌細胞沉淀I次；后加入200μ1PBS重懸細胞;將在振蕩器上，逐滴加入-80°C預冷的甲醇5ml，邊震蕩邊滴加甲醇，-20 V固定過夜。3000rpm離心5min;移去全部甲醇，加lml PBS重懸，加入20mg/ml RNAase至工作濃度為20yg/ml，37°C溫育30min;2yg/ml PI染色lOmin，錫箔紙避光；用PBS或合適的緩沖液洗滌細胞兩次；重懸細胞于500ylPBS，細胞流式檢測凋亡細胞。細胞流式采用Cytek FlowCytometry，每次最少20000個細胞被檢測，分析Sub-Gl期的細胞數量，此期的細胞數量為被認為是凋亡細胞(Yi Tang，2008)，通過細胞流式結果判斷細胞凋亡的比例，從而進行定量，結果顯示細胞凋亡細胞的數量從沒有加凋亡誘導物A對照的0.57 %，到加凋亡誘導物A處理12小時的1.83 %，到處理24小時的8.33%,處理48小時的16.97 % (圖5)。從結果看誘導物A的處理導致了大量的細胞凋亡。
[0071]經過步驟1-4的處理和驗證，表明細胞確實發生了大量的凋亡，本發明對小片段DNA的提取方法進行了改進和驗證。凋亡小片段DNA的提取和分離目前主要分為兩種方法:通過全基因組DNA的提取方法和直接小片段DNA的提取方法。
[0072]5傳統的基因組總DNA提取方法檢測總DNA及凋亡小片段DNA。為了方便比較傳統方法和改進方法，簡化實驗，實驗重點考察了凋亡誘導物A處理的一個最長時間點。同時將提取結果進行了電泳。具體步驟如下:
[0073]HCTl 16細胞放入Mycoy，5A培養基2ml在35mm的培養皿中進行培養，加入濃度為250mM/ml誘導試劑A 2μ1，使培養基中的凋亡試劑A工作濃度為250μΜ/πι1;不處理和處理48小時，處理后收集細胞，具體步驟如下:
[0074](I)、貼壁細胞加胰酶500μ1消化2min，加培養基lml，轉移細胞于15ml離心管，1500rpm，4 °C離心5min離心收集，棄上清。
[0075](2)、細胞重懸于冰冷的500μ1 I3BS,轉移細胞于1.51111離心管；1500印111，4°(:離心5min收集;再加入冰冷的500μ1 PBS，溫柔重懸細胞，1500rpm，4°C離心5min。
[0076](3)、加入500μ1 提取緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，0.lmol/LEDTA，0.5% SDS);重懸細胞，溫柔混勻。并加RNA酶至工作濃度為20yg/ml，37度，消化30min;以便去除RNA。
[0077](4)、用等體積的酸氯仿異戊醇(體積比為25:24:1)抽提一次；12000g離心1min收集水相，12000〖離心10111；[11收集上層水相。
[0078](5)、用等體積的氯仿異戊醇(體積比為24:1)抽提一次。
[0079](6)、12000g離心lOmin，轉移上清于一干凈1.5ml離心管中；
[0080](7)、加入0.1倍體積3moI/L乙酸鈉(pH5.2)與2倍體積-20 °C預冷無水乙醇，-20 °C30mino
[0081 ] (8)、12000g/min，室溫離心5min，棄上清。洗滌沉淀兩次，每次用75%乙醇lml，空氣干燥，至無乙醇味道。
[0082](9)、將DNA溶于等體積的TE中，實驗中用的30μ1。
[0083]測定DNA的濃度，取等量DNA如2yg，計算體積，加入6 X loading染料，準備DNA電泳。制備1.0 %瓊脂糖凝膠，稱取0.3g瓊脂糖，量取30ml TAE溶液，煮沸，待溫度約50 V左右，加0.5μ1 gold view染料，將膠溶液到于制膠板中，待凝固。凝固后，取出放入電泳槽中，加新鮮電泳液(40mM Tris-Cl pH8.0，20mM acetic acid,and ImM EDTA)，電泳電壓約 120v，電泳20min。在B1Doc-1T圖像采集系統下成像，分析結果(如圖6，泳道1、3)。
[0084]6基因組總DNA提取方法檢測總DNA及凋亡小片段DNA，改進后的操作步驟如下:
[0085]HCTl 16細胞放入Mycoy，5A培養基2ml在35mm的培養皿中進行培養，加入濃度為250mM/ml誘導試劑A 2μ1，使培養基中的凋亡誘導試劑A工作濃度為250μΜ/πι1 ；處理48小時，處理后收集細胞，具體步驟如下:
[0086](I)、貼壁細胞加胰酶500μ1消化2min，加培養基lml，轉移細胞于15ml離心管，1500印111，4<€離心5111；[11離心收集，去上清。
[0087](2)、細胞重懸于冰冷的500μ1 I3BS,轉移細胞于1.51111離心管；1500印111，4°(:離心5min收集;再加入冰冷的500μ1 PBS，溫柔重懸細胞，1500rpm，4°C離心5min。
[0088](3)、加入500μ1 提取緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，0.lmol/LEDTA，0.5% SDS);重懸細胞，溫柔混勻。
[0089](4)、并加RNA酶20yg/ml，以便去除RNA;加入蛋白酶K，終濃度達到100yg/ml，混勻，55°C水浴3h，使與組蛋白結合的小片段DNA更多釋放。
[0090](5)、將管內溶液轉移到1.5ml鎖相膠離心管(5PRB1E公司)
[0091](6)、加入等體積的酚氯仿異戊醇(體積比為25: 24:1)，上下顛倒混勻但勿震蕩；12000g離心1min，吸取上層水相于新的1.5ml鎖相膠離心管，再加入等體積的氯仿，異戊醇混合物抽提一次，12000g離心I Omin收集水相。
[0092](7)、轉移上層水相于一干凈離心管中；加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(ρΗ5.2)與2倍體積-20 0C預冷無水乙醇，-20 0C 30min。
[0093](9)、12000g/min，室溫離心5min.棄上清。洗滌沉淀兩次，每次用75%乙醇Iml，空氣干燥，至無乙醇味道。
[0094](10),將DNA溶于等體積的TE中，實驗中用的30μ1。測定DNA的濃度，上一定量的DNA電泳檢測。
[0095]為了方便比較改進前和改進后的方法，電泳時與5部分的結果同時電泳，此部分結果為圖6的泳道2和4。
[0096]7細胞小片段DNA的提取按總DNA的提取方法(改進前)的步驟如下:
[0097]接種等量的HCTl 16細胞于35mm培養皿或6孔板中，培養24小時后，加入250μΜ誘導試劑Α;不處理和處理48小時。首先將培養基全部吸取到15ml離心管中(包含漂浮的細胞)，立即添加500μ1預冷的I3BS溶液，用細胞刮痧將細胞刮掉，移液器轉移到15ml離心管中。再次用500μ1預冷的PBS溶液沖洗35mm培養皿，盡可能多的收集細胞，再次轉移培養皿中的PBS到15ml離心管1500rpm，4°C離心1min;丟掉上清，用4°C預冷的500μ1 PBS溫柔吹打重懸細胞。吸取到冰上預冷的干凈1.5ml離心管中。再次離心去掉細胞中殘余的培養基，收集細胞。
[0098]將收集的細胞加入預冷的300μ1 PBS，Iml移液槍溫柔重懸分成兩等份，一份150μ1離心后去上清，添加細胞裂解液(1mM Tris-HCl，pH8.0，10mM NaCl ,1mM EDTA,0.5%SDS)50yl提取蛋白，并測定濃度；一份離心后添加150μ1 I3BS,使其總體積300μ1，重懸后加蛋白酶K，使蛋白酶K的終濃度為100yg/ml，添加0.5%Triton，55°C溫育2小時，使更多的小片段DNA釋放出細胞。逐滴添加5M NaCl于溶液中，使終濃度為200mM NaCl，12000g，離心lOmin，轉移上清于1.5ml干凈離心管中，進行小片段DNA的提取步驟。具體步驟如下:
[0099](I)離心12000g lmin，進一步去除細胞核殘渣；
[0100](2)轉移上清到干凈離心管中，加等體積的酚氯仿異戊醇(體積比25:24:1)，用手用力上下顛倒混勻。
[0101](3)離心12000g 5min，轉移上清到干凈離心管中，加等體積的氯仿異戊醇(體積比24:1)，用手用力上下顛倒混勻。
[0102](4)12000g，離心1min;轉移水相于干凈1.5ml離心管中。加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的無水乙醇，顛倒混勾，室溫沉淀30min，離心I Omin，棄上清。
[0103](5)用75%乙醇Iml，洗滌沉淀兩次，空氣干燥，直至無乙醇味道。
[0104](6)重懸沉淀在同體積(30μ I)的TE (pH8.0)中。
[0105]根據前步驟中測得的蛋白濃度，取等量的蛋白如40yg，計算小片段DNA的體積，根據體積加入一定量的水至等體積。再加入6 X loading染料，準備DNA電泳。制備1.0%瓊脂糖凝膠，稱取0.3g瓊脂糖，量取30ml TAE溶液，煮沸，待溫度約50°C左右，加0.5μ1 gold view染料，將膠溶液到于制膠板中，待凝固。凝固后，取出放入電泳槽中，加新鮮電泳液(40mMTris-Cl pH8.0 , 20mM acetic acid ,and ImM EDTA)，電泳電壓約 120v，電泳20min。在B1Doc-1T圖像采集系統下成像，分析結果(圖7泳道1、2)。
[0106]8細胞小片段DNA的提取改進后的步驟如下:
[0107]接種等量細胞的35mm培養皿或6孔板，凋亡試劑A誘導后，收集細胞。將HCT116細胞放入培養基中進行培養24小時后，加入250mM誘導試劑A使細胞的工作液為250μΜ，處理48小時。將培養基全部吸取到15ml離心管中(包含漂浮的細胞)，立即添加500μ1預冷的PBS溶液，用細胞刮痧將細胞刮掉，移液器轉移到15ml離心管中。再次用500μ1預冷的PBS溶液沖洗35mm培養皿，盡可能多的收集細胞，再次轉移培養皿中的I3BS到15ml離心管1500rpm，4 °C離心lOmin;丟掉上清，用4°C預冷的500μ1 PBS溫柔吹打重懸細胞。吸取到冰上預冷的干凈
1.5ml離心管中。再次離心去掉細胞中殘余的培養基，收集細胞完成。
[0108]將收集的細胞加入預冷的300μ1PBS，Iml移液槍溫柔重懸分成兩等份，一份離心后去上清，添加細胞裂解液(1mM Tris，pH8.0lOOmM NaCl ,1mM EDTA，0.5%SDS)50yl 提取蛋白，并測定濃度(與7部分蛋白測定部分相同，并同時進行)；一份離心后添加150μ1 PBS,使其總體積300μ1，重懸后加蛋白酶K，使蛋白酶K的終濃度為100yg/ml，加入0.5 % Triton，逐滴添加5M NaCl于溶液中，使終濃度為200mM NaCl，55°C溫育2小時，離心12000g，lOmin，轉移上清于干凈的1.5ml離心管中。分離純化凋亡小片段DNA步驟根據5PRHffi公司的相鎖膠Phase Lock Gel試劑盒(貨號2302810)的操作步驟。具體步驟如下:
[0109](7)離心12000g lmin，進一步去除細胞核殘渣；
[0110](8)轉移上清到相鎖膠離心管中，加等體積的氯仿異戊醇(體積比25:24:1)，用手用力上下顛倒混勻，勿震蕩。
[0111](9)離心12000g 5min，鎖相膠將形成一個間隔在水相和有機相之間；如果仍有少量的鎖相膠在管底，則可重復離心一次。
[0112](10)仔細地吸取鎖相膠上層的水相到另一干凈的鎖相膠離心管中。
[0113](11)加入等體積的氯仿異戊醇(體積比為24:1)，上下顛倒混勻；12000g離心1min，吸取上層水相于新的離心管。
[0114](12)加2.5倍體積的無水乙醇于水相中，顛倒混勻，室溫沉淀30min，12000g，離心1min0
[0115](13)洗滌沉淀兩次，每次用75%乙醇Iml，空氣干燥，直至無乙醇味道。
[0116](14)重懸沉淀在同體積(30μ I)的TE (pH8.0)中。
[0117]根據前步驟中測得的蛋白濃度，取等量的蛋白如40yg，計算小片段DNA的體積，根據體積加入一定量的水至等體積。再加入6X loading染料，與7部分所得的小片段DNA同時準備DNA電泳。制備1.0 %瓊脂糖凝膠，稱取0.3g瓊脂糖，量取30ml TAE溶液，煮沸，待溫度約50°C左右，加0.5μ1 gold view染料，將膠溶液到于制膠板中，待凝固。凝固后，取出放入電泳槽中，加新鮮電泳液(40mM Tris-Cl pH8.0，20mM acetic acid ,and ImM EDTA)，電泳電壓約120v，將7部分和改進后所得小片段DNA同時進行電泳20min。在B1Doc-1T圖像采集系統下成像，分析結果(圖7泳道3)。
[0118]9通過細胞流式所得的數據，光鏡下凋亡細胞形態的觀察，及Annexin V染色結果與細胞凋亡小片段DNA所得的數據比較接近，證明細胞凋亡小片段DNA方法可靠準確。但細胞凋亡小片段DNA提取方法對細胞凋亡的檢測更加簡便、省時、節約成本。
[0119]10具體應用
[0120]I)可用于細胞凋亡的檢測。細胞凋亡研究中，用于篩選不同的凋亡誘導藥物。在腫瘤研究和癌癥的治療中，對細胞凋亡的誘導能力被認為是治療腫瘤和癌癥的重要方法之一，為了評估各種不同化合物和藥物對腫瘤細胞的凋亡效果，僅憑顯微鏡的光鏡形態觀察往往具有很強的主觀性，并且很難區分壞死和細胞凋亡，而凋亡細胞小片段DNA的提取的方法可很快提供分子證據。通過電泳，只要能檢測凋亡小片段DNA即可做出判斷，同時根據凋亡小片段DNA的多少，也可以很快判斷凋亡發生的多少。用此方法快速，便捷，并且成本比較低。實驗的檢測可在3小時內完成。
[0121]2)檢測基因對凋亡藥物的誘導反應，根據條帶的亮弱評價細胞凋亡的效果，測試抗凋亡的藥物。P53是一個細胞凋亡相關的因子，為了研究對凋亡誘導試劑A的凋亡效果，本發明被用于檢測凋亡試劑A的處理不同時間，檢測在p53野生型細胞和p53缺失的細胞凋亡的差異。分別用藥物處理HCTl 16細胞O小時、24小時、36小時、48小時，用基因組小片段DNA提取的方法檢測P53對凋亡的影響。從此方法應用的結果可以看出p53對HCTl 16細胞在凋亡誘導物A的作用下的反應(圖8)。從圖可知在藥物作用48小時時出現大量的細胞凋亡。在癌癥治療中，使癌細胞大量凋亡是治療癌癥的有效手段，因此本發明也可檢測在癌癥治療中對癌細胞的凋亡效果，評價藥效。
[0122]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法，其特征在于，所述細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法包括:凋亡試劑A誘導細胞，收獲細胞并進行等分；一份離心后收集細胞沉淀加細胞裂解液，充分裂解細胞，測定樣品蛋白的濃度，根據等量總蛋白中內參基因的表達一致性作為參考來標準化小片段DNA; —份經過lOOyg/ml蛋白酶K處理2小時，鹽濃度為200mM，在鎖相膠對水相和有機相隔離下，吸取鎖相膠上方的水相，乙醇沉淀凋亡小片段凋亡DNA;相同體積TE溶解沉淀，根據蛋白的濃度標準化小片段DNA在TE溶解后上樣體積從而確定上樣的量，電泳根據凋亡小片段亮弱確定細胞凋亡的多少。2.如權利要求1所述的細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法，其特征在于，所述細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法以下步驟: 步驟一，癌癥細胞的培養及凋亡細胞的誘導，人結腸癌細胞株HCTl 16進行凋亡細胞的誘導，從而提取細胞小片段凋亡DNA，在My coy ’ 5A培養基加10 % FBS的培養基中，4ml Mycoy ’5A培養基在6cm培養皿中，37 °C，5 %的CO2細胞培養箱中，以1:6的比例進行傳代培養;在細胞傳代后24小時，在不同的時間點依次在培養基中的添加250μΜ凋亡誘導物A進行凋亡誘導，每次加藥間隔12小時； 步驟二，凋亡細胞的顯微鏡光鏡觀察和鑒定，在光鏡下進行觀察和確定，細胞在藥物A的處理下，逐漸變圓，細胞核皺縮，并逐漸脫離貼壁的狀態，漂浮于培養基中，初步判斷細胞發生凋亡； 步驟三，凋亡細胞的形態學分子鑒定，進行分子Annexin V染色鑒定，根據公司說明書進行了Annexin V-FITC結合實驗，等量的細胞被培養在6孔板中，貼壁24小時后開始用500μM的凋亡誘導物A對細胞進行處理，24小時后，移除培養基，用2ml PBS洗兩次，然后加入I XAnnexin V的結合緩沖液，然后用I XAnnexin V的結合緩沖液以1:10稀釋Annexin V-FITC染色液，室溫染色15min ；染色后，細胞用結合緩沖液洗滌I次，再加入結合緩沖液在熒光顯微鏡下觀察拍照，顯示綠色熒光的細胞即為凋亡細胞，進一步從分子水平判斷細胞凋亡發生； 步驟四，凋亡細胞PI染色，細胞流式驗證，為了比較DNA小片段測定凋亡效果，用細胞流式方法進行定量驗證比較，35mm培養皿接種5 %的細胞密度，補充培養基到2ml，24小時后，加入凋亡誘導藥物A，濃度為250μΜ，誘導O小時、12小時、24小時和36小時；吸取培養基于15ml離心管中，加入Iml PBS于35mm培養皿洗滌I次，洗滌液也轉移到離心管中；加入500μ1胰酶于培養皿中，用移液器小心吹打，至單個細胞，加入0.5mlMycoy ’ 5A培養基，終止反應；轉移35mm培養皿所有細胞于15ml離心管中；1500rpm，4°C離心lOmin，去上清;加入Iml PBS洗滌細胞沉淀I次；后加入200μ1 PBS重懸細胞;將在振蕩器上，逐滴加入-80°C預冷的甲醇5ml，邊震蕩邊滴加甲醇，-20 0C固定過夜；3000rpm離心5min;移去全部甲醇，加Iml PBS重懸，加入20mg/ml RNAase至工作濃度為20yg/ml，37°C溫育30min ； 2yg/ml PI染色1min，錫箔紙避光；用PBS或合適的緩沖液洗滌細胞兩次;重懸細胞于500ylPBS，細胞流式檢測凋亡細胞;細胞流式采用Cytek Flow Cytometry，每次最少20000個細胞被檢測，分析Sub-Gl期的細胞數量，此期的細胞數量為被認為是凋亡細胞，通過細胞流式結果判斷細胞凋亡的比例，從而進行定量； 步驟五，基因組總DNA提取方法檢測總DNA及凋亡小片段DNA，改進后的操作如下:HCTl 16細胞放入Mycoy ’ 5A培養基2ml在35mm的培養皿中進行培養，加入濃度為250mM/ml誘導試劑A 2μ1，使培養基中的凋亡誘導試劑A工作濃度為250μΜ/πι1;處理48小時，處理后收集細胞； 步驟六，細胞小片段DNA的提取改進后的步驟如下:接種的等量細胞的35mm培養皿或6孔板，凋亡試劑A誘導后，收集細胞，將HCT116細胞放入培養基中進行培養24小時后，加入250mM誘導試劑A使細胞的工作液為250μΜ，處理48小時，將培養基全部吸取到15ml離心管中，添加500μ1預冷的PBS溶液，用細胞刮痧將細胞刮掉，移液器轉移到15ml離心管中；再次用500μ1預冷的PBS溶液沖洗35mm培養皿，再次轉移培養皿中的PBS到15ml離心管1500rpm，4°C離心1min;丟掉上清，用4°C預冷的500μ1 PBS溫柔吹打重懸細胞。3.如權利要求2所述的細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法，其特征在于，所述步驟五具體步驟如下: 第一步、貼壁細胞加胰酶500μ1消化2min，加培養基lml，轉移細胞于15ml離心管，1500印111，4<€離心5111；[11離心收集，去上清； 第二步、細胞重懸于冰冷的500μ1 PBS，轉移細胞于1.5ml離心管；1500rpm，4°C離心5min收集;再加入冰冷的500μ1 PBS，溫柔重懸細胞，1500rpm，4°C離心5min ； 第三步、加入 500μ1 提取緩沖液，I Ommo I/L Tris-HCl,0.lmol/LEDTA，0.5%SDS；重懸細胞，溫柔混勻； 第四步、并加RNA酶20yg/ml，以便去除RNA;加入蛋白酶K，終濃度達到100yg/ml，混勻，55°C水浴3h，使與組蛋白結合的小片段DNA更多釋放； 第五步、將管內溶液轉移到1.5ml鎖相膠離心管； 第六步、加入等體積的酚氯仿異戊醇，體積比為25: 24:1，上下顛倒混勻但勿震蕩；12000g離心1min，吸取上層水相于新的1.5ml鎖相膠離心管，再加入等體積的氯仿，異戊醇混合物抽提一次，1200(^離心101^11收集水相； 第七步、轉移上層水相于一干凈離心管中；加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉pH5.2與2.5倍體積-20 0C預冷無水乙醇，-20 0C 30min； 第八步、12000g/min，室溫離心5min.棄上清，洗滌沉淀兩次，每次用75%乙醇Iml，空氣干燥，至無乙醇味道； 第九步，將DNA溶于等體積的TE中，實驗中用的30μ1，測定DNA的濃度，等量DNA電泳檢測。4.如權利要求2所述的細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法，其特征在于，所述步驟六具體步驟如下: 離心12000g lmin，進一步去除細胞核殘渣； 轉移上清到相鎖膠離心管中，加等體積的酚氯仿異戊醇，體積比25: 24:1，用手用力上下顛倒混勻，勿震蕩； 離心12000g 5min，鎖相膠將形成一個間隔在水相和有機相之間；仍有少量的鎖相膠在管底，則可重復離心一次； 仔細地吸取鎖相膠上層的水相到另一干凈的鎖相膠離心管中； 加入等體積的氯仿異戊醇，體積比為24:1，上下顛倒混勻；12000g離心lOmin，吸取上層水相于新的離心管； 加2.5倍體積的無水乙醇于水相中，顛倒混勻，室溫沉淀30min，12000g，離心1min ； 洗滌沉淀兩次，每次用75 %乙醇Iml，空氣干燥，直至無乙醇味道； 重懸沉淀在同體積30μ1的TE ρΗ8.0中。5.如權利要求2所述的細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法，其特征在于，所述步驟六之后根據測得的蛋白濃度，取蛋白40yg，計算小片段DNA的體積，根據體積加入水至等體積;再加入6 X loading染料，與7部分所得的小片段DNA同時準備DNA電泳；制備1.0%瓊脂糖凝膠，稱取0.3g瓊脂糖，量取30ml TAE溶液，煮沸，待溫度低于50 V，加0.5μ1gold view染料，將膠溶液到于制膠板中，待凝固；凝固后，取出放入電泳槽中，加新鮮電泳液，40mM Tris-Cl pH8.0,20mM acetic acid,and ImM EDTA，電泳電壓 120v，將7部分和改進后所得小片段DNA同時進行電泳20min，在B1Doc-1T圖像采集系統下成像，分析結果。6.—種細胞凋亡的檢測方法，其特征在于，包含權利要求1-5任意一項所述的細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法。7.—種檢測基因對凋亡藥物的誘導反應方法，其特征在于，包含權利要求1-5任意一項所述的細胞凋亡高質量小片段DNA的快速提取及評價方法。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861492SQ201610370483
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月30日
【發明人】余國武, 黃玉碧, 張軍杰, 劉漢梅, 胡育峰, 劉應紅, 李煬平, 呂亞楠, 王德
【申請人】四川農業大學