毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法

毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法
【專利摘要】本發明涉及一種毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，屬于生物分離分析技術領域。所述方法為：對反應物進行毛細管區帶電泳，進樣：第一反應物、第一段電泳緩沖液、第二反應物、第二段電泳緩沖液和第三反應物，兩次在線反應混和形成復合物后，經過檢測窗口檢測；第一、二反應物移速率慢，第三反應物遷移速率快，反應物為蛋白質和ssDNA；分離復合物時，第一、二反應物同為蛋白質或ssDNA，第三反應物為與第一、二反應物不同物質；反向篩選時，ssDNA先與反篩蛋白質作用，再與靶標蛋白質作用，得到與靶標蛋白質特異性更強的ssDNA。所述方法通過一次電泳實現兩次篩選，可根據靶標蛋白質不同實現在線反篩。
【專利說明】
毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，屬于生物分離分析技術領域。
【背景技術】
[0002]單鏈寡核苷酸(single-stranded DNA,ssDNA)或RNA具有特定二級結構，可以與蛋白質分子形成高親和性和特異性的復合物。寡核苷酸文庫是一類含有113?115種不同堿基的ssDNA混合物，其中可能含有一種或數種能與蛋白質分子(靶分子)具有高特異性，高親和性結合的ssDNA，即核酸適配體(Aptamer)。核酸適配體是通過指數富集配體系統進化(SELEX)技術，從隨機寡核苷酸文庫中篩選得到的，具有與靶分子高親和性和高特異性的寡核苷酸序列配體，其特性是親和力高、特異性強、易制備及修飾，并且靶分子分布廣。由于在生物、醫藥以及分子識別和檢測方面有重要的應用價值，目前已經發展出多種核酸適配體的篩選方法，如親和色譜、膜過濾、磁珠分離及毛細管電泳等。
[0003]毛細管電泳(CE)具有高效、快速以及實驗成本低等優點，是新型的微量分離分析技術，在蛋白質的核酸適配體篩選中有廣泛的應用。
[0004]CE用于SELEX篩選核酸適配體即為CE-SELEX。雖然CE-SELEX技術可使核酸適配體篩選周期縮短至傳統SELEX技術的三分之一，大大加快了篩選效率;但是現有技術中傳統的CE-SELEX技術，需將初始的寡核苷酸文庫與靶分子混合孵育，因此樣品消耗大、操作復雜且耗時，并且在需要進行反篩時，傳統CE-SELEX技術中的篩選與反篩不能同時進行，這樣會增加篩選輪數，使操作復雜、耗時且樣品耗費大。

【發明內容】

[0005]針對傳統CE-SELEX技術篩選核酸適配體時，靶分子用量大、反應條件優化過程繁瑣以及反篩步驟耗時費力的不足，本發明的目的在于提供一種基于毛細管兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，可用于靶分子與核酸適配體的高效篩選。
[0006]本發明中，所述毛細管電泳兩次在線反應是一種動態毛細管電泳技術，所述在線反應和反向篩選為本領域常用術語，在線反應是指在毛細管電泳時毛細管中的反應;反向篩選是指當核酸適配體可以與多個作為靶標的蛋白質分子結合，但只需要與其中一個靶標特異性結合的核酸適配體時，篩選時先將核酸適配體與其他靶標反應，排除與其他靶標結合的核酸適配體，剩余的核酸適配體再與所需靶標反應的方法。
[0007]為實現本發明的目的，采用技術方案如下。
[0008]—種基于毛細管兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，所述方法步驟如下:
[0009]對反應物進行毛細管區帶電泳，進樣順序先后依次為:第一反應物、第一段電泳緩沖液、第二反應物、第二段電泳緩沖液和第三反應物，使第三反應物和第二反應物、第三反應物和第一反應物在一次電泳過程的毛細管中實現兩次在線反應混和形成ssDNA與蛋白質的復合物后，依次通過毛細管末端的檢測窗口，分離收集電泳產物；
[0010]所述第一反應物和第二反應物為在毛細管中迀移速率慢的反應物，第三反應物為在毛細管中迀移速率快的反應物，所述反應物根據本領域毛細管區帶電泳的要求制成樣品溶液后進樣。
[0011]當毛細管電泳兩次在線反應分離復合物時，第一反應物和第二反應物同為蛋白質或同為ssDNA，當第一反應物和第二反應物同為蛋白質時，第三反應物為ssDNA，當第一反應物和第二反應物同為時ssDNA時，第三反應物為蛋白質，電泳過程中，第一反應物、第二反應物、第三反應物以及在線反應形成的復合物根據其荷質比大小，依次通過毛細管末端的檢測窗口，可檢測和分離得到兩種復合物的峰。
[0012]當毛細管電泳兩次在線反應用于反向篩選時，由于要求在電泳過程中，ssDNA先與反篩蛋白質作用，消耗掉與反篩蛋白質作用的s sDNA，剩余的s sDNA再與靶標蛋白質作用，與靶標蛋白質作用的ssDNA缺少了與反篩蛋白質相互作用的那一部分，最終得到與靶標蛋白質特異性更強的ssDNA，因此可通過第一反應物、第二反應物和第三反應物在毛細管中迀移速率的快慢實現，即第一反應物和第二反應物同為蛋白質，且第一反應物為靶標蛋白質，第二反應物為反篩蛋白質，第三反應物為ssDNA;由于反篩蛋白質和靶標蛋白質都屬于在毛細管中迀移速率慢的反應物，當僅通過毛細管中迀移速率的速度無法保證ssDNA先與反篩蛋白質作用，出現ssDNA先與靶標蛋白質作用的情況時，可采用調節第一段電泳緩沖液和/或第二段電泳緩沖液的進樣時間，使ssDNA先與反篩蛋白質作用，剩余的ssDNA再與靶標蛋白質作用。
[0013]其中，所述毛細管中迀移速率可通過分別對所述反應物進行毛細管區帶電泳，根據所述反應物的出峰時間確定，先出峰的所述反應物迀移速率快。
[0014]所述反應物可通過以下方法制成樣品溶液進樣:將蛋白質溶于純水中制成原始蛋白質儲備液，將ssDNA洛于純水中制備成原始ssDNA儲備液;將原始蛋白質儲備液稀釋后得到蛋白質樣品溶液，將原始ssDNA儲備液稀釋后得到ssDNA樣品溶液。
[0015]優選確定反應物在毛細管中的迀移速率時的毛細管區帶電泳使用涂層毛細管，可抑制蛋白質在管壁的吸附，可采用總長度48.5cm，有效長度40cm，內徑75μπι的毛細管；可使用Agi Ient 7100毛細管電泳儀進行所述電泳；電泳緩沖液可為硼酸硼砂溶液，可通過將50mM的硼砂溶液與20mM的硼酸溶液按體積比為3: 2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值為8.7;進樣條件可為:50mbar下，進樣3s?25s，分析條件可為:分析溫度25°C，分析電壓_15kV；可使用UV 195nm進行檢測。
[0016]優選所述反應物在毛細管區帶電泳時所使用的毛細管為涂層毛細管，可抑制蛋白質在管壁的吸附，可采用總長度為50.2cm，有效長度為40cm，內徑為75μηι的涂層毛細管；可采用Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀進行所述電泳;第一、二段電泳緩沖液與確定所述反應物在毛細管中迀移速率時的毛細管區帶電泳使用的電泳緩沖液相同，可采用硼酸硼砂溶液，可通過50mM的硼砂溶液與20mM的硼酸溶液按體積比為3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值為8.7;進樣條件可為:蛋白質進樣:0.5口8；[，108;880嫩進樣:0.5口8；[，108;，第一段電泳緩沖液進樣時間為:50s?150s ；分析條件可為:分析溫度為25°C，分析電壓為_15kV;檢測窗口米用毛細管電泳-激光誘導熒光(CE-LIF)檢測，條件為:激發波長488nm，發射波長520nmo
[0017]當毛細管電泳兩次在線反應分離復合物時，優選所述反應物在毛細管中迀移速率為880嫩>蛋白質;優選通過調節第一段電泳緩沖液和/或第二段電泳緩沖液的進樣時間，提高兩種復合物的分離度。
[0018]有益效果
[0019]1.本發明提供了一種基于毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，所述方法通過一次毛細管區帶電泳就可以完成篩選和反向篩選，對反應物需求量很少，該方法尤其適用于來源困難，價格昂貴的靶標反應物;在所述電泳過程中，由于三種所述反應物是在毛細管中在線反應，省去孵育步驟，避免繁瑣操作；
[0020]2.本發明提供了一種基于毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，所述方法可實現對復合物進行分離，電泳時中間進樣電泳緩沖液可避免三種所述反應物提前混合，確保所述反應物在電泳分離開始后進行在線反應，在電泳過程中，在毛細管中迀移速率快的反應物會“穿越”在毛細管中迀移速率慢的反應物，并在“穿越”過程中伴隨復合物的形成和解離過程；由于所述方法是將所述反應物在毛細管內進行在線反應，因此對所述反應物的需求量很少，且所有三種所述反應物都在線參與反應，還可以通過調節電泳緩沖液的進樣時間，提高兩個復合物的分離度；
[0021]3.本發明提供了一種基于毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，所述方法可實現在線反向篩選，在電泳過程中，ssDNA會先與反篩蛋白作用，消耗掉與反篩蛋白作用的ssDNA，剩余的ssDNA再與靶蛋白作用，與靶蛋白作用的ssDNA缺少與反篩蛋白相互作用的那一部分，最終得到與靶蛋白特異性更強的ssDNA。
【附圖說明】
[0022]圖1為實施例1中毛細管電泳反應結果。
[0023]圖2為實施例2中毛細管電泳反應結果。
[0024]圖3為實施例3中毛細管電泳反應結果。
[0025]圖4為實施例4中毛細管電泳反應結果。
【具體實施方式】
[0026]為了充分說明本發明的特性以及實施本發明的方式，下面給出實施例。
[0027]以下實施例1?4中，熒光標記29堿基H-Thr適配體(以下簡稱Apt29-FAM)序列:5’-FAM-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3’，購自生工生物工程(上海)有限公司；人凝血酶(H-ThrWQgEnzo Life Science公司；Apt29_FAM互補序列:5’-FAM-AGT CAC CCCAAC CTG CCC TAC CAC GGA CT-3’；牛凝血酶(B-Thr)購自Sigma公司。
[0028]原始Apt29-FAM儲備液制備:將購買的晶體狀Apt29-FAM，經3000轉/分離心5min，加入純水配制成1.0 X 10—4mol/L的原始Apt29-FAM儲備液，在94°C水浴5min后冰上冷卻，-20°C保存。
[0029]原始Ap 12 9 -FAM互補序列儲備液制備:將購買的晶體狀Ap 12 9 -FAM互補序列，經3000轉/分離心5min，加入純水配制成1.0 X 10—4mol/L的原始Apt29_FAM互補序列儲備液，在94 0C水浴5min后冰上冷卻，_20°C保存。
[0030]原始H-Thr儲備液制備:將購買的晶體狀H-Thr，經3000轉/分離心5min，加入純水配制成1.0 X 10—4mol/L的原始H-Thr儲備液。
[0031]原始B-Thr儲備液制備:將購買的晶體狀B-Thr，經3000轉/分離心5min，加入純水配制成1.0 X 10—4mol/L的原始B-Thr儲備液。
[0032]毛細管區帶電泳所使用的毛細管為涂層毛細管，涂層毛細管購自河北邯鄲開發區奧泰克生物科技有限公司。毛細管電泳采用Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀，在毛細管出口端配備LIF檢測器進行毛細管電泳-激光誘導熒光(CE-LIF)，檢測器檢測條件為:激發波長488nm，發射波長520nm ；所用涂層毛細管外包娃膠層，總長度為50.2cm，有效長度為40cm，內徑為75μπι;第一段電泳緩沖液和第二段電泳緩沖液為pH8.7的硼酸硼砂溶液，通過將50mM的硼砂溶液與20mM的硼酸溶液按體積比為3:2混合得到。
[0033]實施例1
[0034](I)將原始Apt29-FAM儲備液用純水稀釋得到1.0X 10—6mol/L的Apt29-FAM樣品溶液;將原始H-Thr儲備液用純水稀釋得到1.0 X 10—6mol/L的H-Thr樣品溶液。
[0035]在Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀中進行基于毛細管電泳兩次在線反應分離復合物:分別取20yL的H-Thr樣品溶液、第一段電泳緩沖液、第二段電泳緩沖液和Apt29-FAM樣品溶液，電泳運行時進樣先后順序依次為:迀移速率慢的第一反應物H-Thr樣品溶液、第一段電泳緩沖液、迀移速率慢的第二反應物H-Thr樣品溶液、第二段電泳緩沖液和迀移速率快的第三反應物Ap 129-FAM樣品溶液，進樣條件如下:H-Thr樣品溶液:0.5p s i，1 s，第一段電泳緩沖液:0.5psi，50s，Apt29-FAM樣品溶液:0.5psi，1s，第二段電泳緩沖液:0.5psi，1s;電泳分析時間為20min，分析電壓為-15KV，分析溫度為25°C，毛細管的出口端為正極，入口端為負極;在毛細管區帶電泳過程中所述三種樣品溶液在毛細管中進行混合形成ssDNA與蛋白質的復合物，進行毛細管電泳-激光誘導熒光檢測，LIF檢測器檢測結果如圖1所示；
[0036](2)對比實驗1: 一次在線反應分離復合物:電泳運行時進樣先后順序依次為:迀移速率慢的H-Thr樣品溶液、電泳緩沖液和迀移速率快的Apt29-FAM樣品溶液;進樣條件如下:H-Thr樣品溶液:0.5psi，1s，電泳緩沖液:0.5psi，70s，Apt29_FAM樣品溶液:0.5psi，1s;其余同(I)，LIF檢測器檢測結果如圖1所示；
[0037](3)對比實驗2:在Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀中進行毛細管電泳，只進樣Apt29-FAM樣品溶液，LIF檢測器檢測結果如圖1所示。
[0038]圖1最下方譜線為進樣時只進樣Apt29_FAM樣品溶液的毛細管電泳結果譜線，Apt29-FAM在6.2min處產生信號峰，圖1中間的譜線為Apt29_FAM與H-Thr—次在線反應分離復合物的毛細管電泳結果譜線，在6.1min處產生信號峰，和下方譜線Apt29-FAM信號峰出峰時間基本一致，所以確定6.1min信號峰為Apt29-FAM信號峰，與下方譜線對比，中間譜線中Apt29-FAM信號峰峰高降低，并在9.0min處產生了新的信號峰，是由于部分Apt29-FAM與H-Thr反應生成H-Th;r和Apt29-FAM復合物 ，確定9.0min信號峰為H-Thr和Apt29_FAM復合物峰；圖1最上方譜線的譜線為Apt29-FAM與H-Thr兩次在線反應分離復合物的毛細管電泳結果譜線，在6.0min處產生信號峰，和下方譜線Apt29-FAM信號峰出峰時間基本一致，所以確定6.0min信號峰為Apt29-FAM信號峰，與下方譜線對比，上方譜線中Apt29-FAM信號峰峰高降低，與中間譜線對比，上方譜線中Apt29-FAM信號峰峰高降低，并在8.5min和9.6min處產生了新的信號峰，是由于部分Apt29-FAM在毛細管中與H-Thr反應了兩次，生成兩個H-Thr和Apt29-FAM復合物，Cl為Apt29-FAM與H-Thr第一次在線反應產生的H-Thr和Apt29-FAM復合物峰，C2為Apt29-FAM與H-Thr第二次在線反應產生的H-Thr和Apt29-FAM復合物峰。
[0039]實施例2
[0040](I)將原始Apt29-FAM儲備液用純水稀釋得到I.0Χ 10—Vol/L的Apt29-FAM樣品溶液;將原始H-Thr儲備液用純水稀釋得到1.0 X 10—6mol/L的H-Thr樣品溶液。
[0041 ] 在Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀中，進行基于毛細管電泳兩次在線反應分離復合物:分別取20yL的H-Thr樣品溶液、第一段電泳緩沖液、第二段電泳緩沖液和Apt29_FAM樣品溶液，電泳運行時進樣先后順序依次為:迀移速率慢的第一反應物H-Thr樣品溶液、第一段電泳緩沖液、迀移速率慢的第二反應物H-Thr樣品溶液、第二段電泳緩沖液和迀移速率快的第三反應物Apt29-FAM樣品溶液;進樣條件如下:固定Apt 29-FAM樣品溶液，H-Thr樣品溶液和第二段緩沖液進樣量為0.5psi，1s，第一段電泳緩沖液進樣氣壓:0.5psi，增加進樣時間，時間梯度為:50s，99s，120s，150s;固定H-Thr樣品溶液:0.5psi，1s，Apt29_FAM樣品溶液:0.5psi，10s，第二段電泳緩沖液:0.5psi，1s和第一段電泳緩沖液:0.5psi不變，增加第一段電泳緩沖液進樣時間，時間梯度為:50s、99s、120s和150s;電泳分析時間為20min，分析電壓為-15KV，分析溫度為25°C，毛細管的出口端為正極，入口端為負極;在毛細管區帶電泳過程中所述三種樣品溶液在毛細管中進行混合形成ssDNA與蛋白質的復合物，進行毛細管電泳-激光誘導熒光檢測，LIF檢測器檢測結果如圖2所示；
[0042](2)對比實驗1: 一次在線分離復合物:電泳運行時進樣先后順序依次為:迀移速率慢的H-Thr樣品溶液、電泳緩沖液和迀移速率快的Apt29-FAM樣品溶液，進樣條件如下:Apt29-FAM樣品溶液和H-Thr樣品溶液:0.5psi，1s，電泳緩沖液:0.5psi，電泳緩沖液進樣時間隨兩次在線反應第一段電泳緩沖液進樣時間的改變而改變，分別為:70s、119s、140s和170s;其余同(I)，LIF檢測器檢測結果如圖2所示。
[0043](3)對比實驗2:在Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀中進行毛細管電泳，只進樣Apt29-FAM樣品溶液，LIF檢測器檢測結果如圖2所示。
[0044]圖2中四個毛細管電泳圖最下方譜線為進樣時只進樣Apt29_FAM樣品溶液的毛細管電泳結果譜線，Apt29-FAM在6.2min處產生信號峰；圖2中四個毛細管電泳圖中間的譜線為Apt29-FAM與H-Thr—次在線反應分離復合物的毛細管電泳結果譜線，在6.1min處產生Apt29-FAM信號峰，改變電泳緩沖液的進樣時間分別依次為70s、119s、140s和170s，所以分別依次對應在9.0min、8.6min、8.0min和7.4min處產生H-Thr和Apt29_FAM復合物信號峰，說明隨著電泳緩沖液進樣時間的增加，H-Thr和Apt29-FAM復合物出峰時間越早；圖2中四個毛細管電泳圖最上方的譜線為Apt29-FAM與H-Thr兩次在線反應分離復合物的毛細管電泳結果譜線，增加第一段電泳緩沖液進樣時間，分別依次為50s、99s、120s和150s，所以分別依次對應在 9.0min、9.0min、8.4min 和 7.4min 處產生 C2 信號峰，C2 為 Apt29_FAM 與 H-Thr 第一次在線反應產生的H-Thr和Apt29_FAM復合物峰;分別在9.8min、10.8min、10.4min和10.2min處產生Cl信號峰，Cl為Apt29-FAM與H-Thr第二次在線反應產生的H-Thr和Apt29-FAM復合物峰，從圖2中可以看出隨著第一次緩沖液進樣時間的增加Cl和C2信號峰的分離度逐漸變好。
[0045]綜上所述，毛細管電泳兩次在線反應分離復合物可以通過改變第一段電泳緩沖液進樣時間來提高兩個復合物的分離度，如果第一段電泳緩沖液進樣時間太短，就無法有效分離兩個復合物;但是第一段電泳緩沖液進樣時間也不能太長，否側可能導致毛細管電泳過程中ssDNA還未追上迀移速率慢的蛋白質反應物，蛋白質就已經過了檢測窗口，建議第一段電泳緩沖液進行時間為:50s?150s。
[0046]實施例3
[0047](I)將原始Apt29-FAM互補序列儲備液用純水稀釋得到1.0 X 10—6mol/L的Apt29_FAM互補序列樣品溶液;將原始H-Thr儲備液用純水稀釋得到1.0 X 10—6mol/L的H-Thr樣品溶液。
[0048]在Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀中，進行基于毛細管電泳兩次在線反應分離復合物:分別取20yL的H-Thr樣品溶液、第一段電泳緩沖液、第二段電泳緩沖液和Apt29_FAM互補序列樣品溶液，電泳運行時進樣先后順序依次為:迀移速率慢的第一反應物H-Thr樣品溶液、第一段電泳緩沖液、迀移速率慢的第二反應物H-Thr樣品溶液、第二段電泳緩沖液和迀移速率快的第三反應物Apt29-FAM互補序列樣品溶液;進樣條件如下:H-Thr樣品溶液、第一段電泳緩沖液)?丨29441互補序列樣品溶液和第二段電泳緩沖液均為:0.5?81，108;電泳分析時間為20min，分析電壓為-15KV，分析溫度為25°C，毛細管的出口端為正極，入口端為負極;在毛細管區帶電泳過程中所述三種樣品溶液在毛細管中進行混合形成ssDNA與蛋白質的復合物，進行毛細管電泳-激光誘導熒光檢測，LIF檢測器檢測結果如圖3所示；
[0049](2)對比實驗1: 一次在線反應分離復合物:電泳運行時進樣先后順序依次為:迀移速率慢的H-Thr樣品溶液、電泳緩沖液和迀移速率快的Apt29-FAM互補序列樣品溶液，其余同(I)，LIF檢測器檢測結果如圖3所示；
[0050](3)對比實驗2:在Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀中進行毛細管電泳，只進樣Apt29-FAM互補序列樣品溶液，LIF檢測器檢測結果如圖3所示。
[0051]圖3最下方譜線為進樣時只進樣Apt29-FAM互補序列樣品溶液的毛細管電泳結果譜線，Apt29-FAM互補序列在6.4min處產生信號峰，圖3中間譜線為Apt29-FAM互補序列與H-Thr—次在線反應分離復合物的毛細管電泳結果譜線，Apt29-FAM互補序列在6.6min處產生信號峰，無Apt29-FAM互補序列和H-Thr復合物的信號峰；圖3上方譜線為Apt29-FAM互補序列與H-Thr兩次在線反應分離復合物的毛細管電泳結果譜線，Apt29-FAM互補序列在6.6min處產生信號峰，也沒有產生Apt29-FAM互補序列和H-Thr復合物的信號峰。由圖3可知，Apt29-FAM互補序列與H-Thr—次在線反應和兩次在線反應都沒有檢測到復合物的峰，但通過對Apt29-FAM互補序列峰面積積分可得:只進樣Apt29-FAM互補序列樣品溶液的毛細管電泳結果中為:135213479 ;Apt29-FAM互補序列與H-Thr—次在線反應分離復合物的毛細管電泳結果中為:132356394;Apt29-FAM與H-Thr兩次在線反應分離復合物的毛細管電泳結果中為:128578631，由此可見Apt29-FAM互補序列隨著穿越H-Thr次數的增加峰面積逐漸降低，猜測H-Thr和Apt29-FAM互補序列是非特異性作用，相互作用非常弱，所以在電泳運行過程中復合物已經解離，所以未檢測到復合物峰。
[0052]綜上所述，對于相互作用比較弱的蛋白質和ssDNA，進行毛細管電泳兩次在線反應時無明顯復合物生成;但在實施例1中有特異性相互作用的蛋白質和ssDNA，進行毛細管電泳兩次在線反應時產生兩個蛋白質和ssDNA的復合物峰，所以本發明有望用于篩選具有特異性的核酸適配體，相比已有的CE-SELEX具有優勢。
[0053]實施例4
[0054](I)將原始Apt29-FAM儲備液用純水稀釋得到1.0X 10—Vol/L的Apt29-FAM樣品溶液;將原始H-Thr儲備液用純水稀釋得到1.0 X 10—6mol/L的H-Thr樣品溶液;將原始B-Thr儲備液用純水稀釋得到1.0 X 10—6mol/L的B-Thr樣品溶液。
[0055]在Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀中，進行基于毛細管電泳兩次在線反應反向篩選:分別取20yL的H-Thr樣品溶液、第一段電泳緩沖液、B-Thr樣品溶液、第二段電泳緩沖液和Apt29-FAM樣品溶液，電泳運行時進樣先后順序依次為:迀移速率慢的第一反應物H-Thr樣品溶液、第一段電泳緩沖液、迀移速率慢的第二反應物B-Thr樣品溶液、第二段電泳緩沖液和迀移速率快的第三反應物Apt29-FAM樣品溶液;進樣條件如下:H-Thr樣品溶液、B-Thr樣品溶液、第二段電泳緩沖液和Apt29-FAM樣品溶液均為:0.5psi，1s，第一段電泳緩沖液:0.5psi，50s;電泳分析時間為20min，分析電壓為-15KV，分析溫度為25°C，毛細管的出口端為正極，入口端為負極;在毛細管區帶電泳過程中所述三種樣品溶液在毛細管中進行混合形成ssDNA與蛋白質的復合物，進行毛細管電泳-激光誘導熒光檢測，LIF檢測器檢測結果如圖4所示；
[0056](2)對比實驗1:Apt29-FAM和H-Thr—次在線反應分離復合物:電泳運行時進樣先后順序依次為:迀移速率慢的H-Thr樣品溶液、電泳緩沖液和迀移速率快的Apt29-FAM樣品溶液，進樣條件如下=H-Thr樣品溶液和Apt29-FAM樣品溶液均為:0.5psi，1s，電泳緩沖液:0.5psi，70s;其余同(I)，LIF檢測器檢測結果如圖4所示；
[0057](3)對比實驗2:Apt29-FAM和B-Thr—次在線反應分離復合物:電泳運行時進樣先后順序依次為:迀移速率慢的B-Thr樣品溶液、電泳緩沖液和迀移速率快的Apt29-FAM樣品溶液，進樣條件如下=B-Thr樣品溶液和Apt29-FAM樣品溶液均為:0.5psi，1s，電泳緩沖液:
0.5psi，70s;其余同(I)，LIF檢測器檢測結果如圖4所示；
[0058](4)對比實驗3:在Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀中進行毛細管電泳，只進樣Apt29-FAM樣品溶液，LIF檢測器檢測結果如圖4所示。
[0059]圖4最下方譜線為進樣時只進樣Apt29_FAM樣品溶液的毛細管電泳結果譜線，Apt29-FAM在6.7min處產生信號峰，圖4第二條譜線為Apt29_FAM與B-Thr—次在線反應分離復合物的毛細管電泳結果譜線，在6.6min處產生信號峰，在9.5min?11.5min產生一個展寬的包峰，為B-Thr和Apt29-FAM復合物峰，由于Apt29-FAM是H-Thr適配體，所以Apt29-FAM與B-Thr作用比Apt29-FAM與H-Thr作用弱，所以復合物峰不明顯；圖4第三條譜線為Apt29_FAM與H-Thr—次在線反應分離復合物的毛細管電泳結果譜線，在6.6min處產生Apt29-FAM信號峰，在11.5min產生一個新的信號峰，為H-Thr和Apt29_FAM復合物峰；圖4最上方譜線是Apt29-FAM依次與8-11^，!1-11^兩次在線反應反向篩選的毛細管電泳結果譜線，在6.71^11處產生Apt29-FAM信號峰，與下方三條譜線對比，上方譜線中Apt29-FAM信號峰峰面積最低，在10.5min處產生新的信號峰，峰型與下方譜線中H-Thr和Apt29-FAM復合物峰形相似，是Apt29-FAM和H-Thr復合物峰，在10.8min?13min產生一個展寬的包峰，峰型與下方譜線中B-Thr和Apt29-FAM復合物峰形相似，是Apt29_FAM和B-Thr復合物峰。
[0060]綜上所述毛細管電泳兩次在線反應反向篩選以兩種不同的反應物為靶標，進行毛細管電泳兩次在線反應時產生兩種復合物峰，Apt29-FAM先與B-Thr反應，之后剩余的Apt29-FAM再與H-Thr反應，這樣實現了毛細管電泳在線反向篩選，獲得與革El標蛋白質H-Thr特異性更強的ssDNA。
[0061]綜上所述，以上僅為本發明的較佳實施例而已，并非用于限定本發明的保護范圍。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，其特征在于:所述方法步驟如下: 對反應物進行毛細管區帶電泳，進樣順序先后依次為:第一反應物、第一段電泳緩沖液、第二反應物、第二段電泳緩沖液和第三反應物，在一次電泳過程的毛細管中實現兩次在線反應混和形成SSDNA與蛋白質的復合物后，依次通過毛細管末端的檢測窗口，分離收集電泳產物； 所述第一反應物和第二反應物為在毛細管中迀移速率慢的反應物，第三反應物為在毛細管中迀移速率快的反應物； 當毛細管電泳兩次在線反應分離復合物時，第一反應物和第二反應物同為蛋白質或同為ssDNA，當第一反應物和第二反應物同為蛋白質時，第三反應物為ssDNA，當第一反應物和第二反應物同為時ssDNA時，第三反應物為蛋白質； 當毛細管電泳兩次在線反應反向篩選時，ssDNA先與反篩蛋白質作用，剩余的ssDNA再與靶標蛋白質作用，最終得到與靶標蛋白質特異性更強的ssDNA，第一反應物和第二反應物同為蛋白質，且第一反應物為反篩蛋白質，第二反應物為靶標蛋白質，第三反應物為ssDNA，當僅通過毛細管中迀移速率的速度無法保證ssDNA先與反篩蛋白質作用時，調節第一段電泳緩沖液和/或第二段電泳緩沖液的進樣時間，使ssDNA先與反篩蛋白質作用，剩余的ssDNA再與靶標蛋白質作用。2.根據權利要求1所述的一種毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，其特征在于:所述毛細管中迀移速率通過分別對所述反應物進行毛細管區帶電泳，根據所述反應物的出峰時間確定，先出峰的所述反應物迀移速率快。3.根據權利要求1所述的一種毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，其特征在于:所述反應物通過以下方法制成樣品溶液進樣:將蛋白質溶于純水中制成原始蛋白質儲備液，將ssDNA洛于純水中制備成原始ssDNA儲備液;將原始蛋白質儲備液稀釋后得到蛋白質樣品洛液，將原始s s DNA儲備液稀釋后得到s s DNA樣品洛液。4.根據權利要求1所述的一種毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，其特征在于:確定反應物在毛細管中的迀移速率時的毛細管區帶電泳使用涂層毛細管，采用總長度48.5cm，有效長度40cm，內徑75μπι的毛細管;使用Agilent 7100毛細管電泳儀進行所述電泳；電泳緩沖液為硼酸硼砂溶液，通過將50mM的硼砂溶液與20mM的硼酸溶液按體積比為3: 2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值為8.7 ；進樣條件為:50mbar下，進樣3s?25s，分析條件為:分析溫度25°C，分析電壓_15kV;使用UV 195nm進行檢測。5.根據權利要求1所述的一種毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，其特征在于:所述反應物在毛細管區帶電泳時所使用的毛細管為涂層毛細管，采用總長度為50.2cm，有效長度為40cm，內徑為75μπι的涂層毛細管;采用Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀進行所述電泳；第一、二段電泳緩沖液采用硼酸硼砂溶液，通過50mM的硼砂溶液與20mM的硼酸溶液按體積比為3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值為8.7;進樣條件為:蛋白質進樣:0.5psi , 10s； ssDNA進樣:0.5psi , 10s；,第一段電泳緩沖液進樣時間為:50s?150s；分析條件為:分析溫度為25°C，分析電壓為_15kV;檢測窗口采用毛細管電泳-激光誘導熒光檢測，條件為:激發波長488nm，發射波長520nmo6.根據權利要求1所述的一種毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，其特征在于:當毛細管電泳兩次在線反應分離復合物時，所述反應物在毛細管中迀移速率為8迎嫩>蛋白質。7.根據權利要求1或6所述的一種毛細管電泳兩次在線反應分離復合物和反向篩選的方法，其特征在于:通過調節第一段電泳緩沖液和/或第二段電泳緩沖液的進樣時間，提高兩種復合物的分離度。
【文檔編號】C12N15/10GK105861488SQ201610235211
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月14日
【發明人】屈鋒, 胡猷浩, 趙新穎
【申請人】北京理工大學