一種復合誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法
【專利摘要】本發明公開了一種復合誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，包括以下步驟：a）孢子懸浮液制備：取恒溫培養箱內的平板孢子，震蕩后用無菌蒸餾水稀釋，即得孢子懸浮液并備用；b）復合60Co?γ與等離子體誘變：制取該菌株的孢子懸浮液，進行等離子體離子束注入，置于劑量0.5～2.0 KGy的輻照臺面上，吸取60Co?γ射線照射后的樣品稀釋、涂布于0.4%的干酪素培養基上；c）菌株篩選：c1)將干酪素培養基在35℃避光恒溫培養2～4 d，挑選其中HC值大于平均值的變異菌株，接入分離培養基斜面保存備用；c2)取步驟c1）得到的菌株，加入1 mL 2%的硫代硫酸鈉作為解毒劑，培養基中30℃培養2d，選育出酸性蛋白酶酶活力提高值最大的為高產菌株。
【專利說明】
一種復合誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法
技術領域
[0001] 本發明屬于菌株選育的技術領域，尤其是涉及一種復合誘變的酸性蛋白酶高產菌 株選育方法。
【背景技術】
[0002] 蛋白酶是能催化蛋白質水解生成小分子肽、游離氨基酸的一類酶的總稱，被廣泛 應用在食品、生物、醫藥工業以及化學工業中。不同類型的蛋白酶產生作用的最佳條件是不 相同的，根據蛋白酶作用的不同最適PH值可將其分為中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白 酶。酸性蛋白酶是一類可以在酸性環境下水解蛋白質生成小分子化合物的酶類，其最適作 用的pH值為2.5~5.0，相對分子質量為30 000~40 000，等電點較低為3.0~5.0。酸性蛋白 酶主要的來源是動物的臟器（比如胃蛋白酶等)和一些微生物分泌物，包括凝乳酶、胃蛋白 酶和一些其他微生物蛋白酶。目前研究發現能夠分泌酸性蛋白酶的微生物菌源主要是霉 菌，如青霉、曲霉、根霉等，細菌中很少發現。不同的微生物菌源所分泌的酸性蛋白酶雖然具 有一些共同的性質，但不僅在最適溫度、最適pH、耐溫性以及pH耐受性上各不相同，且在酶 反應底物、抑制劑、激活劑等方面均存在著一定的差異。
[0003] 誘變育種的主要步驟分為出發菌株的誘變處理和突變株的篩選兩大部分。出發菌 株的誘變處理包括出發菌株的選擇、誘變劑的選擇和誘變劑量的確定。在出發菌株的選擇 上盡量選擇經多次自發或誘變突變且每次誘變都有較好效果的菌株作為出發菌株，誘變劑 的選擇原則是使用方便并行之有效，并選擇既能擴大變異幅度，又能促進正突變的劑量。突 變體的篩選主要通過科學的初篩和復篩方法來選擇正突變株。
[0004] 誘變育種是用物理和化學誘變劑處理微生物細胞使其發生變異的篩選方法，傳統 的物理誘變劑主要包括紫外線、X射線、伽馬射線、激光、電磁波等。除了以上的傳統誘變劑 外，近年人們開發了很多新型的誘變劑，如微波、離子注入、高能電子流等，并在微生物誘變 育種中取得了很好的效果。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是針對上述問題，提供一種復合誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方 法。
[0006] 為達到上述目的，本發明采用了下列技術方案： 一種復合誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，包括以下步驟： a) 孢子懸浮液制備:取恒溫培養箱內40°C下培養5 d的平板孢子，用無菌蒸餾水洗脫平 板孢子，置于無菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在250~300 r/min的震蕩裝置上震蕩2~5 h， 使孢子活化和分散，使孢子分散率在90%以上，在光學顯微鏡下觀察孢子并計數，然后用無 菌蒸餾水稀釋孢子懸浮液至115個/mL，即得孢子懸浮液并備用； b) 復合eOCo-γ與等離子體誘變:洗脫麥芽汁瓊脂平板培養基上的孢子，制取該菌株 i:〇sf/mL的孢子懸浮液，移液管移取0.2 mL懸液至無菌空平皿，涂勻，以無菌風吹干，計算 損耗率;進行等離子體離子束注入，以r為注入離子，注入電壓為IOKV~25KV，注入劑量分 別為（15~75) X 2.6 X ! ons/oif';然后將盛有菌體懸液的試管置于劑量0.5~2.0 KGy的 輻照臺面上，涂布培養72 h，吸取60C〇-y射線照射后的樣品稀釋、涂布于0.4%的干酪素培 養基上； c )菌株篩選： cl)將步驟b)的干酪素培養基在35°C避光恒溫培養2~4 d，挑選其中HC值大于平均值 的變異菌株，接入分離培養基斜面保存備用;HC值=透明圈直徑/菌落直徑； c2)取步驟cl)得到的菌株，加入I mL 2 %的硫代硫酸鈉作為解毒劑，培養基中30°C 培養2d，然后利用福林酚法檢測中性蛋白酶酶活力，選育出酸性蛋白酶酶活力提高值最大 的為高產菌株。
[0007] 作為優選，所述的步驟a)中培養箱為恒溫電熱培養箱，震蕩裝置為落地式大容量 恒溫振蕩搖床，震蕩速度為300r/min，震蕩時間為6h。
[0008] 作為優選，所述的步驟b)中的所述的無菌空平皿在立式壓力蒸汽滅菌鍋中進行滅 菌處理，并對其進行等離子體離子束注入，以:Γ為注入離子，注入電壓為25KV，注入劑量分 另U 為 55X2.6X 。
[0009] 作為優選，所述步驟b)中的等離子體誘變裝置為低能離子束生物工程裝，60C〇-y 射線誘變裝置為60C〇-Y放射設備。
[0010]與現有的技術相比，本發明的優點在于：選用最佳離子束劑量為60 X 2.6 X10'3 ioss.'em2進行注入誘變，誘變后挑選出經分離培養基培養的透明圈值較大的15株突變菌 株，其中誘變菌株的HC值為4.02。對這15株菌株進行發酵測定酶活力實驗，結果表明誘變菌 株酶活力為最大，其值為1.333 XlO4UAiL，因此，誘變菌株作為經60CO-Y與等離子體復 合誘變后產酸性蛋白酶最高的優良菌株。
[0011] 在復合60C〇- γ和等離子的誘變實驗效果下，并將誘變菌株連續傳代6次，每代分 別進行發酵測定酶活，誘變菌株經過6代穩定性試驗后的酶活力明顯提高，且產酶的穩定性 較好。
[0012] 采用了該兩種誘變劑的復合誘變，以eoco-γ射線和等離子體復合誘變的方式篩 選出最佳菌株(：107，產酶活力為1.333\1〇巧/1^，原始菌株1-537酶活力為4.15\1辨1]/ mL，CI07菌株酶活力較原始菌株酶活力提高了221.2%，對CI07突變菌株進行傳代穩定性實 驗發現，其產酶活力穩定性良好。
【附圖說明】
[0013] 以下結合附圖和本發明的實施方式來作進一步詳細說明 圖1是本發明提供的復合誘變致死率曲線； 圖2是本發明提供的復合誘變劑量對突變率的影響。
【具體實施方式】
[0014] 本實施例中復合誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，包括以下步驟： a)孢子懸浮液制備:取恒溫培養箱內40°C下培養5 d的平板孢子，用無菌蒸餾水洗脫平 板孢子，置于無菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在250~300 r/min的震蕩裝置上震蕩2~5 h， 使孢子活化和分散，要求孢子分散率在90%以上，在光學顯微鏡下觀察孢子并計數，然后用 無菌蒸餾水稀釋孢子懸浮液至115個/mL，即得孢子懸浮液并備用;培養箱為DHP-9272型 恒溫電熱培養箱，震蕩裝置為SKY-200B落地式大容量恒溫振蕩搖床，震蕩速度為300r/min， 震蕩時間為6h; b)復合60C〇-y與等離子體誘變:洗脫麥芽汁瓊脂平板培養基上的孢子，制取該菌株 個/mL的孢子懸浮液，移液管移取0.2 mL懸液至無菌空平皿，涂勻，以無菌風吹干，計算 損耗率;所述的無菌空平皿在YXQ-LS-50立式壓力蒸汽滅菌鍋中進行滅菌處理，并準備進行 等離子體離子束注入，以If為注入離子，注入電壓為25KV，注入劑量分別為55 X 2.6 X l:i@ i顏:。誘變處理完成后，根據劑量要求置盛有菌體懸液的試管于一定劑量0.5~2.0 KGy的輻照臺面上，涂布培養72 h，吸取60C〇- γ射線照射后的樣品稀釋、涂布于0.4%的PDA 培養基上進行優良菌株的初次篩選處理相應時間后取出馬上做分離培養，放置于30°C~50 °C培養箱內倒置培養36~72 h，計算每皿菌落數，繪制致死曲線； 等離子體誘變裝置為低能離子束生物工程裝，60C〇- γ射線誘變裝置為60C〇- γ放射設 備，實用的搖瓶培養基為Η)培養基(含50 mL液體土豆培養基）； c )菌株篩選： cl)首先進行平板初篩:取菌懸液10 mL置于9 mL的培養皿中，置于磁力攪拌器 上，然后取0.2 mL直接涂布在干酪素篩選培養基上初篩，35°C避光恒溫培養2~4 d，挑選 出HC值大且生長較快的菌株，接入分離培養基斜面保存備用。（HC值=透明圈直徑/菌落 直徑）； c2)然后進行搖瓶復篩:取5 mL孢子洗脫液與一定濃度誘變劑混勻，處理一定時間， 加入I mL 2 %的硫代硫酸鈉作為解毒劑，培養基中30°C培養2d，然后利用福林酚法檢測 中性蛋白酶酶活力，選育出酸性蛋白酶酶活力明顯提高的菌株。
[0015] 如圖1所示，X軸為復合誘變注入劑量（2.6 X __涵)，Y軸為菌體致死率 (%)，實驗結果表明，隨著注入劑量的增加，菌體致死率逐漸升高，按照誘變劑量選擇的一般 原則，選取菌體致死率大約在60 %~95 %之間的誘變劑量來觀察其正突變率;如圖2所示，X 軸為復合誘變注入劑量(2.6 ，Y軸為菌體突變率(％)，曲線A為正突變率， 曲線B為負突變率;菌體在不同劑量注入下，正負突變率均先逐漸升高，正突變率在60 X 2.6 龜獲_?Τ為最大，且在此劑量下正負突變率差值也達到了最大，這也同樣證明最 佳離子束劑量為60 X 2.6 X謂_:纖si娜I。
[0016] 在復合eoco-γ和等離子的誘變實驗效果下，并將誘變菌株連續傳代6次，每代分 別進行發酵測定酶活，誘變菌株經過6代穩定性試驗后的酶活力明顯提高，且產酶的穩定性 較好。
[0017] 采用了該兩種誘變劑的復合誘變，以eoco-γ射線和等離子體復合誘變的方式篩 選出最佳菌株CI07，產酶活力為1.333 X i〇4U/mL，原始菌株M-537酶活力為4.15 X IO3U/ mL，CI07菌株酶活力較原始菌株酶活力提高了221.2%，對CI07突變菌株進行傳代穩定性實 驗發現，其產酶活力穩定性良好。
【主權項】
1. 一種復合誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其特征在于:包括以下步驟： a) 孢子懸浮液制備:取恒溫培養箱內40°C下培養5 d的平板孢子，用無菌蒸餾水洗脫平 板孢子，置于無菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在250~300 r/min的震蕩裝置上震蕩2~5 h， 使孢子活化和分散，使孢子分散率在90%以上，在光學顯微鏡下觀察孢子并計數，然后用無 菌蒸餾水稀釋孢子懸浮液至115個/mL，即得孢子懸浮液并備用； b) 復合60C〇-y與等離子體誘變:洗脫麥芽汁瓊脂平板培養基上的孢子，制取該菌株?〇' : 個/mL的孢子懸浮液，移液管移取0.2 mL懸液至無菌空平皿，涂勻，以無菌風吹干，計算損耗 率;進行等離子體離子束注入，以絕為注入離子，注入電壓為10KV~25KV，注入劑量分別為 (15~75) X 2.6 X ;然后將盛有菌體懸液的試管置于劑量0.5~2.0 KGy的輻 照臺面上，涂布培養72 h，吸取60C〇-y射線照射后的樣品稀釋、涂布于0.4%的干酪素培養 基上； c) 菌株篩選： cl)將步驟b)的干酪素培養基在35°C避光恒溫培養2~4 d，挑選其中HC值大于平均值 的變異菌株，接入分離培養基斜面保存備用;HC值=透明圈直徑/菌落直徑； c2)取步驟cl)得到的菌株，加入1 mL 2 %的硫代硫酸鈉作為解毒劑，培養基中30°C 培養2d，然后利用福林酚法檢測中性蛋白酶酶活力，選育出酸性蛋白酶酶活力提高值最大 的為高產菌株。2. 如權利要求1所述的一種復合誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其特征在于:所 述的步驟a)中培養箱為恒溫電熱培養箱，震蕩裝置為落地式大容量恒溫振蕩搖床，震蕩速 度為300r/min，震蕩時間為6h。3. 如權利要求1所述的一種復合誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其特征在于:所 述的步驟b)中的所述的無菌空平皿在立式壓力蒸汽滅菌鍋中進行滅菌處理，并對其進行等 離子體離子束注入，以辦為注入離子，注入電壓為25KV，注入劑量分別為55X2.6 Xl(f4. 如權利要求1所述的一種復合誘變的酸性蛋白酶高產菌株選育方法，其特征在于:所 述步驟b)中的等離子體誘變裝置為低能離子束生物工程裝，60C〇- γ射線誘變裝置為60C〇-γ放射設備。
【文檔編號】C12N1/02GK105861483SQ201610351277
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月25日
【發明人】何榮軍, 王茜, 孫培龍
【申請人】浙江工業大學