AtPrx64基因在提高植物鋁耐受性上的應用

AtPrx64基因在提高植物鋁耐受性上的應用
【專利摘要】本發明公開了AtPrx64基因在提高植物鋁耐受性上的應用，將AtPrx64基因重組到植物表達載體中，并轉化野生型煙草，通過篩選獲得轉AtPrx64基因煙草；實驗結果表明在鋁脅迫條件下，轉基因煙草的根相對生長量、可溶性蛋白含量隨著鋁濃度的增加而逐漸降低，轉基因煙草比野生型降低得少；轉基因煙草的H2O2、MDA含量則隨著鋁濃度的增加而逐漸升高，升高的幅度比野生型煙草低；無論有沒有鋁脅迫，在轉基因煙草中質膜H+?ATPase活性及檸檬酸分泌量均比野生型煙草高；對不同濃度鋁脅迫下的根中鋁含量的測定發現，轉基因煙草根中的鋁含量顯著低于野生型煙草；轉AtPrx64煙草能顯著提高煙草對鋁脅迫的耐受性。
【專利說明】
At Pr x64基因在提局植物鍋耐受性上的應用
技術領域
[0001]本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及AtPrx64基因在提高植物鋁耐受性上的應用。
【背景技術】
[0002]在植物不同組織器官中每時每刻進行的各種代謝反應均會產生活性氧(reactiveoxygen species，R0S)。在正常的生長條件下，植物體內的ROS含量較低，不會對植物造成損傷，但是在環境脅迫如土壤酸化或鹽堿化、干旱、低溫或光照不足以及病菌侵染、損傷時，植物在形態、生理、生化等方面會發生多種變化，致使胞內代謝紊亂并產生大量的活性氧。這些ROS對植物有兩方面的作用，一方面活性氧對植物細胞有很強的毒害作用，能夠引發植物細胞組分的氧化，即“氧爆發”，主要有過氧化氫(H202)、羥基自由基(.0Η)、超氧陰離子自由基(O2-)和單線態氧、脂類過氧化物等類型。逆境條件下，ROS的產生與清除失衡，自由基在體內過量積累，導致膜脂過氧化和膜透性增大，正常生理功能受到破壞，細胞代謝紊亂，致使植物受到傷害。另一方面ROS作為氧化脅迫過程中的信號分子，在有些代謝過程以及在逆境脅迫感應、病原菌應答以及植物生長發育過程中起到重要作用。如，植物受到病原體侵染后，細胞內活性氧ROS水平會迅速升高從而引起被感染的細胞死亡；同時，活性氧參與細胞壁中糖蛋白交聯過程，有利于抵御病原體侵入細胞。然而，大多數脅迫情況下產生的過量ROS對植物都是有害的，為了適應這些非生物脅迫，植物在進化過程中，特別是長期生長的逆境環境中的植物，已經形成了一些保護機制去感應外界不良環境的信號，并通過形態和生理上的變化來適應逆境。這些保護機制主要包括由過氧化物酶(P0D)、過氧化氫酶(CAT)以及抗壞血酸過氧化物酶(APX)等構成的酶促脫毒機制以及由生育酚、胡蘿卜素和甘露醇等非酶類抗氧化劑構成的非酶促脫毒機制。這兩種機制共同清除逆境脅迫下植物體內積累的過量R0S從而緩解逆境脅迫對植物造成的傷害。因此，利用基因工程手段提高植物體內抗氧化酶類在植物中的表達及酶活性，是增強植物抗逆性的有效途徑之一。已有大量研究利用基因工程手段獲得過表達APX、S0D、CAT植株并顯著提高了植株對氧化脅迫的抗性。如在苜蓿中過量表達煙草的Mn-SOD顯著增強了轉基因苜蓿中的SOD活性，且大田試驗發現轉基因植株越冬存活率也大大提高。在植物中過量表達水稻中與POD活性有關的RCI3冷誘導基因顯著增強了植物對低溫及鹽脅迫的耐受性。此外，一些冷誘導基因、抗凍蛋白基因、滲透調節相關酶基因、脂肪酸去飽和酶基因的過量表達都可以提高植物的耐低溫能力。隨著生物技術的迅猛發展，對抗氧化脅迫的分子機理的認識不斷加深，人們開始采用基因工程手段培育各種抗性新品種。而過氧化物酶對H2O2的親和力極強，在清除植物體內活性氧方面起著重要的作用，因此受到人們的廣泛關注。
[0003]在對擬南芥響應鋁脅迫的研究中發現有多種第m類過氧化物酶的參與，其中有10種第ΙΠ類過氧化物酶的表達上調，包括4七？^2、4七？^27、4七？^49、4七？^62、4七？^64、AtPrx69等。因為第ΙΠ類過氧化物酶是一類功能多樣的蛋白，他們在植物中的不同表達方式可能代表著他們對鋁脅迫過程中的不同響應過程，所以對它們的功能分別進行研究是非常必要的。在對AtPrx64基因的研究中發現，其主要在分化的維管束、木質部薄壁組織和厚壁組織中表達，并和厚壁組織的木質化相關，主要定位在下胚軸和根中，并與凱氏帶的形成相關。但對AtPrx64基因在鋁脅迫過程中的作用還未見報道，我們將該基因轉入煙草中，對轉AtPrx64基因煙草的耐鋁能力進行了檢測，并對其可能的機制進行了探討。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種基因的新用途，S卩AtPrx64基因在提高植物鋁耐受性上的應用，AtPrx64基因為擬南芥第三類過氧化物酶基因，GenBank登錄號為:145358744;獲得鋁耐受性增強的轉基因植物，可以用于對該基因的進一步研究，也可以用于鋁污染土壤的種植。
[0005]為了實現本發明的上述目的，本發明的技術方案如下:
(1)選擇了研究較多的一種擬南芥第三類過氧化物酶基因AtPrx64及易于栽培的煙草作為材料，進行了以下試驗；
(2)采用Gateway技術構建AtPrx64基因的植物表達載體
用TRIzol Reagent試劑按照說明書提取擬南芥總RNA;參照Fermentas試劑公司說明書進行反轉錄獲得AtPrx64的cDNA，使用AtPrx64基因引物[上游弓丨物5'-GGATCCATGAATGCACACATGCTCAATCTCC(含 BamHI 酶切位點)，下游為3'-CTCGAGCTAGCGAACCCTTCTGCAGTTAAGT (含Xhc^酶切位點)]進行RT-PCR擴增，獲得AtPrx64編碼區全長DNA片段;通過酶切連接到pMD 18-T載體上，熱激轉化大腸桿菌DH5a，通過抗性篩選及測序獲得含正確序列的TA克隆；再進行酶切連接將片段連接到pENTR-2B載體上，通過抗性篩選及測序獲得入門載體pENTR- AtPrx64;根據LR反應試劑盒LR Clonase? plusEnzyme Mix(購于美國Invitrogen公司)說明書，通過LR反應將AtPrx64重組到目的載體PK2GW7上，獲得植物表達載體pK-35S- AtPrx64;用電轉化法將pK_35S_ AtPrx64轉入農桿菌，用篩選檢測正確的農桿菌通過葉盤轉化法轉化野生型煙草，并進行以下篩選及檢測；
(3)通過抗性篩選獲得的轉基因植株，再進行基因組、mRNA水平、蛋白表達水平及POD活性的檢測，獲得多株轉AtPrx64基因煙草(AtPrx64-l至AtPrx64-6)，選取POD活性最高的AtPrx64_6 并擴繁；
(4)將野生型煙草和AtPrx64-6煙草在Hongland’s營養液中培養兩周后，選擇長勢一致的健壯植株，用含0.5 mM CaCl2的Hongland’s營養液(pH4.3)預處理過夜，然后添加0、50、100、200、400 μΜ AlCl3處理，收集根尖，液氮速凍，-80 °(:凍存備用，以對各項鋁抗性指標進行檢測;每個組做6個重復，以未加A1C13(0 μΜ)處理的作為對照組。
[0006]本發明選擇將AtPrx64基因轉入煙草中，提高了煙草對鋁的耐受性，將為我們對該基因的功能做進一步研究提供材料，也為研究其他相關基因提供了思路。此外，還可將該轉基因煙草用作鋁污染土壤中的栽培品種。
[0007]本發明的有益效果:本發明所述轉AtPrx64基因煙草(AtPrX64-6 )，容易通過無性繁殖的方式保存種質資源，可以通過栽培獲得種子進行保存，容易推廣種植。此外還可以通過對AtPrx64-6煙草和野生型煙草的結構及生理生化指標的比較對AtPrx64基因的功能及其相關調控機制進行更深入的研究。
【附圖說明】
[0008]圖1是本發明中對轉AtPrx64基因煙草基因組中AtPrx64基因整合情況的檢測；
圖2是本發明中對轉AtPrx64基因煙草AtPrx64 mRNA水平的檢測；
圖3是本發明中對轉AtPrx64基因煙草AtPrx64基因的蛋白表達水平的檢測；
圖4是本發明中對轉AtPrx64基因煙草中總POD活性的檢測；
圖5是本發明中不同濃度鋁脅迫下轉基因煙草AtPrx64-2、AtPrx64-4、AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根相對生長量變化的比較；
圖6是本發明中不同濃度鋁脅迫下轉基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中H2O2含量變化的比較；
圖7是本發明中不同濃度鋁脅迫下轉基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中H2O2的熒光共聚焦圖；
圖8是本發明中不同濃度鋁脅迫下轉基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中可溶性蛋白含量變化的比較；
圖9是本發明中不同濃度鋁脅迫下轉基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中丙二醛(MDA)含量變化的比較；
圖10是本發明中不同濃度鋁脅迫下轉基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中H+-ATPas e活性的比較；
圖11是本發明中不同濃度鋁脅迫下轉基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中檸檬酸分泌量的比較；
圖12是本發明中不同濃度鋁脅迫下轉基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)根中鋁含量的比較。
【具體實施方式】
[0009]下面通過實施例和附圖對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容。實施例中方法如無特殊說明，按常規操作進行，如無特殊說明使用試劑均為常規購試劑或按常規方法配制的試劑，如無特殊說明方法中百分數均為質量百分數。
[0010]實施例1:AtPrx64基因CDNA片段的獲得
用TRIzol Reagent試劑按照說明書提取擬南芥總RNA。具體操作步驟如下:取植物嫩葉約0.1g放入加有液氮的研缽中，充分研磨成粉末;加入I mL TRIzoL試劑在研缽中繼續研磨成溶液狀，室溫靜置5 min后移入2 mL離心管;然后加入200 pL氯仿，振蕩15 s混勻，4°C、12000 rpm離心15min;將上清液轉移至新2 mL EP管，加入500 pL異丙醇，混勾，-20。<3放置 10 min；4 °C ^ 12000 rpm離心 10 min;棄上清，沉淀用75% 乙醇0.8-1 mL 清洗；4°C、12000 rpm離心I min，棄75%乙醇；重復洗I次以徹底出去鹽雜質；真空干燥沉淀或自然晾干，用20 UL焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA，-20°C保存備用。
[0011]取2 UL上述DEPC水溶解的RNA進行電泳檢測，檢測到RNA提取完好后，再取2 yL總RNA進行M-MLV反轉錄，方法參照Fermentas試劑公司說明書。反轉錄過程如下:2 pL RNA、9pL DEPC處理水、4 pL 01igo(dT)，72 °C金屬浴10 min后立即冰浴5 min，再添加2 pL dNTP和I yL的RNA酶抑制劑，1.5 pL的反轉錄酶、5 pL反轉錄buffer，42 °C保溫60 min后迅速置于70 °C中使反轉錄酶變性，5 min后取出，即獲得擬南芥cDNA。
[0012]根據GenBank(登錄號為:145358744)上發表的擬南芥AtPrx64基因序列全長，設計POD基因上游引物為5-GGATCCATGAATGCACACATGCTCAATCTCC(含BamHI酶切位點)，下游為3-CTCGAGCTAGCGAACCCTTCTGCAGTTAAGT (含XhoI酶切位點)。以提取的擬南芥cDNA為模板，以設計的AtPrx64引物用Ex Taq酶mix進行RT-PCR擴增，膠回收獲得AtPrx64基因編碼區全長，即目的片段。
[0013]實施例2:AtPrx64基因植物表達載體pK-35S- AtPrx64的構建及轉化煙草
將AtPrx64基因的cDNA片段連接到pMD-18T載體上，熱激轉化DH5a，通過氨芐青霉素篩選得到有抗性的單菌落，PCR和雙酶切檢測正確后測序，測序工作委托華大基因完成。測序正確的單菌落擴大培養后提取質粒，經雙酶切后連接到入門克隆載體PENTR-2B上，熱激轉化DH5a，卡那霉素(Km)篩選得到有抗性的單菌落，雙酶切檢測、測序后擴大培養，提取質粒獲得入門克隆載體PENTR-2B- AtPrx64。在LR Mix Enzyme作用下，目的載體pK2GW7和入門克隆載體PENTR-2B- AtPrx64和進行LR重組反應后轉化DH5a，經壯觀霉素(Spe)篩選檢測后獲得植物表達載體PK-35S- AtPrx64。
[0014]通過電轉化法將pK-35S- AtPrx64轉入農桿菌pMP90中，Spe篩選獲得陽性克隆菌株，將檢測正確的單菌落擴大培養后通過葉盤轉化法轉化野生型煙草，轉染后將煙草葉片放在含有Km和頭孢噻肟鈉(Cef)的MS4培養基上誘導外植體發芽，兩周換一次培養基。待轉染的葉片生長出芽后，切下長勢好的芽放入含Cef和Km的MS培養基上誘導芽生根。約I個月后提取煙草幼苗葉片基因組DNA、RNA和總蛋白，檢測擬南芥AtPrx64在煙草中的整合、轉錄及表達情況。
[0015]實施例3:轉基因植株的基因組、mRNA水平、蛋白表達水平及POD活性的檢測
(1)AtPrx64基因在煙草基因組中的整合情況檢測:用CTAB法從煙草葉片中提取基因組DNA作為模板進行PCR擴增，檢測AtPrx64在轉基因煙草基因組中的整合情況。取0.1 g煙草的葉片迅速放入液氮中冷凍，在研缽中快速研磨至粉末狀，加入預熱到65 °C的2 X CTAB緩沖液900 pL(20 mM EDTA，2% CTAB和1.4 M NaCl)，研磨混勻后65 °C水浴15 min，冷卻后加入500 HL氯仿-異戊醇(24:1)混合液上下顛倒搖勻后室溫離心。取上清于EP管后加入等體積的異丙醇和1/10醋酸鈉混勻后置于-20 0C放置20 min，于4 °C離心機離心20 min。棄上清后，用乙醇清新兩次，真空干燥，最后用RNase的TE緩沖液溶解，37 °C放置20 min后取出用于PCR檢測，有條帶證明有AtPrx64基因的整合，共獲得了 6株整合了擬南芥AtPrx64基因的轉基因煙草(如圖1所示)
(2)用RNA提取試劑(TRIzol? Reagent)提取野生型和轉基因煙草根的總RNA，提取步驟參照說明書進行。取3 Hg的總RNA進行RT-PCR，取3 yL總RNA后加入10 yL體系(1.5 yLoligc^P8.5 uL DEPC水)于70°C金屬浴5 min后立即置于冰上，5 min后再加入12 yL的反應體系(I pL M-MLVRT、1 pL RNA 酶抑制劑、1.5 pL dNTP、3.5 pL DEPC水、5 pL MLV-byffer)于42 °(:金屬浴，I h后取出于72 °C保溫10 min即獲得煙草的cDNA，放_20°C保存備用。以反轉錄成的cDNA為模板進行AtPrx64的mRNA表達分析。有條帶的證明有AtPrx64的mRNA轉錄，結果如圖2所示，野生型煙草無條帶，說明沒有AtPrx64的mRNA轉錄，6株轉基因煙草均有AtPrx64的mRNA轉錄。
[0016](3)轉基因煙草中AtPrx64基因的蛋白表達情況檢測:取0.5 g煙草根，用液氮速凍后充分研磨，加入900 uL蛋白抽提液(100 mM Tris-HCl，pH 8.8,1 mM PMSF、10%甘油及5% PVP和10 mM硫基乙醇)，置于冰上5 min后，4°C，12000 rpm離心5 min后取上清即獲得總蛋白液，Bradf ord法測蛋白含量。經SDS-PAGE電泳分離后，通過半干式轉膜儀將蛋白轉移到PVDF上，5%的脫脂奶粉室溫封閉I h后，用PBS清洗PVDF膜3次，每次5 min;加入1yL的AtPER64 (AtPrx64基因表達的蛋白)特異性抗體(兔抗，由本實驗室自制)與PVDF膜一起常溫孵育2 h;用PBS清洗PVDF膜3次后，再加入連有辣根過氧化物酶的羊抗兔二抗，常溫孵育Ih;最后加入ECL發光底物反應，凝膠成像系統觀察照相(圖3)。
[0017](4)總過氧化物酶(POD)活性測定(愈創木酚法):總POD活性測定參照Chance等的愈創木酚方法[35]。首先取水培2周的煙草，用0.5 mM CaCl2、ρΗ*4.3的hongland’s營養液預處理12 h后，再用濃度分別為0、50、100、200、400 μΜ的AlCl3處理12 11后，取0.5 g根用液氮速凍后研磨，加入1.5 mL Tris-HCl (pH 7.0)(內含有I mMDTT (二硫蘇糖醇)、20%甘油、I mMGSH (還原型谷胱甘肽)、1 mMASA (抗壞血酸)、1 mM EDTA、5 mM MgCl2)抽提，將抽提液轉移到2 mL離心管中，于4 °C、12000 rpm、離心15 min，取上清液待測。反應混合液:在50 m L 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液中加入28 yL的愈創木酚，于磁力攪拌器上加熱攪拌直至愈創木酷溶解，再加入19 uL的30% H2O2,混合均勻，4 °C保存。酶活測定:取反應混合液1.5 mL，加入10 pL的樣品提取液，馬上讀470 nm下的OD值，每個30 s讀一次，讀3 min。以每分鐘OD值的變化表示酶活的大小。結果如圖4所示，3個株系轉基因煙草中，AtPrx64-6株系的POD酶活性最高。
[0018]實施例4:轉基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)處理的具體步驟如下:
1、實驗材料為轉基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草(WT)組培苗
煙草繼代2周后，挑選大小及根系生長一致的組培苗，在Hongland ’ s營養液中培養兩周后，選擇長勢一致的健壯植株，用含0.5 mM CaCl2的Hongland’s營養液(pH4.3)預處理過夜，然后添加0、50、100、200、400 μΜ AlCl3處理，收集根尖，液氮速凍，-80 °(:凍存備用，以對各項鋁抗性指標進行檢測。每個組做6個重復，以未加A1C13(0 μΜ)處理的作為對照組。
[0019]實施例5:采用實施例4中水培兩周的煙草，用不同濃度鋁處理24h后的植株，用?財.3的0.5 mM的CaCl2預處理過夜后，記錄鋁處理前的根長度，然后用不同濃度的0、50、100、200和400 μΜ的AlCl3溶液(含有0.5 mM CaCl2,pH 4.3)分別處理24 h后，記錄鋁處理后的根長度，每個做6個重復。其中以未經鋁處理(O μΜ)的煙草作為為對照。相對根生長量(Relative Root Growth: RRG):根相對生長率(RGG) =(鋁處理后的根長-鋁處理前的根長)/(未經鋁處理后的根長-未經鋁處理前的根長)*100。在鋁脅迫條件下，野生型煙草和轉基因煙草的根相對生長量(RRG)均隨著鋁處理濃度的增加而逐漸降低，轉基因煙草比野生型降低得少，其中AtPrx64-6最為明顯，結果如圖5所示，后續實驗均以AtPrx64-6為材料。
[0020]實施例6:取實施例4中用鋁處理24h的煙草，收集煙草根尖0.5 g，立即用液氮研磨速凍研磨，研磨成粉末狀后在立即加入1.5 mL Tris-HCl (pH 7.4)抽提，待研磨成液狀后將抽提液移入2 mL EP管中，4°C，離心機中離心(12000 rpm),20 min后取出，取上清于新的管子中保存于-20°C備用。
[0021]H2O2含量的測定:根據Gay和Gebicki的方法，采用二甲酚橙進行測定。樣品反應體系:82 uL溶液A+820 pL溶液B+150 提取的上清液體，其中，試劑A(200 mL)含0.0872 g(NH4)2S04、0.1835 g FeS047H20、18 M 濃H2SO4 4.58 mL)，試劑B(6 g 山梨醇，0.0234 g二甲酚橙)的比例分別為1:10;將上述體系置于30 °C水浴30 min，用分光光度計測定560 nm處的吸光度值，空白對照體系:82 uL A溶液+820 pL B溶液+150 pL ddH20。將測得的吸光值帶進標準曲線計算:y=0.0837x-0.0005 (y為OD值，x為計算后得到的H2O2濃度(nM))。結果如圖6所示，野生型煙草和轉基因煙草AtPrx64-6的H2O2含量隨著鋁濃度的增加而逐漸升高，在轉基因煙草AtPrx64-6中，升高的量顯著低于野生型煙草。
[0022]實施例7:取實施例4中用鋁處理24 h的煙草，取2?3 cm根尖，放入含500 pL探針負載緩沖液(50 mM KCl和10 mM Tris，pH=7.2)中，再加入2 yL H2O2熒光探針染料(H2DCFDA)置于黑暗中20 min，后用激光共聚焦顯微鏡觀察。結果如圖7所示，未用鋁處理時，野生型煙草和轉基因煙草AtPrx64-6的熒光均很弱，在鋁處理下，野生型煙草和轉基因煙草AtPrx64-6的熒光亮度明顯高于未用鋁處理的煙草，并且野生型煙草的熒光亮度更強。
[0023]實施例8:取實施例4中處理好的根尖0.2g，液氮研磨后加入2 mL蛋白提取緩沖液(100 mM Tris-HClCpH 8.0)，10%甘油，I mM PMSF，10 πιΜβ-巰基乙醇，5% PVP,2 mM EDTA-Na2)，4 °C，12000 rpm離心1 min，取上清，采用Bradf ord法測定蛋白質濃度，通過OD595的吸光值，計算可溶性蛋白濃度。結果如圖8所示，野生型煙草和轉基因煙草AtPrx64-6的可溶性蛋白含量隨著鋁處理濃度的增加而逐漸降低，在轉基因煙草AtPrx64-6中，降低的量顯著低于野生型煙草。
[0024]實施例9:MDA的測定，參照硫代巴比妥(TBA)的方法，硫代巴比妥(TBA)和丙二醛(MDA)在高溫及酸性環境下會反應生成紅棕色物質3，5，5-三甲基惡唑2，4-二酮，在532 nm的光下有最大吸收峰。將提取的50 uL樣品加入到400 uL 0.6% TBA溶液中(TBA先在溶解于少許的I M NaOH中溶解后用10%TCA定容至100 mL)，再加入350 pL ddH20混勻，80 °(:水浴10 min，用分光光度計(島津uvmin1-1240)測532 nm和450 nm處的吸光值，計算公式:MDA含量(μΜ)=6.450D532-0.560D45o，對照為Tris-HCl。結果如圖9所示，隨著鋁處理濃度的增大，野生型煙草和轉基因煙草AtPrx64-6的MDA含量也逐漸升高，但是野生型煙草升高的量顯著高于轉基因煙草AtPrx64-6，以上結果說明轉基因煙草AtPrx64-6對鋁的耐受性更高。
[0025]實施例10:取實施例4中鋁處理2 h后的煙草，稱取根組織0.5 g，用錫箔紙包裹迅速放入液氮中速凍后研磨，研磨成粉末狀加入1.5 mL的反應勻楽液，反應體系中包含I mMEDTA, I mM MgSO4以及10 mM Tris-HCl、0.25 mM山梨醇，溶解后將研磨液轉移到2 mL EP管中，4 °C，11000轉離心20 min后取上清，于分光光度計OD595測蛋白濃度，之后取500 yg質膜蛋白在0.5 mL的反應體系中以啟動反應，(反應體系包含0.02% Brij、50 mM KCl,4 mMATP-Na2、l mM (NH4) 2Mo04、50 mM KN03、50 mM BTP/MES、1 mM NaN2 混合而成)。之后將反應混合物于30°C水浴30 min后，立即加入I mL反應終止液(含5% SDS (w/v)、2% H2SO4 (v/V)和0.7% (順4)2 Μο〇4 (*八))后再加入0.5 mL顯色液，置于室溫條件下。約20 min后，用分光光度計測定波長為660 nm處的吸光值。根據標準曲線計算質膜H+-ATPase的活性。將I單位的質膜H+-ATPase活性定義為:30 °C的反應條件下，在I分鐘內每mg蛋白催化ATP分解釋放無機磷酸的μΜ數。結果如圖10所示，無論有沒有鋁脅迫，在轉基因煙草AtPrx64-6根中質膜H+-ATPase活性均比野生型煙草高，并且隨著鋁濃度的增加雖然兩者的H+-ATPase活性均呈下降趨勢，但轉基因煙草AtPrx64-6始終高于野生型煙草，說明轉基因煙草AtPrx64-6能通過提尚氣栗活性來提尚植物對招的耐受性。
[0026]實施例11:取實施例4中鋁處理12h后的營養液，收集處理液，過濾后用真空干燥儀抽干后溶于I mL蒸餾水中，用高效液相色譜儀測檸檬酸的分泌量。結果如圖11所示，無論有沒有鋁脅迫，在轉基因煙草AtPrx64-6中根的檸檬酸分泌量均比野生型煙草高，并且隨著鋁濃度的增加雖然兩者的檸檬酸分泌量均呈下降趨勢，但轉基因煙草AtPrx64-6始終高于野生型煙草，說明轉基因煙草AtPrx64-6可能通過分泌更多的檸檬酸來螯合Al3+阻止鋁進入植物根系。
[0027]實施例12:取實施例4中鋁處理12h后的煙草根尖烘干至恒重，用灰化爐550 V灰化10 h左右，使用I mL濃硝酸溶解過夜，定容至50 mL，使用ICP法測定鋁的含量(昆明理工大學分析測試中心進行)。結果如圖12所示，對不同濃度鋁脅迫下的轉基因煙草AtPrx64-6和野生型煙草根中鋁含量的測定發現，轉基因煙草根中的鋁含量顯著低于野生型煙草。以上結果說明，轉AtPrx64煙草能通過將鋁排出根外來提高煙草對鋁脅迫的耐受性。
【主權項】
1.AtPrx64基因在提高植物鋁耐受性上的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK105861459SQ201610324315
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】李昆志, 吳遠雙, 楊志麗, 陳麗梅, 徐慧妮
【申請人】昆明理工大學