透明質酸促人羊膜干細胞增殖的方法及其應用

透明質酸促人羊膜干細胞增殖的方法及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種透明質酸促人羊膜干細胞增殖的方法及其應用。本發明將透明質酸應用在促人羊膜干細胞增殖的藥物中，通過一系列的試驗，充分證明了它能顯著縮短人羊膜干細胞（hASCs)倍增時間，促hASCs增殖，安全性好,且不影響hASCs的多向分化的干細胞潛能。可以單獨使用透明質酸，或者含有透明質酸的組合物，用于促進hASCs增殖或制造用于相同目的的醫藥品。本發明具有材料來源廣泛，成本低廉，副作用小等優點。
【專利說明】
透明質酸促人羊膜干細胞增殖的方法及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及制藥領域，特別是一種透明質酸促人羊膜干細胞增殖的方法及其應 用。
【背景技術】
[0002] 透明質酸，又稱為玻尿酸或玻璃質酸，英文名為hyaluronan或hyaluronate 或hyaluronic acid (HA)，是由葡萄糖醛酸和f乙酰氨基葡萄糖為雙糖單位通過, -1，4-糖苷鍵和_ -1，3-糖苷鍵交替連接而成的一種鏈狀高分子酸性粘多糖，分子量范圍 為5至20, OOOkDa。在自然界中，透明質酸是由透明質酸合成酶所合成，廣泛分布于動物和 人體組織的細胞外基質中（如皮膚、軟骨及眼睛玻璃體和微生物胞外莢膜等)，以其獨特的 分子結構和理化性質在機體內顯示出多種重要的生理功能。透明質酸因其優異的保水功 能，而廣泛用于精細化工領域的高端化妝品中。尤為重要的是透明質酸具有良好的生物可 降解性和組織相容性等重要特點，在醫學上也有廣泛用途，如用作骨關節炎患者的關節填 充劑、眼科手術的潤滑劑、組織工程的生物支架材料、藥物靶向傳遞及緩釋的載體等。
[0003] 透明質酸生理功能研究的報道日益增多，但其在生物醫學方面的應用潛力有待進 一步挖掘。透明質酸與人乳腺癌耐藥細胞(MCF-7/Adr)的耐藥作用相關。透明質酸與⑶44 受體結合，然后作用于腫瘤細胞的ErbB2基因，促使磷酸肌醇-3激酶在MCF-7/Adr中表 達，進一步促進Akt蛋白的活性，同時增強腫瘤細胞抗凋亡作用，而導致耐藥（The Journal of Biological Chemistry, 280(20): 20310-20315，2005);透明質酸可抑制新血管的 生成。透明質酸通過血管內皮表面受體或透明質酸結合蛋白激活信號傳導通路中的激酶， 觸發信號傳導，從而發揮其功能（Gene，226(1): 41-50，1999);透明質酸還具有良好的 免疫調節作用（Trends in Immunology, 24(3): 112-114，2003)。除此之外，研究也發 現透明質酸可以促人腫瘤細胞、臍靜脈血管內皮細胞、角質細胞、小鼠骨髓間充質細胞等 多種細胞的增殖，并維持細胞活力（重慶醫學，35(9): 811-812, 2006 ;Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 43: 930-939, 2011 ；Biomaterials, 32(1): 39-47, 2011; Journal of Dermatological Science, 72(1): 32-44, 2013)。但是，其對人羊膜干細胞 等人源性成體干細胞增殖的影響未見國內外報告。
[0004] 通過國家知識產權局網站搜索及PATENTSC0PE檢索，目前與透明質酸相關的發明 專利主要包括以下內容：透明質酸的功能開發，包括作為生物材料、藥物預致敏劑、化妝品 和保健食品的功能成分等；透明質酸的檢測、提取分離方法及生產工藝優化，以及通過傳統 誘變方法獲得透明質酸高產菌株等。近幾年也有專利涉及透明質酸基因工程菌株的構建。
[0005] 組織器官的損傷與修復是困擾人類健康的一大難題。隨著科學的發展，以干細胞 移植為核心的再生醫學，作為一種新型的人類疾病治療技術，克服了常規治療的局限性，在 治療組織器官創傷領域發揮越來越重要的作用。在臨床應用和生物學研究領域，干細胞的 主要來源有胚胎干細胞（embryonic stem cells, ESCs)、成體干細胞（adult stem cells, ASCs)和誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs)。這些細胞都 具有自我更新及定向分化的能力，但是也存在有效性、安全性與倫理問題等諸多頗受爭議 的問題。因此，尋找一種新的干細胞來源具有重要意義。研究表明，來源于人羊膜的干細 胞（human amniotic stem cells, hASCs)，擁有向三個胚層組織分化的能力，可塑性強， 無免疫原性，無致瘤性，是干細胞再生醫學領域理想的種子細胞（Natural Biotechnology 25(1) :100-106, 2007)，且hASCs可從分娩廢棄的胎盤中獲得，來源豐富、獲取簡單、不受 醫學倫理學限制。近年來，hASCs臨床前研究取得較大進展，其治療神經損傷及退行性疾 病、糖尿病、血管性疾病、心肌疾病、肺和肝纖維化等疾病方面展示出巨大潛力（中國細胞生 物學學報 33(5):590-593/33(6):720-723/33(7):830-834, 2011; Molecular Medicine Reports, 6(3): 625-630, 2012; Circulation Research, 106: 1613-1623, 2010; Cell and Tissue Research, 349(2): 447-458，2012)，是最有臨床應用前景的干細胞種子資 源。
[0006] hASCs來源廣，但因產婦個體差異也易導致所制備的干細胞質量參差不齊，影響臨 床使用效果。因此，類似其它來源干細胞的臨床應用，hASCs也無法回避的一個瓶頸問題， 即臨床再生醫學所需的干細胞數量。由此，能保持干細胞特性的體外擴增方法的探索已成 為再生醫學領域的熱點問題。如，Chen等通過添加干細胞因子SFC、IL-3和IL-6,擴增人骨 髓間充質干細胞（BMSCs)，研究結果證明BMSCs在8 d后可擴增9倍（Stem Cells, 24(9): 2052-2059，2006)。Kocaoemer等用人AB血清和凝血酶激活的富含血小板的血漿擴增 人脂肪來源間充質干細胞，證明該方法增殖倍率是胎牛血清的2倍（Stem Cells，25(5): 1270-1278，2007)。Tamama等也證實表皮細胞生長因子EGF可刺激BMSCs增殖（Stem Cells, 24(3): 686-695，2006)。這些能促進間充質干細胞增殖的外源因子，其臨床應用 存在較大的風險性，譬如，免疫原性、化學毒性等安全性問題，另外許多因子價格極其昂貴， 限制了其用于臨床。另外，目前尚未見hASCs體外高效擴增的相關報道。因而，發掘價廉易 得、安全可靠、低毒高效的"hASCs促生長劑"，具有巨大的醫療與商業價值。

【發明內容】

[0007] 本發明所要解決的技術問題在于提供一種透明質酸促人羊膜干細胞增殖的方法 及其應用，它能促進hASCs增殖，作用顯著，安全性好。
[0008] 本發明是這樣實現的：透明質酸促人羊膜干細胞增殖的方法，將培養的第二代人 羊膜干細胞收集，并以3000-5000個細胞/孔接種于96孔板中，24 h后更換L-DMEM全培養 基；然后在培養液中加入透明質酸，使透明質酸的濃度達到0. 01-20 mg/mL ;將培養板放置 在飽和濕度、質量百分比濃度為5%的0)2培養箱中，在37°C下培養12 -168 h后終止。
[0009] 所述的透明質酸的分子量為20-2200 kDa。
[0010] 所述的人羊膜干細胞包括人羊膜間充質干細胞和人羊膜上皮細胞。
[0011] 透明質酸在制備促人羊膜干細胞增殖藥物中的應用。
[0012] 將透明質酸作為唯一有效成分單獨使用，或將透明質酸作為有效組分之一的組合 物用于促人羊膜干細胞增殖或制造相同目的的生物醫藥品。
[0013] 透明質酸促hASCs增殖的作用機制涉及Wnt/ -catenin信號通路。使用經典 Wnt/ β -catenin信號通路阻斷劑Wnt-C59預處理hASCs，然后用透明質酸作用，觀察阻斷和 未阻斷條件下，透明質酸促細胞增殖的情況。添加阻斷劑的實驗組，透明質酸促hASCs增殖 的作用明顯減弱。且 Wnt/ p.-catenin 通路上 0_catenin、Wntl、Wnt3a、Wnt8a、cyclin Dl 等基因蛋白也有明顯變化。
[0014] 透明質酸可保持hASCs的干細胞生物學特性。hASCs添加透明質酸后培養 12-168h，細胞表型特征沒有變化，且在換用成骨或軟骨分化培養基后，仍可誘導hASCs向 成骨或軟骨細胞分化，不影響hASCs的多向分化的干細胞潛能。
[0015] 為了驗證本發明的技術效果，進行了如下實驗。
[0016] 一、hAMSCs和hAECs的分離、培養及形態學特征： 從新鮮胎盤組織無菌剝離羊膜，用含青霉素和鏈霉素的D-Hank' s液反復沖洗以去除 殘留血漬，剪碎羊膜，加入0. 05%胰蛋白酶-0. 2%EDTA-2Na消化液，37 ° C，200 rpm消化10 min，棄上清。再加入新鮮消化液，37 ° C，200 rpm旋轉消化30 min，300目不銹鋼濾網過 濾。同法重復消化2次，合并細胞濾液，加入等體積含10%FBS的培養基終止消化，1500rpm 離心10min，條件培養基（LG-DMEM+10%胎牛血清+l%GlutaMAX+l%非必需氨基酸+1% β -巰 基乙醇+10 ng/ml EGF)重懸細胞，接種于Τ25培養瓶中，48 h后換液，得到原代（PO)的 hAECs〇 上述剩余的組織用D-Hank's液沖洗，加入0.5 mg/ml II型膠原酶-0· 05 mg/ml DNaseI消化液，37 ° C、200 rpm旋轉消化1.5-2 h，使組織消化成薄絮狀，用300目不銹 鋼網過濾，收集細胞懸液。將細胞懸液于1500 rpm離心10 min，重懸于含10%胎牛血清的 LG-DMEM培養基，種于T25培養瓶，于37。C、5% CO2、飽和濕度下培養，得原代（PO)hAMSCs。
[0017] 上述PO的hAECs和hAMSCs，48 h后更換培養液，每天均用倒置顯微鏡觀察細胞生 長情況，當細胞生長至80%或以上融合度時，用0. 125%胰蛋白酶-0. 02%EDTA消化液消化 (約1-3 min，37° C)，加入等體積培養基終止消化，于1000 rpm離心5 min，棄去上清，將細 胞重懸于培養基中，以5 X IO5 /瓶的密度種于T25培養瓶，得Pl代hAECs和hAMSCs，依此 類推。將hAECs和hAMSCs傳代至P3,種于T25培養瓶（5X IO5/瓶)，傳代后24 h后更換培 養液，設對照組和HA組（0.6 mg/mL)，繼續培養48 h后倒置顯微鏡下觀察細胞形態。
[0018] 結果如圖1所示，hAMSCs呈典型的貼壁生長特性，原代細胞形態不一，呈梭形、多 邊形等（圖1A、B)。傳至P3后hAMSCs形態呈成纖維樣，放射狀或漩渦狀生長（圖1C、D)。經 HA (0. 6 mg/mL，本實施例使用30 kDa分子量的HA，以下實驗同)處理后的P3代hAMSCs，其 形態特征與對照組一致（圖1E、F)。以上實驗證明，hAMSCs傳代至P3細胞形態與原代保持 一致，并且培養基添加 HA不影響hAMSCs形態；hAECs的原代細胞多呈卵圓形和三角形，傳 代細胞易貼壁，呈鋪路石樣排列（圖2A、B)。
[0019] 二、hAMSCs和hAECs表型分析及免疫細胞化學染色： 將hAMSCs傳代至P3,種于T25培養瓶（5 X IO5/瓶)，傳代后24 h后更換培養液，設對照 組和HA組（0. 6 mg/mL)，繼續培養48 h，將各組細胞消化并重懸后用含0. 1% BSA的D-PBS 清洗2次，調整細胞密度至I X 106/mL，將細胞懸液加至流式管（200 μ L/管)，并按組合方案 加入小鼠抗人熒光標記抗體（CD44-PE、IgG2b-PE、CD29-PE、IgGl-FITC/PerCP-Cy5. 5/APC/ PE/IgG2a-PE、CD90-FITC/CD105-PerCP-Cy5. 5/CD73-APC/CD34-PE/CDllb- PE/CD19-PE/ CD45-PE/HLA-DR-PE)混勻，室溫避光孵育25 min，每管加入2mL含0. 1%似隊的PBS，混勻， 1000 rpm離心5 min，棄上清，200 μ L D-PBS重懸細胞，用流式細胞儀（FCM)分析各組樣品， 每份樣品的采集細胞數須大于2X IO4個，用Cell Quest軟件進行結果的分析。
[0020] 將hAMSCs傳代至P3,種于6孔板（2 X IO5 /孔)，24 h后更換培養液，設對照組和 HA組（0.6 mg/ml)，繼續培養48 h，進行波形蛋白和CK19免疫細胞化學染色。具體步驟如 下：4%多聚甲醛固定30 min ;用0. 3%Triton-X100室溫作用15 min，增加細胞的通透性；滴 加山羊血清室溫作用30 min，封閉非特異性抗原；滴加鼠抗人CK19或鼠抗人波形蛋白單克 隆抗體，4 ° C孵育過夜；滴加3% H2O2作用10 min，封閉非特異性抗原；滴加鼠兔通用型二 抗，37 ° C孵育30 min ;DAB顯色3-5 min，D-PBS清洗；蘇木素復染30s，D-PBS清洗，于倒 置顯微下鏡觀察并拍照。
[0021] 結果如圖2和圖3所示，P3代hAMSCs對照組和HA處理組都高表達⑶44、⑶29、 ⑶90、⑶105和⑶73等細胞表面分子，不表達⑶34、⑶45、⑶19、⑶14和HLA-DR (圖2A、B)。 免疫細胞化學染色結果顯示，MMSCs對照組和HA處理組都表達間充質細胞標志物波形蛋 白（圖3A、C)，不表達CK19 (圖3B、D)。因此，所分離的目標細胞具有典型的hAMSCs表型特 征。以上實施例說明，hAMSCs傳代至P3代仍保持間充質干細胞的表型特征，并且培養基添 加 HA不影響hAMSCs的表型特征。
[0022] 同樣，測得和hAECs高表達CD29、CD73和CD166,低表達CD44,不表達CD34、CD45、 ⑶71和⑶86等細胞表面分子（圖5)。另外，hAECs角蛋白CK19呈陽性（圖5A、B)。
[0023] 三、HA對hAMSCs和hAECs增殖的影響： (1)標準曲線的繪制 取處于對數生長期的P2 hAMSCs，消化并重懸后進行細胞計數，分別以1、2、4、8、16、32、 64X IO3/孔種于96孔板，各4孔，于培養箱內培養6 h后，更換新鮮培養基（100 μ 1/孔)， 再于每孔加入10 μ 1的CCK-8試劑，繼續培養I h后將板取出，用酶標儀于450 nm處檢測 各孔的吸光度值OD (此檢測方法簡稱CCK法)，繪制標準曲線。
[0024] (2) HA藥物的制備 精確稱取一定分子量的純HA干粉，溶于一定體積的LG-DMEM培養液中，微孔濾膜過濾 滅菌，所得溶液在無菌條件下裝入安剖瓶中備用。
[0025] 精確稱取一定分子量的純HA干粉，溶于一定體積的LG-DMEM培養液中，并加入一 定量的堿性成纖維細胞生長因子bFGF或表皮生長因子EGF，混勻后微孔過濾滅菌，所得溶 液在無菌條件下裝入安剖瓶中備用。
[0026] (3)量效實驗 取處于對數生長期的P2 hAMSCs，消化并重懸后進行細胞計數，以3000/孔種于96孔 板，24 h后更換培養液，設對照組、各濃度HA組（0. 01、0. 03、0. 06、0. 1、0. 3、0. 6、1 mg/ml) 和陽性組（LiCl，4 mM)，各4孔，繼續培養48 h后用CCK法進行檢測。根據OD值、標準曲線 和下列公式計算各組細胞量和增殖率。 毋秦丄 ：:娜__章； 人
[0027] (4)時效實驗 取處于對數生長期的P2 hAMSCs，消化并重懸后進行細胞計數，以3000/孔種于96孔 板，共6板。24 h后更換培養液，每板均設對照組、HA組（0.6 mg/ml)和陽性組（LiCl，4 mM)，各5孔，分別于換液后繼續培養12、24、36、48、60和72 h各取1板用CCK法進行檢測， 繪制各組細胞的生長曲線并按公式計算倍增時間。
[0028] T = tlog2/Log(N/No) T :倍增時間；t :接種至檢測細胞數時間；N :t時刻細胞數；No :接種細胞數。
[0029] 量效實驗結果如圖6A所示，0. 01-1. 0 mg/mL范圍內，HA能促進hAMSCs增殖。當HA 劑量為0. 6 mg/mL時，其增殖率達到最大為31. 9%，高于LiCl陽性藥物組的增殖率（23. 7%)。 時效結果如表1所示，在加藥后36-60 h，HA處理組和陽性藥物組的增殖速率明均顯高于對 照組，HA處理組在36-48 h增殖速率最快；并且hAMSCs經0. 6 mg/mL HA處理后，其倍增時 間由24. 8 h縮短至23. 4 h。以上實施例說明，HA可以有效的誘導hAMSCs增殖，并呈劑量 和時間依賴的關系。
[0030] 同上述，測得HA在0. 01-1. 0 mg/mL劑量范圍內對hAECs增殖的影響。如圖6B所 示，HA促hAECs增殖的作用略低于對hAMSCs的效果，但是在高于0. 06-1. 0 mg/mL劑量時仍 然有統計學顯著差異。特別是在劑量〇. 6mg/mL時，增殖率提高20. 7%。0. 06-1. Omg/mL劑 量范圍的增殖率均高于LiCl陽性對照藥物組。
[0031] 四、HA誘導hAMSCs增殖通過Wnt/ j5: -catenin信號通路 取處于對數生長期的P2代hAMSCs，消化并重懸后進行計數，以2X IO5/孔密度種于6 孔板。24 h后更換培養液，設置對照組、HA組（0.6 mg/mL)。繼續培養24 h和36 h后將 細胞取出，提取總RNA和總蛋白，通過實時熒光定量PCR檢測Wnt/ p -catenin信號通路 β -catenin、Wntl、Wnt3a、Wnt8a、c_myc、cyclin Dl、PCNA 和 Ki_67 的基因表達情況；通過 Western-blot檢測關鍵因子β -catenin和c-myc的蛋白表達情況。分別使用GAPDH和 -actin作為內參。
[0032] 基因響應結果如表2所示，經HA處理的hAMSCs，在24 h和36 h，Wntl和Wnt3a 基因表達均上調，明顯高于對照組，尤其是Wnt3a在加藥早期（24 h)轉錄水平增加了 2倍。 而0-catenin、Wnt8a、cyclin Dl和Ki_67等基因的轉錄水平在24 h時，與對照組相比無 顯著差異。但在36 h，HA組的表達均明顯高于對照組。c-myc和PCNA兩個基因的轉錄水 平在所測定的兩個時間點，與對照組相比無明顯差異。關鍵因子β-catenin和c-myc的蛋 白表達情況如圖5和表3所示，HA處理24 h后，β -catenin蛋白的表達量與對照組相比無 顯著差異，但在36 h時表達水平明顯高于對照組；Wnt/β -catenin通路革El蛋白c-myc的表 達基本不受HA的影響（圖7和表3)，與RT-qPCR的檢測結果相符。以上結果證明HA可通過 Wnt/ -catenin信號通路誘導hAMSCs增殖。
[0033] 五、Wnt通路阻斷劑Wnt-C59 (C59)對HA誘導hAMSCs增殖的影響： 取處于對數生長期的P2 hAMSCs消化并重懸后進行細胞計數，以3000/孔種于96孔 板，24 h 后更換培養液，設對照組、HA (0. 6 mg/ml)組、Wnt-C59 (100 nM)組和 Wnt-C59+HA 組，各5孔，繼續培養72 h后用CCK法檢測各細胞的增殖情況。根據標準曲線和公式分別 計算各組細胞量和增殖率。
[0034] 實驗結果如圖8所示，經典Wnt/ , -catenin信號通路的阻斷劑Wnt-C59 (100 nM)能抑制hAMSCs的增殖。與對照組相比，Wnt-C59組增殖率為-13. 3%，C59+HA組的增殖 率則為2. 7%，而HA組的增殖率則為8. 2%，細胞量顯明高于上述兩組。以上實施例說明，當 經典Wnt/ -catenin信號通路受到阻斷或抑制時，HA促進hAMSCs增殖的效應明顯降低， 進一步表明HA對hAMSCs促進增殖的作用通過經典的Wnt/ , -catenin信號通路。
[0035] 六、HA作用后的hAMSCs可向成骨細胞和軟骨細胞分化 將1^1^〇8傳代至？3，種于6孔板（2\10 5/孔)，24 11后更換含撤（0.6 11^/1111)的培 養液，繼續培養48 h。再換用成骨誘導培養基或成軟骨誘導培養基繼續培養21 d，顯微鏡 下觀察hAMSCs向成骨或軟骨細胞分化的情況。
[0036] 成骨誘導培養基：LG-DMEM培養基，含10%胎牛血清、10 7 M地塞米松、50 維生素 c和10 mM甘油磷酸鈉，每三天換一次培養基。
[0037] 成軟骨誘導培養基：LG-DMEM培養基，含1%胎牛血清、10 7 M地塞米松、50 Hg/ml 維生素 c和10 W g/ml TGF- p 3,每三天換一次培養基。
[0038] 實驗結果如圖7所示，hAMCs經HA作用48 h后，換成骨誘導培養基繼續培養21 d，hAMCs形態由梭形變成呈多角形，局部細胞聚集成團，形成較大的細胞集落和鈣化結節， 證明HA作用后的hAMCs仍保留向成骨細胞分化的能力（圖9A)。hAMCs經HA作用48 h，換 成軟骨誘導培養基繼續培養21 d，使用阿爾辛藍染色， hAMCs胞質內出現紫藍色的異染物質，呈彌漫性分布，提示經誘導后hAMCs分泌了大量 的蛋白聚糖，證明HA作用后的hAMCs仍保留向軟骨細胞分化的能力（圖9B)。
[0039] 1 尸〈0· 05，** 尸〈0· 01 vs 對照組
I *尸〈0· 05 VS對照組 七、結論 本發明證明透明質酸是良好的人羊膜干細胞增殖促進劑，其促增殖活性優于陽性藥物 氯化鋰，且不會影響人羊膜干細胞的形態和分子表型等細胞生物特性及其向成骨和軟骨細 胞分化的干細胞特性。本發明還證明透明質酸促人羊膜干細胞增殖過程中可上調Wnt/， -catenin 信號通路相關信號分子 0_catenin、Wntl、Wnt3a、Wnt8a、cyclin Dl 和 Ki_67 的 基因表達，并上調β -catenin的蛋白表達，添加 Wnt/ f|:-catenin信號通路抑制劑Wnt-C59 可減弱透明質酸的促人羊膜干細胞增殖活性，上述結果表明透明質酸促人羊膜干細胞增殖 作用機制涉及Wnt/ -catenin信號通路。
[0040] 本發明將透明質酸應用在促人羊膜干細胞增殖的藥物中，通過一些列的試驗，充 分證明了它能顯著縮短人羊膜干細胞（hASCs)倍增時間，促hASCs增殖，安全性好，且不影 響hASCs的多向分化的干細胞潛能。可以單獨使用透明質酸，或者含有透明質酸的組合物， 用于促進hASCs增殖或制造用于相同目的的醫藥品。本發明具有材料來源廣泛，成本低廉， 副作用小等優點。
【附圖說明】
[0041] 附圖1為hAMSCs形態學特征； A :P0 代 hAMSCs( X40); B :P0 代 hAMSCs( X 100); C :P3 代 hAMSCs (對照組，X40); D :P3 代 hAMSCs (對照組，X100); E: P3 代 hAMSCs (透明質酸組，X40); F: P3 代 hAMSCs (透明質酸組，X 100); 附圖2為對照組和HA組hAMSCs表型； A :對照組hAMSCs表型；B :HA處理組hAMSCs表型； 附圖3為hAMSCs波形蛋白及CK19免疫細胞化學染色（X400) A:對照組波形蛋白；B:對照組CK19; C: HA處理組波形蛋白；D: HA處理組CK19; 附圖4為hAECs形態學特征； A: PO 代 hAECs (X40);B: P3 代 hAECs (X40); 附圖5為hAECs的細胞表型分子及CK19蛋白表達情況； A: CK表達陽性，B:陰性對照； 附圖6為不同濃度HA對hAMSCs (A)和hAECs (B)增殖的影響； * 尸〈0· 05，** 尸〈0· 01 vs 對照組； 附圖7為HA對-catenin和c-myc蛋白表達的影響； 附圖8為Wnt-C59 (C59)對HA誘導hAMSCs增殖的影響； * 尸〈0· 05 vs 對照組；# 尸〈0· 05 vs HA 組； 附圖9為hAMSCs經HA作用后仍可向成骨和軟骨細胞分化； A: hAMSCs向成骨細胞分化（X 40) ;B: hAMSCs向軟骨細胞分化（X100)。
【具體實施方式】
[0042] 本發明的實施例1 :透明質酸促人羊膜干細胞增殖的方法，將培養的第二代人羊 膜上皮細胞收集，并以3000-5000個細胞/孔接種于96孔板中，24 h后更換L-DMEM全培養 基；然后在培養液中加入透明質酸，使透明質酸的濃度達到0. 01-20 mg/mL ;將培養板放置 在飽和濕度、質量百分比濃度為5%的0)2培養箱中，在37°C下培養12 -168 h后終止；所 述的透明質酸的分子量為20-2200 kDa。
[0043] 本發明的實施例2 :透明質酸在制備促人羊膜干細胞增殖藥物中的應用，透明質 酸可單用，亦可與細胞生長因子按常規方法制成粉劑或水劑。
【主權項】
1. 一種透明質酸促人羊膜干細胞增殖的方法，其特征在于：將分離培養的人羊膜干細 胞收集，并以3000-5000個細胞/孔接種于96孔板中，24 h后更換L-DMEM全培養基；然后 在培養液中加入透明質酸，使透明質酸的濃度達到〇. 01-20. 00mg/mL ;將培養板放置在飽 和濕度、質量百分比濃度為5%的0)2培養箱中，在37°C下培養12 -168 h后終止。2. 根據權利要求1所述的透明質酸促人羊膜干細胞增殖的方法，其特征在于：所述的 透明質酸的分子量為20-2200 kDa。3. 根據權利要求1所述的透明質酸促人羊膜干細胞增殖的方法，其特征在于：所述的 人羊膜干細胞包括人羊膜間充質干細胞和人羊膜上皮細胞。4. 一種透明質酸在制備促人羊膜干細胞增殖藥物中的應用。5. 根據權利要求4所述的透明質酸在制備促人羊膜干細胞增殖藥物中的應用，其特征 在于：將透明質酸作為唯一有效成分單獨使用，或將透明質酸作為有效組分之一的組合物 用于促人羊膜干細胞增殖或制造相同目的的生物醫藥品。
【文檔編號】C12N5/074GK105861425SQ201510034505
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月23日
【發明人】肖建輝, 鐘建江, 劉如明, 孫仁剛, 陳代雄
【申請人】遵義醫學院