一種提高酪酸菌生長效率的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高酪酸菌生長效率的方法，屬于食品發酵領域。本發明是一種通過降低發酵過程酸性產物的生成、促進乙醇的合成來提高酪酸菌生長效率的方法，具體為在酪酸菌三級發酵0?8 h時，開始無菌、無氧勻速流加乙醛溶液至發酵結束前4?6 h，乙醛總濃度為1.5?5.0 mmol/L。本發明將乙醛分子作為代謝調控分子使用，乙醛分子的添加促進NADH的氧化效率、顯著增強了乙醇的合成效率，而且還使乙酸、丁酸的生成效率顯著降低，進一步提高了酪酸菌的生長效率，產生了極好的技術效果。本發明具有材料易購、操作可控性高、適用于酪酸菌發酵生產的特點。
【專利說明】一種提高酪酸菌生長效率的方法
[0001]
技術領域
[0002]本發明屬于食品發酵領域，具體涉及一種提高酪酸菌生長效率的方法。
【背景技術】
[0003]除了作為重要的功能微生物在醬類、泡菜、釀酒過程發揮重要作用外，酪酸菌(丁酸梭菌，Clostridium butyrium)作為人用或動物新型益生菌具有調整腸道菌落平衡，促進腸道有益菌群增殖、增強免疫，預防腫瘤發生的功能。此外，酪酸菌在腸道產生的益生產物如B族維生素、維生素K等物質，對機體具有保健作用。酪酸菌的主要代謝產物為丁酸，對腸道上皮組織的再生和修復有很重要的意義。酪酸菌是典型的厭氧芽胞桿菌，發酵過程中在厭氧條件下大量產生丁酸、乙酸、乙醇等物質。雖然酪酸菌有一定的耐酸性，但這些酸分子大量積累還是會對其生長、代謝產生嚴重的酸脅迫抑制作用，從而降低其生長效率。因此，有針對性地解除或緩解酪酸菌酸性代謝產物(乙酸、丁酸等)對其本身生長的抑制作用，實現丁酸梭菌的高密度培養，已成為研究和開發丁酸梭菌微生態制劑的關鍵技術。
[0004]通過發酵過程中加入堿性物質如:氫氧化鈉、氨水、碳酸氫鈉、碳酸鈉等可以中和菌體代謝產生的有機酸，維持PH穩定在設定值。如:對比文獻I (采用分批補料發酵法制備酪酸菌活菌制劑的方法，發明專利CN201110287802.1，2011)公開了酪酸菌發酵中補入氨水控制PH的方法;對比文獻2(酪酸菌發酵培養基及其制備方法與酪酸菌培養發酵方法，發明專利CN201410089743.0，2014)公開了用堿控制發酵培養基的起始pH為7.4-7.5等;對比文獻3(一種連續發酵法生產酪酸菌制劑的方法，發明專利CN201210135950.6，2012)公開了一種連續發酵生產酪酸菌的方法，用堿控制發酵起始PH6.0-7.5；對比文獻4(酒窖窖泥中丁酸梭菌的分離及其特性研究，謝樹貴，微生物學通報，2007，34(6): 1047-1051)確定了丁酸梭菌的最適初始PH以及通過流加碳酸鈉溶液控制pH值在6.5。
[0005]顯然，對比文獻1、2、3、4均沒有涉及酪酸菌在發酵過程中的酸、醇代謝特點以及醇酸代謝壓力和調控的內容，而是采用通常的技術手段用堿性物質來中和。雖然現有技術可以控制發酵環境的PH以適于酪酸菌生長，但若能緩解酪酸菌細胞在厭氧條件下的生理代謝壓力，從還原型輔酶I(NADH)氧化的角度進行調控，則可能會使酪酸菌生長的效率進一步地提尚O
[0006]在厭氧條件下細胞生長代謝過程中由糖酵解途徑(EMP)產生的NADH，可經脫氫酶催化反應(如:乙醇脫氫酶、丁醇脫氫酶)或通過生成丁酰CoA來氧化，并通過EMP途徑、乙酸合成以及丁酸合成獲得ATP滿足生長需求。但是，乙酸、丁酸的積累也會加重細胞的代謝負擔，引起酸脅迫效應。這必然會嚴重的影響細胞的生理代謝和細胞的活性，并引起細胞自溶。而生成乙醇類有機物質，則可以減弱酸中毒效應。因此，若能在厭氧條件下增加NADH經乙醇合成途徑的氧化效率，則可能會使細胞活性得以維持，并進一步促進細胞生長。選擇合適的受氫體作為代謝調控分子可能會實現上述目的。
[0007]乙醛作為構建雜環環系試劑，常用于有機化工行業，也用作食品行業水果香精的調配劑。但是，沒有把乙醛分子作為代謝因子應用于厭氧微生物一酪酸菌培養過程的新功能的報道，即:乙醛作為代謝調控分子，通過促進酪酸菌胞內乙醇脫氫酶的活性來增強乙醇的生成效率、還可能緩解酸中毒效應并進一步提高酪酸菌細胞生長效率的新功能的報道。
【發明內容】
[0008]本發明目的在于提供一種提高酪酸菌生長效率的新方法，其是一種通過降低發酵過程酸性產物的生成、促進乙醇的合成來提高酪酸菌生長效率的方法。
[0009]本發明目的通過下述技術方案實現:
一種提高酪酸菌生長效率的方法，為在酪酸菌發酵時流加乙醛;優選為:在酪酸菌發酵0-8 h時，開始無菌、無氧流加乙醛溶液至發酵結束前4-6 h，乙醛總濃度為1.5-5.0 mmol/L，即每升發酵液流加乙醛的量為1.5-5.0 mmol。所述的無菌、無氧流加乙醛溶液通過包括如下步驟的方法實現:將玻璃兩通藍蓋補料瓶改造成三通藍蓋補料瓶，其中兩通連接過濾器，第三通通過硅膠管連接補料針頭。滅菌后，將瓶裝氮氣通過管件連接在三通藍蓋補料瓶的一個過濾器上，經過濾的無菌氮氣通入補料瓶瓶底，鼓泡置換空氣后，滅菌的針頭在火焰保護下扎入發酵罐蓋的補料口，通過蠕動栗進行乙醛溶液補料。所述的發酵優選為三級發酵，三級發酵的時間優選為24 ho
[0010]優選的，所述的提高酪酸菌生長效率的方法用到的培養基的配制如下:葡萄糖16.6 8/1、酵母粉7.2 8/1、碳酸鈣4.7 g/L、蛋白胨25 8/1、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水硫酸鎂0.8 g/L、一水硫酸錳0.02 g/L，pH7.3;厭氧管斜面培養基需另外加入瓊脂，瓊脂濃度20g/L。除氧后經0.1 MPa蒸氣滅菌20 min備用。
[0011]更優選的，所述的提高酪酸菌生長效率的方法，包括如下步驟:
(I)種子擴大培養與合瓶種子細胞的收集
按無菌、無氧操作要求，從酪酸菌菌種凍干管接出細胞至新制備的厭氧管斜面培養基。36-38°C培養12-16 h后，按無菌、無氧操作要求，加入10 mL無菌、無氧水制備厭氧管種子液。
[0012]120 mL厭氧瓶裝培養基30 mL，按1-2%的比例(v/v)將酪酸菌(Clostr idiumbutyrium)厭氧管種子液接入厭氧瓶液體培養基中，36_38°C、100 r/min在搖床上培養12-
14h得到厭氧瓶種子液。按無菌、無氧操作要求，將厭氧瓶種子液進行合瓶操作，得到合瓶種子液。
[0013](2) 二級種子培養
裝有培養基的二級種子罐滅菌(10 L)、氮氣置換除氧后，火焰保護下將合瓶種子液接入二級種子罐，按如下條件進行二級種子發酵培養:培養溫度36-38°C，轉速為100 r/min,氮氣流量控制為0.1 vvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護3 h后，停止通氮氣，發酵培養12-14 h后，得二級種子液。
[0014](3)三級發酵
裝有培養基的三級發酵罐(100 L)滅菌、氮氣置換除氧后，將二級種子液以1-2%的接種量(v/v)移種至三級發酵罐，按如下條件進行三級發酵:發酵溫度36-38°C，轉速100 r/min,氮氣流量控制為0.lvvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護3 h后，停止通氮氣。發酵培養24 h后，放罐。三級發酵培養0-8 h時，開始無菌、無氧勻速流加補入乙醛溶液至發酵結束前4-6 h，使乙醛總濃度為1.5-5.0 mmol/L。優選的:三級發酵培養3 h時，開始無菌、無氧勾速流加補入乙醛溶液至發酵結束前4 h，乙醛總濃度為2.0 mmol/L。
[0015]好氧補料技術運用到厭氧發酵過程，還需要克服技術上的一些困難，包括料液以及兩通藍蓋補料瓶連接件的厭氧環境的保持(100 L通用攪拌發酵罐系統)。本發明為了保證無菌、無氧流加乙醛溶液，在普通兩通(無菌空氣進瓶通路和料液出瓶通路)玻璃藍蓋瓶的基礎上進行了改造，將兩通不銹鋼件打孔、焊接，接出第三通，得到三通玻璃藍蓋補料瓶，其中兩通連接過濾器(過濾精度0.22 MO，第三通通過硅膠管連接補料針頭。滅菌后，將瓶裝氮氣通過管件連接在三通玻璃藍蓋補料瓶的一個過濾器上，經過濾的無菌氮氣直接通入補料瓶瓶底，輕微鼓泡置換空氣30 min(氣體直接從三通玻璃藍蓋補料瓶上連接過濾器的第二通溢出瓶外)后，打開經硅膠管連接在第三通的包扎滅菌的針頭，火焰保護下扎入罐頂補料口。通過蠕動栗按要求進行乙醛溶液補料。
[0016]與現有技術相比本發明具有如下優點和顯著的進步:按本發明進行操作，不將乙醛分子作為有機化工試劑和食品行業調香劑，而是作為代謝調控分子使用。本發明具有材料易購、操作可控性高、適用于發酵生產的特點。乙醛分子的添加促進NADH的氧化效率、顯著增強了乙醇的合成效率(放罐時乙醇濃度增加了 11.7-29.7%)。而且，還產生了出人意料的效果:乙醛分子的添加使乙酸、丁酸的生成效率顯著降低，放罐時分別降低了28.7-42.1%和22.2-57.8%。這樣，酪酸菌厭氧發酵過程中，由于乙酸和丁酸的積累對細胞產生的酸中毒效應也得到有效地緩解，并促進了細胞活性的維持，進一步提高了酪酸菌的生長效率，放罐時酪酸菌活細胞數提高了 15.1-28.1%，產生了極好的技術效果。這是與現有技術最明顯的不同。
【具體實施方式】
[0017]下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0018]實施例1
(I)培養基的制備
葡萄糖20 g/L，蛋白胨30 g/L，酵母粉20 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，輕質碳酸鈣I 8/1，一水硫酸錳0.02 g/L，pH7.3;厭氧管斜面培養基需另外加入瓊脂，瓊脂濃度20;pH 7.3。除氧后經0.1 MPa蒸氣滅菌20 min備用。
[0019](2)種子擴大培養與合瓶種子細胞的收集
按無菌、無氧操作要求，從酪酸菌菌種凍干管接出細胞至新制備的厭氧管斜面培養基。37°C培養12 h后，按無菌、無氧操作要求，加入10 mL無菌、無氧水制備厭氧管種子液。
[0020]120 mL厭氧瓶裝培養基30 mL，按1%的比例(v/v)將酪酸菌(Clostr idiumbutyrium)厭氧管種子液接入厭氧瓶液體培養基中，37°C、100 r/min在搖床上培養12 h得到厭氧瓶種子液。按無菌、無氧操作要求，將厭氧瓶種子液進行合瓶操作，得到合瓶種子液。
[0021](3) 二級種子培養
裝有培養基的二級種子罐滅菌(10 L)、氮氣置換除氧后，火焰保護下將合瓶種子液按1%的比例(v/v)接入二級種子罐，按如下條件進行二級種子發酵培養:培養溫度37°C，轉速為100 r/min，氮氣流量控制為0.1 vvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護3 h后，停止通氮氣，發酵培養12 h后，得二級種子液。
[0022](4)三級發酵
裝有培養基的三級發酵罐(100 L)滅菌、氮氣置換除氧后，將二級種子液以1%的接種量(v/v)移種至三級發酵罐，按如下條件進行三級發酵:發酵溫度37°C，轉速100 r/min，氮氣流量控制為0.1vvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護3 h后，停止通氮氣。發酵培養24h后，放觸。
[0023]采用上述酪酸菌通用種子培養基和發酵培養基，按上述方式厭氧發酵24h，細胞數(以Hungate滾管計數法進行菌落CFU計數)為2.6 X 18 CFU/mL，發酵液中的乙醇濃度為89 mg/L、乙酸濃度為251 mg/L、丁酸濃度為4.5 g/L。
[0024]實施例2
(I)培養基的制備
葡萄糖16.6 g/L、酵母粉7.2 g/L、碳酸|丐4.7 g/L、蛋白胨25 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水硫酸鎂0.8 g/L、一水硫酸錳0.02 g/L，pH7.3;厭氧管斜面培養基需另外加入瓊脂，瓊脂濃度20 g/L。除氧后經0.1 MPa蒸氣滅菌20 min備用。
[0025](2)種子擴大培養與合瓶種子細胞的收集
按無菌、無氧操作要求，從酪酸菌菌種凍干管接出細胞至新制備的厭氧管斜面培養基。37°C培養12 h后，按無菌、無氧操作要求，加入10 mL無菌、無氧水制備厭氧管種子液。
[0026]I 20 mL厭氧瓶裝培養基3 O mL，按1%的比例(v/v)將酪酸菌(Clostridiumbutyrium)厭氧管種子液接入厭氧瓶液體培養基中，37°C、100 r/min在搖床上培養12 h得到厭氧瓶種子液。按無菌、無氧操作要求，將厭氧瓶種子液進行合瓶操作，得到合瓶種子液。
[0027](3) 二級種子培養
裝有培養基的二級種子罐滅菌(10 L)、氮氣置換除氧后，火焰保護下將合瓶種子液按1%的比例(v/v)接入二級種子罐，按如下條件進行二級種子發酵培養:培養溫度37°C，轉速為100 r/min，氮氣流量控制為0.1 vvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護3 h后，停止通氮氣，發酵培養12 h后，得二級種子液。
[0028](4)三級發酵
裝有培養基的三級發酵罐(100 L)滅菌、氮氣置換除氧后，將二級種子液以1%的接種量(v/v)移種至三級發酵罐，按如下條件進行三級發酵:發酵溫度37°C，轉速100 r/min，氮氣流量控制為0.1vvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護3 h后，停止通氮氣。發酵培養24h后，放觸。
[0029]采用上述優選的培養基，按上述方式厭氧發酵24h，細胞數(以Hungate滾管計數法進行菌落CFU計數)為5.7 X 18 CFU/mL，比實施例1提高了2.2倍。而且，發酵液中的乙醇濃度為111 mg/L，比實施例1提高了 24.7%。發酵液中的乙酸濃度為188 mg/L，比實施例1降低了75%。發酵液中的丁酸濃度為2.7 g/L，比實施例1降低了60%。取得了出人意料的結果。另外，實施例2所采用的優選培養基配方所用葡萄糖、酵母粉和蛋白胨分別比實施例1所用的濃度降低了 17%、64%和17%，極大的節約了原材料成本。
[0030]實施例3
(I)培養基的制備:同實施例2。
[0031](2)種子液擴大培養與合瓶種子細胞的收集:同實施例2。
[0032](3)二級種子培養:同實施例2。
[0033](4)三級發酵:除補加調控因子外，三級發酵其余條件同實施例2。
[0034]調控因子補加:三級發酵培養開始時，無菌、無氧勻速流加乙醛溶液(濃度為0.2mol/L)至發酵結束前4 h，乙醛總濃度為3.0 mmol/L。
[0035]按上述方式厭氧發酵24h，細胞數(以Hungate滾管計數法進行菌落CFU計數)為6.56 X 18 CFU/mL，比實施例2提高了 15.1%;發酵液中的乙醇濃度為124 mg/L，比實施例2提高了 11.7%;乙酸濃度為132 mg/L，比實施例2降低了29.8%; 丁酸濃度為2.I g/L，比實施例2降低了 22.2%。
[0036]實施例4
(I)培養基的制備:同實施例2。
[0037](2)種子液擴大培養與合瓶種子細胞的收集:同實施例2。
[0038](3)二級種子培養:同實施例2。
[0039](4)三級發酵:除補加調控因子外，三級發酵其余條件同實施例2。
[0040]調控因子補加:三級發酵培養周期為6h時，開始無菌、無氧勻速補入乙醛溶液(濃度為0.2 mol/L)至發酵結束前4 h，乙醛總濃度為1.5 mmol/L。
[0041]按上述方式厭氧發酵24h，細胞數(以Hungate滾管計數法進行菌落CFU計數)為6.91 X 18 CFU/mL，比實施例2提高了 21.2%;發酵液中的乙醇濃度為130 mg/L，比實施例2提高了17.1%;乙酸濃度為134 mg/L，比實施例2降低了28.7%; 丁酸濃度為1.83 g/L，比實施例2降低了 32.2%。
[0042]實施例5
(I)培養基的制備:同實施例2。
[0043](2)種子液擴大培養與合瓶種子細胞的收集:同實施例2。
[0044](3)二級種子培養:同實施例2。
[0045](4)三級發酵:除補加調控因子外，三級發酵其余條件同實施例2。
[0046]調控因子補加:三級發酵培養周期為3h時，開始無菌、無氧勻速補入乙醛溶液(濃度為0.2 mol/L)至發酵結束前4 h，乙醛總濃度為2.0 mmol/L。
[0047]按上述方式厭氧發酵24h，細胞數(以Hungate滾管計數法進行菌落CFU計數)為7.3 X 18 CFU/mL，比實施例1提高了 28.1%;發酵液中的乙醇濃度為144 mg/L，比實施例2提高了 29.7%;乙酸濃度為109 mg/L，比實施例2降低了 42.1%; 丁酸濃度為1.14 g/L，比實施例
2降低了 57.8%。
[0048]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:所述的方法為:在酪酸菌發酵O-Sh時，開始無菌、無氧勻速流加乙醛溶液至發酵結束前4-6h，乙醛總濃度為1.5-5.0mmol/L; 所述的無菌、無氧流加乙醛溶液通過包括如下步驟的方法實現:將玻璃兩通藍蓋補料瓶改造成三通藍蓋補料瓶，其中兩通連接過濾器，第三通通過硅膠管連接補料針頭；滅菌后，將瓶裝氮氣通過管件連接在三通藍蓋補料瓶的一個過濾器上，經過濾的無菌氮氣通入補料瓶瓶底，置換空氣后，滅菌的針頭在火焰保護下扎入補料口，通過蠕動栗進行乙醛溶液補料。2.根據權利要求1所述的提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:所述的發酵為三級發酵，三級發酵的時間為24h。3.根據權利要求1所述的提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:酪酸菌發酵所用到的培養基的配制如下:葡萄糖16.6g/L、酵母粉7.2g/L、碳酸鈣4.7g/L、蛋白胨25g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、七水硫酸鎂0.8g/L、一水硫酸錳0.02g/L，pH7.3;厭氧管斜面培養基需另外加入瓊脂，瓊脂濃度20g/L;除氧后滅菌。4.根據權利要求1所述的提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)種子擴大培養與合瓶種子細胞的收集 按無菌、無氧操作要求，從酪酸菌菌種凍干管接出細胞至厭氧管斜面培養基;36-38°C培養12-16h后，按無菌、無氧操作要求，加入1mL無菌、無氧水制備厭氧管種子液； 120mL厭氧瓶裝培養基30mL，按1-2%的比例將酪酸菌厭氧管種子液接入厭氧瓶液體培養基中，36-38°C、100r/min在搖床上培養12-14h得到厭氧瓶種子液;按無菌、無氧操作要求，將厭氧瓶種子液進行合瓶操作，得到合瓶種子液； (2)二級種子培養 裝有培養基的二級種子罐滅菌、氮氣置換除氧后，火焰保護下將合瓶種子液接入二級種子罐，按如下條件進行二級種子發酵培養:培養溫度36-380C，轉速為lOOr/min，氮氣流量控制為0.1vvm，罐壓控制為0.03-0.04MPa，厭氧保護3h后，停止通氮氣，發酵培養12_14h后，得二級種子液； (3)三級發酵 裝有培養基的三級發酵罐滅菌、氮氣置換除氧后，將二級種子液以1-2%的接種量移種至三級發酵罐，按如下條件進行三級發酵:發酵溫度36-380C，轉速lOOr/min，氮氣流量控制為0.1vvm,罐壓控制為0.03-0.04MPa，厭氧保護3h后，停止通氮氣;發酵培養24h后，放罐； 三級發酵培養O-Sh時，開始無菌、無氧勻速流加補入乙醛溶液至發酵結束前4-6h，使乙醛總濃度為1.5-5.0mmol/L。5.根據權利要求4所述的提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:所述的二級種子罐為10L發酵罐，所述的三級發酵罐為100L發酵罐。6.根據權利要求4所述的提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:在三級發酵培養3h時，開始無菌、無氧勻速補入乙醛溶液至發酵結束前4h，乙醛總終濃度為2.0mmol/L。
【文檔編號】C12N1/38GK105861410SQ201610356765
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月26日
【發明人】王志, 夏會麗, 陳雄, 李冬生
【申請人】湖北工業大學