豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株及其疫苗制備和應用

豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株及其疫苗制備和應用
【專利摘要】本發明公開了一種豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株及其疫苗制備和應用。該突變株命名為streptococcus suis type 2mSly(P353L)?SC?19，其保藏編號為：CCTCC M 2016077。所述突變株中溶血素基因堿基序列上1056bp至1059bp的基因序列為TTA。該突變株結合了基因缺失疫苗和毒力因子免疫保護研究的優點，使菌株既缺失豬鏈球菌II型溶血素的毒性，又具有溶血素蛋白的免疫源性。該菌株特點仍然表達完整的溶血素蛋白，但是不具有溶血活性，該菌株對細胞的毒性大大降低；菌株的溶血素溶血活性突變后，仍然能激活機體產生溶血素蛋白的抗體，具有很好的保護效應。CCTCC M 201607720160229
【專利說明】
豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株及其疫苗制備和 應用
技術領域
[0001] 本發明涉及動物基因工程技術領域，具體地指一種豬鏈球菌2型溶血素溶血活性 基因突變株及其疫苗制備和應用。
【背景技術】
[0002] 豬鏈球菌病是由多種致病性鏈球菌引起的一種人畜共患的急性熱性傳染病。《中 華人民共和國動物防疫法》把該病列為二類動物疫病。豬鏈球菌在自然界分布很廣，水、塵 埃、動物體表及消化道、呼吸道、泌尿生殖道黏膜和乳汁等都有存在，而且豬鏈球菌的血清 型眾多。這對豬鏈球菌的防控提出了較高的要求。豬鏈球菌2型（Streptococcus suis Serotype 2，簡稱SS2)是一種重要的人畜共患病。1968年丹麥首次報道了人感染豬鏈球菌 導致腦膜炎的病例。1998年在中國江蘇首次報道人感染豬鏈球菌病例。2005年在四川資陽 地區發生的豬鏈球菌2型引起的鏈球菌導致的215感染、并造成38人死亡，引起社會的高度 關注，并極大的提高了人們對豬鏈球菌的衛生防控的意識。
[0003] 目前對于豬鏈球菌病的防控主要依賴于豬場的綜合管理、菌苗的免疫、藥物預防 等。而現在由于大量耐藥菌株的出現，藥物治療及藥物預防的效果急劇下降。針對豬鏈球菌 病現在市場上主要使用的是滅活疫苗，但是滅活苗存在較多的缺陷：
[0004] 1)滅活疫苗接種后在動物體內不能繁殖，因此免疫劑量較大，而且一般要加入免 疫佐劑來增強其免疫效果，保護期也相對較短；
[0005] 2)滅活疫苗常需多次接種，往往1次免疫不能產生較強的免疫保護效果，僅僅是 "初始化"免疫系統，必須進行第二次加強免疫才能產生較強的免疫保護；
[0006] 3)由于豬鏈球菌各血清型之間交叉免疫力弱，單一或者二聯甚至多聯滅活疫苗并 不能對更多的血清型的豬鏈球菌進行保護。

【發明內容】

[0007] 本發明目的是提供了一種豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株及其疫苗制備 和應用，結合了基因缺失疫苗和毒力因子免疫保護研究的優點，使菌株既缺失豬鏈球菌II 型溶血素的毒性，又具有溶血素蛋白的免疫源性。該菌株特點仍然表達完整的溶血素蛋白， 但是不具有溶血活性，該菌株對細胞的毒性大大降低;菌株的溶血素溶血活性突變后，仍然 能激活機體產生溶血素蛋白的抗體，具有很好的保護效應。
[0008] 為實現上述目的，本發明提供的一種豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株，所 述突變株命名為streptococcus suis type 2mSly(P353L)-SC_19(以下簡稱：mSly (P353L)-SC-19)，該突變株于2016年2月29日送交湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養 物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為:CCTCC M 2016077。
[0009] 進一步地，所述突變株中溶血素基因堿基序列上1056bp至1059bp的基因序列為 TTA，如序列表SEQ ID NO: 1是溶血素基因的ORF序列所示。
[0010] 本發明的溶血素溶血活性突變體的思路是:先將溶血素溶血活性關鍵位點的基因 缺失，再將改造后的這部分基因補回到染色體上(如圖1)，使得菌株的溶血素表達不受障礙 但是毒性降低。
[0011] 構建的思路為:設計引物分別擴增Sly基因的上、下游同源臂，經過融合后得到大 約為800bp，將其連接到自殺性質粒pSET4s上構建重組穿梭質粒(pSET4s-sly-del353)，再 將重組質粒電轉化到豬鏈球菌2型SC-19中，利用溫度和抗性篩選，使其發生雙交換，獲得溶 血素基因堿基序列從l〇53bp到1393bp(包含1056bp至1059bp、即翻譯353位氨基酸的密碼子 區域)的基因片段缺失突變體DEL(353)-SC-19。
[0012] 再以左臂上游引物和右臂下游引物擴增包含溶血素1053bp到1393bp包含353位氨 基酸位點的基因片段，大約為1200bp并連接到pSET4s質粒上，獲得重組質量pSET4s-sly，并 以這個質粒為模版，將353位點的CCA基因序列突變為TTA，密碼子由氨基酸從脯氨酸(P)變 為亮氨酸(L)如序列表SEQ ID N0:2所示，獲得重組質粒pSET4S-Sly-P353L。將重組質粒轉 化到上一步所得的DEL(353)-SC-19菌株中，利用溫度和抗性篩選，使其發生雙交換，獲得溶 血素353位氨基酸從P變為L并伴隨溶血活性喪失毒力降低的突變體mSly(P353L)-SC-19。
[0013] 上述豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株構建具體方法，包括以下步驟：
[0014] 1)以豬鏈球菌2型05ZYH33株全基因組為模板，設計三個引物對，分別為：
[0015] a.上游同源臂正反向引物：
[0016] SLY-SacI-Ll:ACCATTAGAGCTCAATTTTGATGCCGTG，
[0017] SLY(P353L)-R1：TCTCCACCACTCAAATAAATTGAGTTTTCCG；
[0018] b.下游同源臂正反向引物：
[0019] SLY(P353L)-L2:GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，
[0020] SLY-BamHI-R2：GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；
[0021] c .353位點點突變的引物：
[0022] SLY-P353L-L：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC,
[0023] SLY-P353L-R：GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；
[0024] 2)從豬鏈球菌II型中野生菌株SC-19中提取細菌基因組；
[0025] 3)以細菌基因組為模板，用上述上游同源臂正反向引物對和下游同源臂正反向引 物對進行PCR，純化回收得到上游同源臂PCR產物和下游同源臂PCR產物，將上游同源臂PCR 產物和下游同源臂PCR產物進行融合PCR，得到融合產物sly-del353;
[0026] 4)以細菌基因組為模板，用上游同源臂的正向引物SLY-SacI-Ll和下游同源臂的 反向引物SLY-BamHI-R2擴增基因組全長基因片段s Iy;
[0027] 5)用SacI和BamHI將融合產物sly-del353、基因組全長基因片段sly和載體pSET4s 分別進行雙酶切，得到線性化的融合產物sly-del353、線性化的基因組全長基因片段sly和 線性化的載體pSET4s;
[0028] 6)將線性化的融合產物Sly-del353和線性化的基因組全長基因片段sly分別與線 性化的載體pSET4s連接，得到兩個重組質粒，命名為pSET4s-sly-del353和pSET4s-sly;
[0029] 7)以pSET4s-sly為模板，用353位點點突變的引物對進行PCR，得到質粒pSET4s-sly-P353L；
[0030] 8)將豬鏈球菌II型中野生菌株SC-19制作電轉感受態細胞SC-19,將步驟6)中得到 的重組質粒pSET4s-sly-del353加入到感受態細胞SC-19中進行電轉，復蘇后涂布得到平板 上培養，得到單菌落；
[0031] 9)步驟8)單菌落利用SLY-SacI-Ll、SLY-BamHI-R2引物進行PCR擴增鑒定，能擴增 得到一條SOObp條帶的菌落即為電轉成功的菌落，利用溫度和抗性誘導質粒和基因組發生 重組交換，利用SLY-SacI-Ll、SLY-BamHI-R2引物進行PCR擴增鑒定，檢測得到一條且僅有一 條800bp條帶的菌落即為缺失突變體DEL(353)-SC-19;
[0032] 10)將缺失突變體DEL(353)-SC-19制作電轉感受態細胞DEL(353)-SC-19,將步驟 6)中得到的pSET4s-sly-P353L質粒電轉到感受態細胞SC-19中，同步驟9)中，利用溫度和抗 性誘導質粒和細菌基因組發生重組交換，利用SLY-SacI-Ll、SLY-BamHI-R2引物進行PCR擴 增，能擴增得到且僅有一條1200bp條帶的菌株，為篩選得到正確的菌株，命名為豬鏈球菌2 型溶血素溶血活性基因突變株streptococcus suis type 2mSly(P353L)-SC_19。
[0033] 進一步地，所述步驟3)中，上游同源臂PCR產物和下游同源臂PCR產物的PCR條件： PCR反應體系：
L0037J 再進一步地，所述步驟3)中，融合PCR的條件，
[0038] PCR反應體系：


[0056] 本發明通過溶血活性、細胞毒性、小鼠致死率等方面來比較豬鏈球菌2型溶血素溶 血活性基因突變株與野生菌株SC-19的毒力差別，證實溶血素溶血活性基因突變株在溶血 素蛋白溶血活性喪失后，毒力大大降低。
[0057]為了評價溶血素溶血活性基因突變株制備的豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變疫 苗在豬鏈球菌2型感染中的應用，用制備的豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變疫苗對實驗動 物35-43日齡的昆明鼠上進行免疫，進行安全性評價和免疫效果的評價。
[0058]本發明提供了一種上述豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株在制備防治豬鏈 球菌病的疫苗中應用。
[0059]進一步地，所述制備防治豬鏈球菌病的疫苗的方法:將突變株放置于含有5%新生 牛血清的TSB液體培養基中培養，離心收集菌體，PBS清洗菌體，然后向菌體中加入PBS，即得 到疫苗，其中，每毫升中突變株的數量為2~8*10~7。
[0000] 再進一步地，所述TSB液體培養基制備方法:稱取Tryptic Soy Broth粉劑30g溶解 于IL的單蒸水中，121度滅菌20分鐘后備用。
[0061] 本發明的有益效果在于：
[0062] 本發明通過改造豬鏈球菌2型的溶血素蛋白的溶血活性大大降低豬鏈球菌2型對 細胞的毒性，從而達到降低豬鏈球菌的毒性。基于菌株是在基因水平的改造，且實驗驗證也 具有非常好的遺傳的穩定性，不存在毒力返強的風險。由于現有的針對溶血素蛋白的研究 較多，溶血素突變體毒力減弱的機制和溶血素蛋白免疫保護也相對清楚:溶血素本身是一 個免疫原性蛋白，對溶血素溶血活性進行突變的處理，一方面降低細菌的毒力，另外一方面 溶血活性突變的蛋白仍可以激起機體的保護性免疫，產生針對溶血素的抗體，安全性高。動 物實驗證實溶血活性突變株免疫小鼠后能夠保護免疫小鼠抵抗豬鏈球菌2型強毒株SC-19 的攻擊，且制作工藝簡單，成本低，為有效控制我國鏈球菌病的發生與流行提供可靠的工 具。
[0063] 本發明相對于常規的溶血素基因缺失疫苗株的優點在于溶血活性突變株仍能夠 表達無細胞毒性的溶血素蛋白，免疫動物后能激活動物的免疫保護。
[0064] 本發明疫苗結合了基因工程和毒力因子免疫保護兩方面的優勢。基因缺失疫苗的 特點是疫苗株缺失鏈球菌的主要毒力因子，以降低菌株毒力達到免疫安全范圍且達到免疫 保護的效果。而對毒力因子研究表明免疫保護主要取決于豬鏈球菌II型的多種毒力因子， 其具有很好的免疫源性，而且很多研究學者證實莢膜多糖、類M蛋白聯合細胞外因子EF、溶 血素這些蛋白在免疫動物后有很較好的免疫保護作用。本突變體利用基因工程手段，在基 因組水平對菌株進行改造，使得毒力因子表達，但極大降低毒性，使得菌株毒力降低且具備 免疫保護效果。
【附圖說明】
[0065]圖1:豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變體構建的技術路線圖；
[0066]圖2:溫敏型自殺性質粒pSET4s-sly-del353的構建流程圖；
[0067]圖3:溫敏型自殺性質粒pSET4s-sly_P353L的構建流程圖；
[0068] 圖4:溫敏型自殺性質粒pSET4s-s Iy和pSET4s-s ly-de 1353鑒定結果，
[0069] 圖中，M為marke;r、l為pSET4s-sly，2、3為pSET4s-sly-del353,4為pSET4s-sly空白 載體對照；
[0070] 圖5:溫敏型自殺性質粒pSET4s-sly-P353L定點突變測序的結果；
[0071]圖6:溶血素部分基因缺失突變體DEL (3 5 3) -SC-19的PCR鑒定結果；
[0072] 圖中，M為marker，l-10為在SPC抗性平板上未生長、在普通TSA平板上生長的菌落； 其中7號樣品在發生雙交換后回復為野生菌株，11為陰性對照、12為野生菌株對照；
[0073]圖7:溶血素溶血活性突變菌株mSly(P353L)-SC-19的PCR鑒定結果；
[0074] 圖中，M為marker，1-9為在SPC抗性平板上未生長、在普通TSA平板上生長的菌落， 10為陰性對照，11為野生菌株SC-19對照；
[0075]圖8:溶血素溶血活性突變菌株mSly(P353L)-SC-19溶血素全長基因擴增后測序結 果；
[0076] 圖9:豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變菌株mSly(P353L)-SC-19與野生菌株SC-19 的生長曲線；
[0077] 圖10:溶血素溶血活性突變體mSly(P353L)-SC_19和野生菌株溶血活性比較結果；
[0078] 圖11:豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變菌株mSly(P353L)-SC-19分泌溶血素蛋 白；
[0079] 圖中，M為marker，1為SC-19分泌上清，2為實驗室保存溶血素全長片段的缺失株Λ sly-SC-19，3為DEL(353)-SC-19，4為mSly(P353L)-SC-19;
[0080] 圖12:豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變菌株mSly(P353L)-SC-19與野生菌株SC-19對RAW細胞和THP1細胞的毒性比率，
[0081]圖中，NC為空白對照，positive control為陽性對照，即細胞完全裂解后釋放全部 胞內的LDH;
[0082]圖13:豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變菌株mSly(P353L)-SC-19的安全性實驗； [0083]圖14:豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變菌株在免疫小鼠后的抗體水平；
[0084]圖15:豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變菌株免疫后強攻毒后小鼠的存活情況； [0085]表1:溶血實驗上清吸光值測定。
【具體實施方式】
[0086]為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但 本發明的內容不僅僅局限于以下實施例。
[0087] 實施例1
[0088] 一、引物設計和重組質粒構建
[0089] (1)根據GenBank上公布的豬鏈球菌2型05ZYH33株全基因組設計引物，包括 [0090] 上游同源臂正反向引物：
[0091 ] SLY-SacI-Ll:ACCATTAGAGCTCAATTTTGATGCCGTG，
[0092] SLY(P353L)-R1：TCTCCACCACTCAAATAAATTGAGTTTTCCG；
[0093] 下游同源臂正反向引物：
[0094] SLY(P353L)-L2：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC,
[0095] SLY-BamHI-R2：GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；
[0096] 353位點點突變的引物：
[0097] SLY-P353L-L：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC,
[0098] SLY-P353L-R：GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；
[0099] (2)獲得豬鏈球菌II型基因組:從豬鏈球菌II型中野生菌(分離株)SC-19中提取細 菌基因組。
[0100] (3)PCR擴增目的片段：以豬鏈球菌2型SC-19基因組中分別用上游同源臂正反向引 物、和下游同源臂正反向引物擴增上、下游同源臂后PCR后并進行融合，融合后片段大約為 800bp(圖 2)。
[0101] 再以上游同源臂的正向引物SLY-SacI-Ll和下游同源臂的反向引物SLY-P353L-R2 擴增基因組上全長基因片段，片段長度大約為1.2Kb(圖3)。
[0102] (4)酶切連接:兩個片段及載體pSET4s經過SacI和BamHI以下雙酶切體系雙酶切 后，連接構建重組質粒pSET4s-sly-del353、pSET4s-sly。連接完成后的質粒轉化到大腸桿 菌中，提取質粒酶切鑒定，酶切后目的基因條帶與預期大小一致，說明目的基因已連接到載 體中（圖4)。質粒均進行測序，與目標序列保持一致，說明質粒構建成功，且未發生突變。
[0103] (5)pSET4s-sly點突變:使用353位點點突變的引物擴增已經構建成功的pSET4s-sly質粒全長，大約為5.7Kb，使用DpnI消化后轉入到大腸桿菌中，提取質粒酶切鑒定正確后 送測序，測序顯示353位點完成突變，由原來的CCA序列突變為TTA(圖5)，將質粒命名為 pSET4s-sly-P353L。
[0104] 進一步地，所述步驟3)中，上游同源臂PCR產物和下游同源臂PCR產物的PCR條件：
[0105] PCR反應體系：
[0112] PCR反應條件：
[0119] 再進一步地，所述步驟5)中，酶切條件：
[0120] 酶切體系
[0128] 二、豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變菌株的篩選與鑒定
[0129] 1.溶血素部分基因含溶血活性關鍵位點的缺失突變體的構建
[0130] (1)使用豬鏈球菌2型野生株SC-19制作電轉感受態細胞。
[0131] (2)電轉：小量提取的自殺性質粒pSET4S-Sly-del353以終量為Iyg的量加入到感 受態細胞，在2500V、500 Ω和25yF的條件下進行電轉，再加入0.5ml含有血清的TSB在28度進 行復蘇2小時，后涂布于含有IOOygAil壯觀霉素（SPC)的TSA平板上，平板放置在28度24小 時。挑取平板上長出的單菌落，使用SLY-SacI-Ll、SLY-BamHI-R2按照質粒構建4)中的PCR體 系及反應條件擴增，產物電泳鑒定可見800bp的條帶說明電轉成功。
[0132] (3)誘導單交換：電轉成功的單菌落接入到含有SPC抗性的TSB培養基中，于37度生 長12小時，此過程中會加速質粒與細菌基因組發生一次單交換，將發生單交換的菌劃線于 SPC的平板，放于37度培養，純化發生單交換的菌株。
[0133] (4)誘導雙交換:隨后將單交換單菌落，挑取于TSB液體培養基中，在28度不加抗性 連續傳代三次，此過程會發生第二次重組交換，并使得質粒通過重組作用，從細菌基因組上 脫落并丟失。
[0134] (5)篩選缺失突變體:將完成雙交換的菌稀釋后均勻涂布于無抗性的TSA平板上， 此時要獲取盡可能多的單菌落。將這些單菌落，同時在有和無壯觀霉素抗性的TSA平板上劃 線，挑取在壯觀霉素抗性條件下無法生長、在無抗性平皿上生長良好的單菌落進行PCR鑒 定。PCR使用引物仍為SLY-SacI-Ll、SLY-BamHI-R2，PCR反應體系及條件如質粒構建中的4)。 PCR產物中有且僅有一條800bp條帶的菌株為目的菌株。如若為1200bp，則為回復突變菌株。 如若既有800bp的條帶，又有1200bp的條帶，則仍為單交換菌株(圖6)。
[0135] (6)鑒定基因缺失株:將該單菌落擴增培養純化保菌后，再以該菌株為模版，使用 全長擴增引物SLY-SacI-Ll、SLY-BamHI-R2擴增，將獲得的片段測序，測序結果反應該菌株 成功缺失了溶血素包括353位氨基酸位點的基因片段。根據western和溶血實驗的結果顯 示，該溶血素部分基因缺失株已經不能分泌溶血素蛋白也不具有溶血活性（圖10)。以上說 明獲得溶血素基因堿基序列從l〇53bp到1393bp包含353位氨基酸位點的缺失突變體DEL (353)-SC-19〇
[0136] 2.溶血素溶血活性突變體的構建
[0137] (1)將DEL(353)-SC_19制作成為點轉化感受態細胞。
[0138] (2)電轉:小量提取的自殺性質粒pSET4s-sly-P353L以終量為Iyg的量加入到感受 態細胞，在2500V、500 Ω和25yF的條件下進行電轉，再加入0.5ml含有血清的TSB在28度進行 復蘇2小時，后涂布于含有lOOμg/ml壯觀霉素（SPC)的TSA平板上，平板放置在28度24小時。 挑取平板上長出的單菌落，使用SLY-SacI-Ll、SLY-BamHI-R2按照質粒構建4)中的PCR體系 及反應條件擴增，產物電泳鑒定可見1200bp的條帶說明電轉成功。
[0139] (3)誘導單交換：電轉成功的單菌落接入到含有SPC抗性的TSB培養基中，于37度生 長12小時，此過程中會加速質粒與細菌基因組發生一次單交換，將發生單交換的菌劃線于 SPC的平板，放于37度培養，純化發生單交換的菌株。
[0140] (4)誘導雙交換:隨后將單交換單菌落，挑取于TSB液體培養基中，在28度不加抗性 連續傳代三次，此過程會發生第二次重組交換，并使得質粒通過重組作用，從細菌基因組上 脫落并丟失。
[0141] (5)篩選缺失突變體:將完成雙交換的菌稀釋后均勻涂布于無抗性的TSA平板上， 此時要獲取盡可能多的單菌落。將這些單菌落，同時在有和無壯觀霉素抗性的TSA平板上劃 線，挑取在壯觀霉素抗性條件下無法生長、在無抗性平皿上生長良好的單菌落進行PCR鑒 定。PCR使用引物仍為SLY-SacI-Ll、SLY-BamHI-R2，PCR反應體系及條件如質粒構建中的4)。 PCR產物中有且僅有一條1200bp條帶的菌株為目的菌株。如若為800bp，則為回復突變菌株。 如若既有1200bp的條帶，又有800bp的條帶，則仍為單交換菌株(圖6)。
[0142] (6)鑒定基因缺失株:將該單菌落擴增培養純化保菌后，再以該菌株為模版，使用 全長擴增引物SLY-SacI-Ll、SLY-BamHI-R2擴增，將獲得的1200bp片段測序，測序結果反應 該菌株溶血素基因的l〇56bp至1059bp由CCA突變為TTA，該菌株命名為mSly(P353L)-SC-19。 如若根據密碼子規則翻譯為蛋白質，353位氨基酸從P變為L。（圖8)。
[0143] 三、豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變株mSly(P353L)-SC-19生物學特性分析
[0144] 3.1遺傳穩定性分析
[0145] 將純化后的突變體mSly(P353L)-SC-19在含有5%的新生牛血清的TSA平皿上連續 傳代，連續傳代15次，每間隔5次使用引物:LY-SacI-Ll、SLY-BamHI-R2進行菌落PCR，結果均 只能獲得1.2Kb左右的片段，且將擴增的片段切下后使用下游引物測序，測序的結果顯示， 即使在傳代15次后，353位仍是目的突變，證實該細菌是單一的且是遺傳穩定的。
[0146] 3.2生長曲線測定
[0147] 分別從過夜培養的新鮮平板上挑取野生菌SC-19和突變菌株mSly(P353L)-SC-19 的單菌落于5mlTSB(含5%的血清）后放置在37度160轉搖晃培養12小時，且設置空白對照。 在培養過程中，每隔一個小時從各組中取出1〇〇μ1測定在0D600的光吸收值，繪制生長曲線。 實驗重復三次，可觀察到野生株和突變體生長速度沒有顯著的差別，表明溶血素基因353位 由CCA突變為TTA不影響豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變株mSly(P353L)-SC-19的生長（圖 9) 〇
[0148] 3.3溶血活性測定
[0149] 穩定傳代后的溶血素溶血活性突變體mSly(P353L)-SC-19和野生菌株SC-19于37 度培養過夜后，5000轉離心5分鐘后，使用無血清的培養基重懸細菌后，以1:10的比例接種 于無血清的1640培養基中，37度生長12小時，1000 Og離心10分鐘后，上清過濾除菌后用生理 鹽水等體積梯度稀釋，同時設置生理鹽水對照，再取1〇〇μ1的1 %紅細胞，37度放置2小時，4 度過夜，使為溶解的紅細胞完全沉淀。使用掃描儀將紅細胞沉淀情況記錄(圖10)。從結果可 以判斷，mSly(P353L)-SC-19已經喪失溶解紅細胞的能力。隨后取第一孔的100μΙ上清于新 的96孔板中，在540nm波長下測定吸光值，吸光值越高，說明紅細胞裂解越明顯。從結果可 知，野生菌SC-19吸光值為0。54,明顯高于對照組，而mSly(P353L)-SC-19實驗組上清與對照 上清吸光值無明顯差別，可判斷即使在長時間下，喪失溶血活性的mSly(P353L)-SC-19培養 上清不能裂解紅細胞(表1)。
[0150] 表1溶血實驗上清吸光值測定表
[0152] 注:NC為空白對照、SC-19為野生菌株、mSly(P353L)-SC-19為溶血素溶血活性突變 體。
[0153] 3.4溶血素溶血活性突變體分泌溶血素蛋白情況的鑒定
[0154] 將SC-19、實驗室保存溶血素全長片段的缺失株Asly-SC_19(缺失溶血素全長基 因的突變菌株），DEL(353)-SC-19及mSly(P353L)-SC-19按照3.3中方法培養處理后，取出 Iml的培養上清用丙酮沉淀后，再將沉淀的蛋白進行Page膠電泳，western分析證實這兩株 菌均能分泌溶血素蛋白，說明在突變體構建過程中未造成溶血素表達失活，從側面反應構 建的溶血素溶血活性突變體能表達溶血素蛋白，但是溶血素蛋白的溶血活性喪失，達到預 期目標(圖11)。
[0155] 3.5細胞毒性測定
[0156] 溶血素又叫穿孔毒素，是一種使細胞發生溶解的毒素，具有細胞毒性。根據目前的 研究報道，溶血素的蛋白的三維結構已解析，而且證明溶血素蛋白的353位氨基酸是溶血素 發生溶血作用的關鍵位點。如果將353位突變，由P變為L后鏈球菌2型強毒株SC-19對于細胞 的毒性是否降低。在本實驗中，通過LDH檢測試劑盒檢測乳酸脫氫酶釋放量來評價野生株和 溶血素溶血活性突變株的細胞毒性。按照MOI = 10在小鼠的巨噬細胞RAW和人的急性單核細 胞的白血病細胞株THPl的培養基中分別加入野生菌和突變體，同時設置乳酸脫氫酶釋放的 陽性和陰性對照。THPl細胞在2小時、RAW細胞在6小時后收集培養上清進行檢測，結果顯示， 在THPl細胞中，細胞壞死程度和陽性對照(對照孔中細胞加入裂解劑，細胞全部發生壞死） 差別不大，在RAW細胞中，超過70%的細胞發生壞死，證實野生株具有十分明顯的細胞毒性； 而溶血素突變體基本喪失溶血活性，對兩種細胞基本沒有毒性，與陰性對照沒有明顯差別 (圖12)。同時也說明了該試驗條件下，豬鏈球菌2型的細胞毒性主要取決于溶血素蛋白且依 賴于溶血素蛋白的溶血活性依賴于溶血活性關鍵位點353。
[0157] 實施例2
[0158] 豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變疫苗mSly(P353L)-SC-19的制備
[0159]從平板上挑取鑒定正確、生長特征正常、遺傳穩定且具有良好生物學活性的溶血 活性突變株或者野生菌株的單菌落接入到5ml的含有5%新生牛血清的TSB培養基中培養過 夜，再以1:100的比例接種到50ml的培養基中培養6個小時，5000轉離心5分鐘收集菌體，隨 后再加入PBS清洗一次，再次按照相同的條件收集菌體，PBS重懸。細菌倍比稀釋涂布TSA平 板計數。
[0160] 實施例3
[0161] 動物實驗
[0162] 1安全性實驗
[0163] 隨機將小鼠分為9組。為確定溶血素溶血活性突變株的免疫安全劑量，將四中收集 的菌液按照8*I0-7、8*KT8、8*I0-9CFU的劑量注射到小鼠腹腔中，同時設置野生株SC-19同 等劑量的攻毒實驗，觀察小鼠的致死情況。結果可發現溶血素突變株在在8*10~7、8*10~ 8CFU攻毒劑量下小鼠均存活，8*10~7CFU攻毒劑量時突變組有一只小鼠出現輕微的精神沉 郁，在8* 1 0- 8CFU時有3只小鼠的被毛出現粗亂的現象，8* 1 0- 9CFU時小鼠有60 %出現死亡， 而野生組小鼠在8*10~7CFU攻毒劑量下時有1只小鼠死亡，而在8*10~8CFU死亡9只、8*10~ 9CFU全部死亡，而且死亡時間非常迅速（圖13)。證實相比野生菌株，溶血素突變體的毒力下 降，而且，在低劑量范圍內，對小鼠無強毒性。
[0164] 2小鼠的免疫和抗體檢測
[0165] 將30只小鼠隨機分為3組，一組免疫豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變疫苗mSly (P353L)-SC-19,注射菌量為另外一組注射等量的I3BS，每組腹腔注射0.2ml，另外一組不做 處理，為空白對照。在免疫1周和2周后分別對小鼠進行斷尾采血，使用原核表達的溶血素蛋 白包被ELI SA板，采用間接ELI SA的方法測定免疫后特異性的溶血素抗體的水平，結果顯示， 在免疫一周后，小鼠體內溶血素抗體水平與對照組相比僅有3只小鼠的血清可判斷為陽性， 無顯著性的差別；而在免疫豬鏈球菌2型溶血素溶血活性突變疫苗mSly(P353L)-SC-19兩周 后，如圖11，免疫后小鼠體內溶血素抗體效價顯著上升，所有溶血素抗體均呈現較高水平， 非免疫對照組和空白對照組均為陰性。
[0166] 3保護力實驗
[0167] 免疫后第15天，免疫攻毒組和非免疫攻毒組小鼠都腹腔注射細菌10*10~8的豬鏈 球菌2型野生株SC-19,對照組不作處理。一天后非免疫組小鼠只剩下一只，而免疫組小鼠全 部存活。兩天后非免疫組小鼠全部死亡，而免疫組小鼠均存活，且精神狀態明顯好轉（如圖 14)〇
[0168] 說明溶血素突變體mSly(P353L)-SC-19對豬鏈球菌II型強毒株SC-19有很好的保 護作用。可以作為備選疫苗使用。
[0169] 其它未詳細說明的部分均為現有技術。盡管上述實施例對本發明做出了詳盡的描 述，但它僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據本實施例在不經 創造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬于本發明保護范圍。
【主權項】
1. 一種豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株，其特征在于：所述突變株命名為 streptococcus suis type 2mSly(P353L)-SC-19,其保藏編號為：CCTCC Μ 2016077。2. 根據權利要求1所述豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株，其特征在于:所述突 變株中溶血素基因堿基序列上l〇56bp至1059bp的基因序列為TTA。3. -種權利要求1所述豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株構建方法，其特征在 于:包括以下步驟： 1) 以豬鏈球菌2型05ZYH33株全基因組為模板，設計三個引物對，分別為 a. 上游同源臂正反向引物： SLY-SacI-L1:ACCATTAGAGCTCAATTTTGATGCCGTG， SLY(P353L)-R1： TCTCCACCACTCAAATAAATTGAGTTTTCCG； b. 下游同源臂正反向引物： SLY(P353L)-L2:GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC， SLY-BamHI-R2： GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC； c. 353位點點突變的引物： SLY-P353L-L：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC, SLY-P353L-R： GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC； 2) 從豬鏈球菌II型中野生菌株SC-19中提取細菌基因組； 3) 以細菌基因組為模板，用上述上游同源臂正反向引物對和下游同源臂正反向引物對 進行PCR，純化回收得到上游同源臂PCR產物和下游同源臂PCR產物，將上游同源臂PCR產物 和下游同源臂PCR產物進行融合PCR，得到融合產物sly-del353; 4) 以細菌基因組為模板，用上游同源臂的正向引物SLY-SacI-Ll和下游同源臂的反向 弓丨物SLY-BamHI-R2擴增基因組全長基因片段sly;; 5) 用SacI和BamHI將融合產物sly-del353、基因組全長基因片段sly和載體pSETAi^^^lJ 進行雙酶切，得到線性化的融合產物sly-del353、線性化的基因組全長基因片段sly和線性 化的載體pSET4s; 6) 將線性化的融合產物sly-del353和線性化的基因組全長基因片段sly分別與線性化 的載體pSET4s連接，得到兩個重組質粒，命名為pSET4s-sly-del353和pSET4s-sly; 7) 以pSET4s-sly為模板，用353位點點突變的引物對進行PCR，得到質粒pSET4s-sly-P353L； 8) 將豬鏈球菌II型中野生菌株SC-19制作電轉感受態細胞SC-19,將步驟6)中得到的重 組質粒pSET4s-sly-d e1353加入到感受態細胞SC-19中進行電轉，復蘇后涂布得到平板上培 養，得到單菌落； 9) 將步驟8)單菌落利用溫度和抗性誘導質粒和基因組發生重組交換，篩選和PCR檢測 得到缺失突變體DEL(353)-SC-19; 10) 將缺失突變體DEL(353)-SC-19制作電轉感受態細胞DEL(353)-SC-19,將步驟6)中 得到的pSET4s-sly-P353L質粒加入到感受態細胞SC-19中，利用溫度和抗性誘導質粒和細 菌基因組發生重組交換獲得雙交換菌株，篩選和PCR檢測得到豬鏈球菌2型溶血素溶血活性 基因突變株streptococcus suis type 2mSly(P353L)-SC_19〇4. 根據權利要求3所述豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株構建方法，其特征在 于:所述步驟3)中，上游同源臂PCR產物和下游同源臂PCR產物的PCR條件： PCR反應體系：5. 根據權利要求4所述豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株構建方法，其特征在 于:所述步驟3)中，融合PCR的條件， PCR反應體系：6.根據權利要求3所述豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株構建方法，其特征在 于:所述步驟4)中，PCR的條件 PCR反應體系：PCR反應條件：7.根據權利要求3所述豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株構建方法，其特征在 于:所述步驟5)中，酶切條件： 酶切體系在溫度為37°C條件下保溫3~12h; 所述步驟7)中，PCR的條件 PCR反應體系：PCR反應條件：8. -種權利要求1所述豬鏈球菌2型溶血素溶血活性基因突變株在制備防治豬鏈球菌 病的疫苗中應用。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述制備防治豬鏈球菌病的疫苗的方法： 將突變株放置于含有5%新生牛血清的TSB液體培養基中培養，離心收集菌體，PBS清洗菌 體，然后向菌體中加入PBS，即得到疫苗，其中，每毫升中突變株的數量為2~8*10~7。10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于：所述TSB培養基的：稱取Tryptic Soy Broth粉劑30g溶解于1L的單蒸水中，121度滅菌20分鐘后備用。
【文檔編號】A61P31/04GK105861407SQ201610321082
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月16日
【發明人】張安定, 林嵐, 呂偉華, 李文珂, 徐磊
【申請人】華中農業大學